農(nóng)業(yè)部2406號公告-8-2016 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測 人乳鐵蛋白基因（hLTF）定性PCR方法

農(nóng)業(yè)部2406號公告一8-2016中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布I11范圍農(nóng)業(yè)部2031號公告—14—2013轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測普通牛(Bostaurus)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測豬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測羊內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法農(nóng)業(yè)部2406號公告—7—20164原理2農(nóng)業(yè)部2406號公告—8—20165.51mol/L三羥甲基氨基甲烷一鹽酸溶液(pH8.0):稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用鹽酸(HCl)調(diào)pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌205.6TE緩沖液(pH8.0):分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷—鹽酸溶液和2mL乙二銨四乙酸二鈉溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。5.750×TAE緩沖液：稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入100mL乙二銨四乙酸二鈉溶液，用冰乙酸調(diào)pH至8.0,然后加水定容到1000mL。使用時(shí)，用水稀釋5.8加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍(lán)，加入10mL水，在室溫下溶解12h;稱取250.0mg二甲基苯腈藍(lán)，加10mL水溶解；稱取50.0g蔗糖，加30mL水溶解?；旌弦陨?種溶液，加水定容至100mL,在4℃下保存。5.9DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：可清楚地區(qū)分100bp~1000bp的DNA片段5.10dNTPs混合溶液：將濃度為)mmolL的dAIP、dTTP、GTP、lcrP4種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合。5.11TagDNA聚合酶正向引物hLTF-F:5/-GGCTGTGGTGAAGAAGGG/預(yù)期擴(kuò)增片段大小154bp(參見附錄A)5.14內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因引物，根據(jù)樣品來源選擇對應(yīng)的牛內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因(見農(nóng)業(yè)部2031號公告—14—2013)、羊內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因(見農(nóng)業(yè)部2122號公告=2—2014),豬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因(見農(nóng)業(yè)部2122號公告—1-2014),確定檢測引物。5.15引物溶液：用TE緩沖液或水分別將引物稀釋到10jmol/L。5.16石蠟油。5.19PCR產(chǎn)物回收試劑盒6主要儀器和設(shè)備6.2渦旋微型離心機(jī)：最大相對離心力2000g6.4PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度>1.5℃/s,孔間溫度差異<1.0℃。6.6凝膠成像系統(tǒng)。7.1.1DNA模板制備采用農(nóng)業(yè)部2406號公告—7—2016的方法，測定并記錄DNA在260nm和280nm的吸光度。將DNA適當(dāng)稀釋或濃縮，使其OD?s值在0.1～0.8的區(qū)間內(nèi)。以1個(gè)OD??o值相當(dāng)于3農(nóng)業(yè)部2406號公告—8—201650ng/pμLDNA濃度來計(jì)算純化DNA的濃度，并進(jìn)行DNA凝膠電泳檢測DNA完整性。DNA溶液7.2.1.1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PCR擴(kuò)增7.2.1.2基因特異性序列PCR擴(kuò)增7.2.1.2.1每個(gè)試樣PCR擴(kuò)增設(shè)置3次平行。能的PCR儀可不加)。也可采用經(jīng)驗(yàn)證的終濃度水0.5L聚合酶g41NA模板0.1%～1.0%的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組DNA作為陽性對照；以水作為空白對照。加入凝膠點(diǎn)樣孔，同時(shí)在其中一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。接通電源在2V/cm~5V/cm條件下電泳15min～20min,再用凝膠成像系統(tǒng)檢測。4