分子腫瘤概論研究生學(xué)生課件

同學(xué)們好！

分子腫瘤概論

重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室

王婭蘭教授(博士生導(dǎo)師)

分子腫瘤概論一、有關(guān)腫瘤的根本概念〔復(fù)習(xí)〕腫瘤〔tumor,neoplasm)基因水平調(diào)控失常異常增生新生物腫瘤生物學(xué)行為浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力浸潤(rùn)(invasion)：起源處遷移侵入周圍鄰近組織轉(zhuǎn)移(metastasis)：從原發(fā)部位血管、淋巴管、體腔它處繼續(xù)生長(zhǎng)與原發(fā)瘤同樣類型腫瘤〔轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤〕轉(zhuǎn)移的途徑〔2〕Hematogenenousmetastasis全身臟器〔3〕Transcoelomicmetastasis體腔內(nèi)臟器脫落種植〔醫(yī)源性種植〕

浸潤(rùn)生長(zhǎng)惡性腫瘤生長(zhǎng)的特點(diǎn)腫瘤轉(zhuǎn)移過程必經(jīng)的第一步腫瘤的組織結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)〔parenchyma)間質(zhì)〔mesenchyma,stroma)腫瘤間質(zhì)的主要成分1.血管小血管毛細(xì)血管血竇樣血管球樣

新的腫瘤血供模式血管生成擬態(tài)(vasculogenicmimicry，VM)1999年，美國(guó)學(xué)者M(jìn)aniotis等一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式小管狀〔似血管〕管壁主要由基底膜(PAS陽(yáng)性)圍成，外襯以腫瘤細(xì)胞腔內(nèi)有血漿和紅細(xì)胞流動(dòng)管道與內(nèi)皮性血管相通多存在于高度惡性腫瘤血管生成擬態(tài)〔vasculogenicmimicry〕腫瘤細(xì)胞構(gòu)成有基底膜小管狀〔似血管〕與血管交通2.結(jié)締組織間質(zhì)〔1〕纖維和基質(zhì)膠原纖維常規(guī)HE紅特殊化學(xué)染色VG改進(jìn)法紅Masson蘭色構(gòu)成成分IIIIII型膠原原纖維又由相應(yīng)原纖維分子構(gòu)成免疫組化或分子生物學(xué)方法可區(qū)別彈力纖維

常規(guī)

HE淡紅色

特殊化學(xué)染色

Weigert或Verhceff暗蘭或黑色，彈力酶消化后陰性

網(wǎng)狀纖維

銀染黑色，故也稱嗜銀纖維。

PAS強(qiáng)陽(yáng)性

成分膠原蛋白為主要成分細(xì)胞間質(zhì)網(wǎng)狀纖維Ⅲ型膠原蛋白基底膜網(wǎng)狀纖維Ⅳ型膠原蛋白和層黏連蛋白〔laminin〕纖維黏連蛋白Fibronectin〔FN〕作用A.連接基質(zhì)中各種成分B.介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)成分與細(xì)胞外表連接黏蛋白又稱蛋白多糖〔proteoglycan〕如透明質(zhì)酸，硫酸肝素等骨黏素〔osteonectin〕〔2〕基底膜(basementmembrane,BM)多種成分與疾病〔腫瘤浸潤(rùn)〕關(guān)系密切Ⅳ型膠原不形成纖維，與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原不同層黏連蛋白〔laminin,LM〕有與細(xì)胞膜LM受體相結(jié)合的位點(diǎn)〔3〕細(xì)胞成分固有的細(xì)胞成分纖維母細(xì)胞和纖維細(xì)胞肌纖維母細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞反響性細(xì)胞成分各種細(xì)胞浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞最常見漿細(xì)胞巨噬細(xì)胞都屬免疫活性細(xì)胞二、腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制〔一〕腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移1.腫瘤細(xì)胞增殖和擴(kuò)展浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的前提和根底2.腫瘤血管生成(tumorangiogenesis)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的必要條件3.腫瘤細(xì)胞別離脫落，與細(xì)胞外基質(zhì)黏附〔1〕瘤細(xì)胞外表負(fù)電荷增加〔2〕瘤細(xì)胞黏附力的改變①瘤細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)異常②瘤細(xì)胞同質(zhì)黏附力下降指同種瘤細(xì)胞之間的黏附力③瘤細(xì)胞異質(zhì)黏附力增加指腫瘤細(xì)胞與其它不同細(xì)胞及間質(zhì)的黏附力同質(zhì)黏附力降低，有利于腫瘤細(xì)胞別離；異質(zhì)黏附力的增加，有利于瘤細(xì)胞與基底膜、間質(zhì)成分粘附并穿過這些組織均由黏附分子介導(dǎo)通過配-受體之間的識(shí)別和結(jié)合實(shí)現(xiàn)

〔3〕腫瘤黏附分子(adhesionmolecules)細(xì)胞外表結(jié)構(gòu)①鈣黏蛋白(cadherin)又稱為鈣連接素，鈣黏素。依賴細(xì)胞外鈣介導(dǎo)鈣離子依賴性細(xì)胞與細(xì)胞〔同源細(xì)胞〕的黏附據(jù)分布不同E-鈣黏蛋白P-鈣黏蛋白N-鈣黏蛋白H-cad②整合素(integrin)細(xì)胞外表糖蛋白，約有20多個(gè)亞型各種腫瘤細(xì)胞外表整合素種類不同腫瘤生長(zhǎng)各個(gè)階段表達(dá)水平也不同作用a.介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附b.參與不同細(xì)胞之間的黏附連接C.扮演細(xì)胞信號(hào)傳遞的角色配體-整合素-細(xì)胞骨架蛋白跨膜信息傳導(dǎo)系統(tǒng)③免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulinsuperfamily)主要參與細(xì)胞與細(xì)胞間的連接ICAM-1〔細(xì)胞間黏附分子-1〕VCAM-1〔血管黏附因子〕NCAM〔神經(jīng)細(xì)胞黏附因子〕其它包括CEA、DCC④選擇素(selectin)內(nèi)源性植物凝血素〔凝集素〕作用介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、血小板與瘤細(xì)胞黏附選擇素家族包括：P-selectinE-selectinL-selectin⑤CD44及其它CD44(透明質(zhì)酸受體)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附路易斯寡糖〔SLEX，,s-LewisX〕血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素的配體

4.瘤細(xì)胞的遷移(migration)及化學(xué)趨向性

(1)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)

黏附；肌動(dòng)蛋白、微管、中間絲

(2)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)據(jù)其作用，大致可分為兩大類：僅影響運(yùn)動(dòng)的因子遷移刺激因子〔MSF〕既影響運(yùn)動(dòng)又影響生長(zhǎng)的因子AMF(自分泌運(yùn)動(dòng)因子)HGF/SF〔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/分散因子)

(3)瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性

21KD的蛋白質(zhì)骨吸收因子

5.細(xì)胞外基質(zhì)的降解(1)腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞外基質(zhì)的步驟

Liotta1986年提出第一步黏附于基底膜或其他間質(zhì)成分第二步分泌蛋白酶并激活,降解瘤細(xì)胞鄰近的細(xì)胞外基質(zhì)第三步進(jìn)入受蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域內(nèi)

(2)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白水解酶①絲氨酸蛋白酶類及其抑制因子纖維蛋白溶解酶(纖溶酶)

纖溶酶原

a.降解基質(zhì)如纖維蛋白，F(xiàn)N,LM,蛋白多糖

b.激活膠原酶膠原降解尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-typeplasminogenactivator,u-PA〕系統(tǒng)A．u-PA：介導(dǎo)細(xì)胞周圍基質(zhì)蛋白的降解B．u-PA受體〔u-PAR〕及纖溶酶原受體

活化u-PA原酶形式的u-PA纖溶酶原+纖溶酶原受體纖溶酶C．PAI〔PA抑制劑〕PAI1是u-PA的主要抑制劑PAI2不同腫瘤表達(dá)意義不一PAI3功能不清②基質(zhì)金屬蛋白酶〔matrixmetalloproteinases,MMP〕及其抑制因子需鈣、鋅離子作輔助因子MMP分類膠原酶：如間質(zhì)膠原酶〔Collagenase〕明膠酶：如明膠酶A(gelatinaseA)間質(zhì)溶素：如間質(zhì)溶素1、2膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：Ⅰ、Ⅱ型可分別降解ECM中各種不同成分ECM降解的主要蛋白水解酶類金屬蛋白酶抑制物TIMP-1，TIMP-2浸潤(rùn)與否取決于MMP與TIMP的比照MMP>>TIMPECM降解才能成為可能③胱氨酸蛋白酶類CathepsinB作用降解ECM中各種膠原、LM、FN、黏蛋白激活間質(zhì)膠原酶和IV型膠原酶④天〔門〕冬氨酸蛋白酶cathepsinD,E在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用CD表達(dá)的調(diào)節(jié)6.瘤細(xì)胞以主動(dòng)方式入循環(huán)管道并形成栓子

微小淋巴管、微小靜脈壁縫隙血管基底膜缺損瘤細(xì)胞存在形式

單個(gè)成團(tuán)同類癌栓異類癌栓黏附分子對(duì)其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用

7.在特定器官的毛細(xì)血管滯留并黏著，再次穿過血管壁并定居、增殖器官特異性〔選擇性〕機(jī)制(1)黏附分子的作用(2)化學(xué)趨化因子〔歸巢現(xiàn)象)(3)微環(huán)境不適合(4)與免疫狀態(tài)有關(guān)〔二〕機(jī)體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞主要有NK細(xì)胞巨噬細(xì)胞T淋巴細(xì)胞〔三〕腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因轉(zhuǎn)移相關(guān)基因指基因的表達(dá)和改變能夠促進(jìn)或?qū)е履[瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的基因

〔四〕腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)與遺傳學(xué)(genetic)相對(duì)應(yīng)的概念表型狀態(tài)改變，基因型不改變沒有DNA序列變化的情況下，可遺傳的基因表達(dá)改變，導(dǎo)致的基因產(chǎn)物的變化。1942年提出，上世紀(jì)80年代后期逐漸興起的一門新學(xué)科DNA的“后天性〞修飾CpG島高甲基化癌細(xì)胞基因組低甲基化組蛋白殘基的各種修飾磷酸化乙?；谆核鼗鹊取参濉衬[瘤干細(xì)胞(tumorstemcell,TSC)2001年由Reya等提出2006年美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)〔AACR〕定義存在于腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞

特征

(1)無限增殖和多向分化

(2)存在自我更新的信號(hào)傳導(dǎo)途徑

(3)具不同表型，異質(zhì)性，對(duì)放化療不敏感

(4)具有端粒酶活性

(5)能轉(zhuǎn)移到各種不同的組織〔六〕腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞所分泌的活性介質(zhì)〔細(xì)胞因子〕共同構(gòu)成的局部?jī)?nèi)環(huán)境微環(huán)境改變腫瘤細(xì)胞自分泌和旁分泌全身和局部組織代謝、分泌、免疫結(jié)果：限制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和開展

抗體標(biāo)記抗原標(biāo)記抗體細(xì)胞細(xì)胞抗體標(biāo)記抗原標(biāo)記細(xì)胞〔二〕蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)方法1.酵母雙雜交法驗(yàn)證兩個(gè)蛋白的相互作用篩選與蛋白作用的未知蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，酵母雙雜交的原理是將2個(gè)目的蛋白分別與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)〔transcriptionactivationdomain，AD〕和DNA結(jié)合區(qū)〔DNA-bindingdomain，DBD〕融合產(chǎn)生新的融合蛋白，如果這2個(gè)目的蛋白能夠互相作用，那么該相互作用會(huì)促使AD和DBD互相靠近而產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活事先構(gòu)建到酵母基因組中的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄?！舱婧宿D(zhuǎn)錄因子DBD能把蛋白定位到基因組特定DNA序列上，AD能夠使轉(zhuǎn)錄裝置激活基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)這兩個(gè)區(qū)域單獨(dú)存在時(shí)均沒有轉(zhuǎn)錄激活功能，但當(dāng)它們?cè)诳臻g上彼此聯(lián)系時(shí)，那么能夠激活基因轉(zhuǎn)錄?！尘窒扌寓烹p雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)⑵酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問題是“假陽(yáng)性〞2.免疫共沉淀〔Co-Immunoprecipitation，CO-IP〕是以抗體和抗原之間的專一性作用為根底的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的常用、經(jīng)典方法。其根本原理是:細(xì)胞裂解液中參加抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS及Westernblotting分析。缺點(diǎn)免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通過第三者間接相互作用的蛋白靈敏度不及蛋白親和色譜高必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，假設(shè)預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性假陽(yáng)性的概率比較高設(shè)置的對(duì)照包括：在對(duì)照組中使用對(duì)照抗體，以缺失目的蛋白的細(xì)胞系作為陰性對(duì)照等等。3.GST沉淀實(shí)驗(yàn)〔GST-pulldown實(shí)驗(yàn)〕主要是用來證明細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用利用GST(Glutathione-S-transferase，GST)和谷胱甘肽親和樹脂之間的高親和性將GST固化在樹脂上GST和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白在細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞等體系中融合表達(dá)固化的誘餌蛋白【即誘餌蛋白(Baitprotein)】可以捕獲細(xì)胞裂解物中的互作用靶蛋白洗脫結(jié)合物后通過westernblot檢測(cè)誘餌蛋白和靶蛋白,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白4.Far-Westernblotting在經(jīng)典Far-Western印跡中，運(yùn)用經(jīng)標(biāo)記的或可被抗體檢測(cè)的“誘餌〞蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)移膜上的“獵物〞靶蛋白。用SDS或非變性PAGE別離含有未知靶蛋白的樣品〔通常為細(xì)菌裂解液〕然后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后與誘餌蛋白孵育，運(yùn)