特殊染色技術(shù)（病理檢驗(yàn)技術(shù)課件）

病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色結(jié)締組織和肌纖維

彈性纖維彈性纖維(elastiefiber)廣泛分布于身體各處,特別在動(dòng)脈壁、肺泡壁和皮膚最為豐富新鮮時(shí)黃色,折光性強(qiáng),有時(shí)呈單條出現(xiàn),如見于真皮；有時(shí)呈膜樣結(jié)構(gòu),如見于大動(dòng)脈壁在疏松組織內(nèi),彈性纖維比膠原纖維細(xì),直徑約0.2~1um,纖維分支,交織成網(wǎng),彈性纖維由兩種成分組成,即集合成束的彈性微原纖維和均質(zhì)的彈性蛋白,彈性微原纖維浸沒于彈性蛋白中構(gòu)成彈性纖維。

彈性纖維具有一定的彈性，容易拉長，外力消除后能迅速復(fù)原，如動(dòng)脈壁和肺泡壁的彈性纖維對(duì)保動(dòng)脈和的彈性起重要作用。對(duì)沸水、弱酸和堿有一定的抵抗力，但可被胃液、胰液消化。彈性纖維系統(tǒng)是由耐酸纖維，前彈性纖維和彈性纖維三種構(gòu)成。這三種纖維分布、走向和組化成分均有不同，如用醛品紅法或間苯二酚堿性品紅法,染色前不經(jīng)氧化,耐酸纖維就染得淺淡,不夠清晰。如用酸化高錳酸鉀進(jìn)行強(qiáng)氧化后用以上兩法染色,則可把這三種纖維清晰顯示。如在皮膚,耐酸纖維位于真皮乳頭淺層,呈分叉狀與表皮基膜連接,纖維較纖細(xì),染色較淺;前彈性纖維位于真皮淺網(wǎng)狀層,其上與耐酸纖維相連，下與真皮深層的彈性纖維相接,其走向與皮膚表面傾斜,纖維略粗,染色較深；彈性纖維位于真皮深層,與表面平行走向,纖維粗大且致密,染色最深。常用的彈性纖維染色有醛品紅法、間苯二酚堿性品紅法、地衣紅法、鐵碘蘇木精法、維多利亞藍(lán)法(Tanaka)、苔黑酚新品紅法(Fullmer-Lillie)、稀釋間苯二酚堿性品紅法(Hart)等常用的是前三種方法。5.醛品紅液

堿性品紅(basicfuchsin)0.5g70%的乙醇100ml

濃鹽酸(hydrochloricacid)1ml

三聚乙醛(paraldehyde)1ml取潔凈小口砂塞瓶,先把堿性品紅和70%的乙醇傾入使其溶解,然后加入濃鹽酸和三聚乙醛,加塞塞緊,輕輕搖動(dòng)使均勻混合,于室溫下置放2~3天,待轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙闯墒炜捎?。?℃的冰箱,約可保存6個(gè)月。醛品紅法

(根據(jù)Gomori)(一)試劑配制1.0.5%的高錳酸鉀(potassiumpermanganate)2.0.5%的硫酸(ulphuracid)3.酸化高錳酸鉀液0.5%的高錳酸鉀1份0.5%的硫酸1份臨用前混合后用,不能保存4.2%的草酸(oxalicacid)6.橙黃G液

橙黃G(orangeG)2g

蒸餾水100ml

磷鎢酸(phosphotungsticacid)5g混合后輕輕搖動(dòng)2分鐘,使盡量溶解,靜置一夜,吸上清液使用。(二)染色步驟1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。2.切片厚4um,常規(guī)脫蠟至水。3.酸化高錳酸鉀液氧化5分鐘。4.稍水洗。5.2%的草酸漂白1~2分鐘。6.流水沖洗2分鐘。7.70%的乙醇稍洗。8.醛品紅液浸染(加蓋)10分鐘。9.70%的乙醇浸洗2次,每次約30秒,至切片不再有紫色脫出。10.稍水洗。11.橙黃G液滴染約1秒。

12.稍水洗。

13.常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。(三)結(jié)果

彈性纖維呈紫色至深紫色,底色為不同程度的黃色。肥大細(xì)胞顆粒和黏液也呈紫色至深紫色病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色結(jié)締組織和肌纖維

肌纖維

肌纖維(musclefiber)是肌組織成分,由肌細(xì)胞組成。肌細(xì)胞一般細(xì)而長,根據(jù)肌細(xì)胞的形態(tài)和功能特點(diǎn),可分為平滑肌、骨骼肌和心肌三種。三者的胞質(zhì)中均含有沿細(xì)胞長軸排列的肌原纖維,但平滑肌的肌原纖維較不明顯。骨骼肌和心肌的肌纖維尚有明相橫線,平滑肌則不顯橫紋。

平滑肌纖維為梭形,直徑約為6um,長約20-500um，細(xì)胞核為長圓形，圓形，位于細(xì)胞的中部，平滑肌主要分布于胃腸道、呼吸道,泌尿生殖管道和血管壁等處；骨骼肌纖維一般為圓柱形，是多核細(xì)胞,核位于纖維邊緣，纖維直徑約10~100nm，長約為1-40mm，有橫紋，又稱橫紋肌。骨骼肌附于骨骼上，它受意志的支配，所以又稱隨意??；心肌(cardiacmuscle)纖維與骨骼肌纖維的結(jié)構(gòu)基本相同,但心肌纖維為短柱狀，有分支，并互相連接，核多為一個(gè)，位于纖維中部。顯示肌纖維常用的方法為苦味酸麗春紅s法和麗春紅酸性品紅-苯胺藍(lán)法(見本節(jié)“膠原纖維”),多用于肌源性或纖維源性腫瘤的鑒別診斷,也常用于顯示各種組織炎癥時(shí)的修復(fù)情況和纖維化的程度,磷鎢酸蘇木精法則多用于顯示橫紋肌的橫紋,應(yīng)用于橫紋肌肉瘤的診斷,鞣酸-偶氮熒光桃紅法也用于肌纖維染色。磷鎢酸蘇木精法

(根據(jù)Mallory）(-)試劑配制1.0.5%的高錳酸鉀2.0.5%的硫酸3.酸化高錳酸鉀液0.5%的高錳酸鉀1份0.5%的硫酸1份臨用前混合后用,不能保存。4.2%的草酸(maleacid)5.磷鎢酸蘇木精液

蘇木精0.1g

蒸餾水100ml

磷鎢酸(phosphotungsticacid)2g取潔凈三角燒瓶一只盛蒸餾水30ml,傾入蘇木精,稍加溫使蘇木精完全溶解。另取三角燒瓶盛蒸餾水70ml,加入磷鎢酸后輕輕搖動(dòng)使其完全溶解。待蘇木精液冷卻后與磷鎢酸液混合,加塞后置于光亮處,隔數(shù)天輕輕搖動(dòng)一次,待3-6個(gè)月成熟后才使用。(二)染色步驟1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。2.切片厚4um,常規(guī)脫蠟至水。3.酸化高錳酸鉀氧化5分鐘。4.稍水洗。5.2%草酸漂白1-2分鐘。6.流水沖洗2分鐘,用蒸餾水洗一次。7.磷鎢酸蘇木精染液浸染24~48小時(shí)。8.取出切片直接用95%的乙醇迅速洗去多余染液。9.常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。(三)結(jié)果橫紋肌的橫紋、纖維素、胞核、紅細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)纖維呈深藍(lán)色,膠原纖維、軟骨基質(zhì)呈棕紅色,粗的彈性纖維呈紫色。(四)應(yīng)用橫紋肌肉瘤的組織學(xué)形態(tài)變化多樣,與許多未分化的間胚葉腫瘤難以鑒別,如作磷鎢酸蘇木精液染色,在瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)有藍(lán)色的橫紋,則可提供證明腫瘤是呈橫紋肌分化。磷鎢酸蘇木精液又可染纖維素,如各種炎癥滲出的纖維素。對(duì)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的切片,用磷鎢酸蘇木精液染色可在毛細(xì)血管內(nèi)發(fā)現(xiàn)藍(lán)色的纖維素細(xì)絲。該染色法也常應(yīng)用于神經(jīng)病理方面如對(duì)膠質(zhì)瘤的研究等。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色結(jié)締組織和肌纖維

膠原纖維結(jié)締組織在廣義上包括多種組織成分,狹義上是指其含有的三種纖維,即膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈性纖維。這三種纖維廣泛分布于身體各處,常見于器官與器官之間,組織與組織之間以及細(xì)胞與細(xì)胞之間。這些纖維具有支持連接、營養(yǎng)、防御保護(hù)和創(chuàng)傷修復(fù)等功能。這三種纖維在蘇木精-伊紅(HE)染色中有時(shí)難以區(qū)別,特別是在某些病理改變時(shí)。因此在病理診斷上常常要借助于特殊染色進(jìn)行鑒別。

膠原纖維膠原纖維(

collagen

fiber)是三種纖維中分布最廣,含量最多的一種纖維。它廣泛分布于各臟器內(nèi)。在皮膚、鞏膜和肌腱最為豐富。膠原纖維具有韌性大、抗拉力強(qiáng)的特點(diǎn)。在弱酸或沸水中可慢慢溶化成膠水,稱為白明膠,所以這種纖維稱為膠原纖維。膠原纖維在新鮮時(shí)無色,粗細(xì)不等,直徑在1~12um之間,并有分支,互相交織成網(wǎng)。在電鏡下膠原纖維是由更細(xì)長的膠原原纖維集合成束而成。

已知膠原纖維又可分為十幾型,膠原分子呈棒狀,由三股同質(zhì)或異質(zhì)性螺旋形多肽鏈組成,其中Ⅰ型主要是骨、皮膚和肌腱膠原,Ⅱ型主要是軟骨膠原,Ⅲ型主要在胚胎組織以及成人血管、胃腸道,Ⅳ型只見于基膜等。通過用苦味酸-天狼星紅法在偏振光顯微鏡下可見Ⅰ型膠原纖維呈雙折射為橘黃色或亮紅色的粗纖維,Ⅲ型膠原纖維呈弱雙折射為綠色的細(xì)纖維,Ⅱ型膠原纖維在偏振光中不顯色。

膠原纖維染色在病理診斷上主要用于和肌纖維的鑒別。常用于顯示膠原纖維的方法有改良

VanGieson苦味酸麗春紅S法(簡稱改良V.G.法)、

Masson三色法和Mallory三色法等。所謂三色染色通常是指染胞核和能選擇性地顯示膠原纖維和肌纖維。其實(shí)V.G.法也是一種三色法,不過習(xí)慣上不稱三色法?？辔端猁惔杭tS法(V.G.法)

(改良

VanGieson)1.天青石藍(lán)染液

天青石藍(lán)B(celestin

blueB)0.5g

硫酸鐵銨(ferric

ammonium

sulphate)

5g

蒸餾水100ml

甘油(glycerin）14ml

麝香草酚(thymol)

50mg

取一只三角燒瓶盛蒸餾水,加入硫酸鐵銨,用玻璃棒攪動(dòng)使其完全溶解。加入天青石藍(lán)B,繼續(xù)用玻璃棒攪勻,以文火煮沸2-3分鐘,在煮沸時(shí)應(yīng)用玻璃棒不停輕輕攪動(dòng),否則天青石藍(lán)將沉積于瓶底成團(tuán)塊狀。待冷卻后過濾于小口砂塞瓶,再加入甘油和麝香草酚,置4℃冰箱可保存1年以上。臨用前半小時(shí)由冰箱取出恢復(fù)至室溫。為方便操作可傾入一小滴瓶內(nèi)使用。2.

Mayer蘇木精染液

蘇木精(ematoxylin)0.1g

蒸餾水100ml

碘酸鈉(sodium

iodate)20mg

硫酸鋁銨(aluminum

ammonium

sulphate)5g

檸檬酸(citric

acid)0.1g

水合氯醛(chloral

hydrate)5g

取一只200ml潔凈三角燒瓶盛蒸餾水,加入蘇木精并輕輕搖動(dòng)使完全溶解(可稍加溫至約50℃),再加入碘酸鈉及硫酸鋁銨,用玻璃棒輕輕攪動(dòng)使硫酸鋁銨完全溶解,最后加入檸檬酸與水合氯醛,此時(shí)溶液呈淡紅紫色,過濾于小口砂塞瓶內(nèi)。保存和使用同天青石藍(lán)液。3.1%的鹽酸乙醇液70%的乙醇99ml

純鹽酸(

hydrochloric

acid)1ml

4.1%的麗春紅S(ponceau

S）

5.苦味酸(

picric

acid)飽和水溶液

取蒸餾水100ml,加入苦味酸約2g即成苦味酸飽和水溶液。

6.改良

VanGieson(改良V.G.)染液

甲液：1%的麗春紅S1ml

乙液：苦味酸飽和水溶液9ml

甲乙兩液臨用前按比例混合,混合液一次性使用,不能保存。

(二)染色步驟

1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。

2.切片厚4um,常規(guī)脫蠟至水。

3.天青石藍(lán)液滴染2~3分鐘。

4.稍水洗。

5.Mayer蘇木精液滴染2~3分鐘。

6.稍水洗。

7.1%的鹽酸乙醇分化1-2秒。

8.流水沖洗10分鐘。

9.改良

VanGieson液滴染1~2分鐘。

10.急速用水洗一下,即用95%的乙醇快速分化。

11.無水乙醇脫水(I)、(Ⅱ)、(Ⅲ)各數(shù)秒鐘,二甲苯透明(I)、(Ⅱ)、(Ⅲ)各1~2分鐘。12.中性樹膠封固。（三）染色結(jié)果膠原纖維呈鮮紅色,肌纖維、胞質(zhì)及紅細(xì)胞呈黃色,胞核呈藍(lán)褐色。

染色結(jié)果

(四)注意事項(xiàng)

1.苦味酸水溶液的飽和度約1.2%,其干燥純品在高溫或受撞擊時(shí)會(huì)發(fā)生爆炸,為安全起見,廠商在出售時(shí)會(huì)加入水分35%以上,故在配制其飽和液時(shí)在100ml蒸餾水中加入含水的苦味酸約2g可達(dá)飽和。

2.特殊染色和組化染色的切片,一般切片厚度是4~5um,有時(shí)需要厚一些,則另有說明。

3.改良

VanGieson原法是用

Weigert鐵蘇木精染胞核,鐵蘇木精液為乙醇溶性,乙醇張力小,滴染時(shí)鐵蘇木精染液隨玻片擴(kuò)散,不易控制,其配制的蘇木精用量也較大,故改用天青石藍(lán)液及

Mayer蘇木精液代替,該兩液很穩(wěn)定,染色效果好,染液的保存時(shí)間也較長。

4.1%的鹽酸乙醇分化常規(guī)是1~2秒,在分化完畢和流水沖洗后,應(yīng)把切片放在顯微鏡下作低倍觀察。如核仍過深,可再分化0.5~1秒。如過淡,可再染天青石藍(lán)液和

Maver蘇木精液1次,然后再經(jīng)1%的鹽酸乙醇分化,至達(dá)理想為止。

5.改良

VanGieson染液分甲、乙兩液,應(yīng)于臨用前按1:9的比例混合配成。如組織膠原纖維較少(如腦組織),則以1:7混合為宜。如把兩液預(yù)先混合,放置數(shù)天后,麗春紅S則不易著色。

6.改良

VanGieson液的麗春紅s易被水洗掉,苦味酸的黃色則易被95%的乙醇洗脫。因此,改良V.G.染色后,經(jīng)水洗或95%的乙醇洗時(shí)都要迅速。7.染改良V.G.液后,可不經(jīng)水洗,直接滴入95%的乙醇分化,然后經(jīng)無水乙醇迅速脫水,這樣兩者的色澤較鮮麗。但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)分化不均勻,故可急速用水洗一下后才用95%的乙醇迅速分化。8.原V.G.法染液配制是用酸性品紅而不是麗春紅S,因酸性品紅容易褪色,改用麗春紅S則不易褪色,如果沒有麗春紅S,仍可用酸性品紅配制,則仍稱為V.G.法。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色結(jié)締組織和肌纖維

網(wǎng)狀纖維網(wǎng)狀纖維(reticularfiber)是網(wǎng)狀結(jié)締組織內(nèi)的一種纖維,它由網(wǎng)狀細(xì)胞所產(chǎn)生。網(wǎng)狀細(xì)胞是星狀多突細(xì)胞,核大,著色較淺,核仁明顯,胞質(zhì)較豐富,胞突彼此連接形成細(xì)胞網(wǎng)架。網(wǎng)狀纖維纖細(xì)而有分支,穿行于細(xì)胞體和胞突之間,共同構(gòu)成網(wǎng)狀支架。這種纖維用HE染色一般不易辨識(shí),若用銀氨液浸染后用甲醛還原能使纖維變成黑色,故又稱嗜銀纖維。

網(wǎng)狀纖維的分布很廣泛,常以兩種形式存在。一種是以網(wǎng)狀結(jié)締組織形式分布,即有網(wǎng)狀纖維和網(wǎng)狀細(xì)胞同時(shí)存在。多分布于造血器官和淋巴網(wǎng)狀器官,如紅骨髓、脾、淋巴結(jié)、肝、扁桃體和胸腺,消化管和呼吸道管壁的淋巴組織內(nèi),并成為這些器官的網(wǎng)狀支架。另一種是以網(wǎng)狀纖維單獨(dú)存在,沒有網(wǎng)狀細(xì)胞伴隨,見于上皮的基膜,還有平滑肌、脂肪細(xì)胞、毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維都有網(wǎng)狀纖維包裹。我們?nèi)粘ＫQ的網(wǎng)狀纖維染色,主要是顯示淋巴網(wǎng)狀組織的網(wǎng)狀纖維,因?yàn)檫@些組織網(wǎng)狀纖維的增多或減少,崩解或斷裂,都有助于病理組織上的診斷。而上皮基膜的完整或崩解,對(duì)一些原位癌的早期浸潤有意義。顯示網(wǎng)狀纖維主要是用銀浸染法。銀浸染技術(shù)最初是由Bielschowsky于1904年設(shè)計(jì)用于神經(jīng)原纖維的研究,后經(jīng)Maresch于1905年發(fā)展應(yīng)用于網(wǎng)狀纖維染色。以后,網(wǎng)狀纖維染色技術(shù)就在此基礎(chǔ)上逐步發(fā)展為各種銀氨液浸染法。例如:先后有Perdrau法、Foot法、Gomori法、Wilder法、Gorden-Sweets法、James法、Naoumenko-Feigin法等十多種。一般來說,氫氧化銀氨液(全稱氫氧化二氨合銀液)是銀氨液中最易被還原,容易和組織結(jié)合的一種,故一般多采用,但該液較不穩(wěn)定,對(duì)光的敏感性強(qiáng),故配制后易形成沉淀,易保存,需每隔1~2個(gè)月重新配制?，F(xiàn)介紹常用的兩種網(wǎng)狀纖維染色法。氫氧化銀氨法(I)

(改良Gordon-Sweets)(-)試劑配制1.10%的硝酸銀(silvernitrate）2.濃氫氧化銨(ammoniumhydroxide)3.3%的氫氧化鈉(sodiumhydroxide)4.0.5%的高錳酸鉀(potassiumpermanganate)5.0.5%的硫酸(sulphuricacid)6.酸化高錳酸鉀液0.5%的高錳酸鉀1份0.5%的硫酸1份臨用前混合后用,不能保存。7.2%的草酸(oxalicacid)8.2%的硫酸鐵銨9.10%的中性甲醛液

濃甲醛(formaldehyde)10ml

蒸餾水90ml

碳酸鈣(calciumcarbonate)加至過飽和用時(shí)取其上清液10.核固紅染液

核固紅(nuclearfastred)0.1g

硫酸鋁5g

蒸餾水100ml

麝香草酚(thymol)50mg取潔凈三角燒瓶兩只,一只盛蒸餾水30ml,稍加熱至約50℃,傾入核固紅,用玻璃棒輕輕攪動(dòng)使溶解。另一只盛蒸餾水70ml,傾入硫酸鋁,待完全溶解后與核固紅液混合,持恢復(fù)至室溫后過濾,再加入麝香草酚。11.Gordon-Sweets銀氨液

用小量杯盛10%的硝酸銀液2ml,逐滴滴入氫氧化銨,邊滴邊搖動(dòng)容器。先出現(xiàn)褐棕色的沉淀物,繼續(xù)滴入氫氧化銨至所形成的沉淀物恰好溶解加入3%的氫氧化鈉液2ml,再次形成沉淀,繼續(xù)滴入氫氧化銨,直至沉淀物又再恰好溶解,最后加蒸餾水至40ml,配好后的銀氨液用棕色滴瓶盛裝,放于4℃冰箱內(nèi)保存,用前取出恢復(fù)到室溫使用。此液可保存1-2個(gè)月。(二)染色步驟1.組織固定于10%的甲液中,常規(guī)脫水包理。2.切片厚4um,常規(guī)脫蠟至水。3.把切片平置在染色架上,滴入酸化高錳酸鉀液,氧化5分鐘。4.稍水洗。5.2%的草酸漂白1~2分鐘。6.稍水洗,再用蒸餾水水洗。7.2%的硫酸鐵銨液煤染5分鐘。8.稍水洗,再用蒸餾水洗一次。9.滴入Gordon-Sweets銀氨液作用1分鐘。10.蒸餾水稍洗。11.10%的中性甲醛液還原1分鐘。12.流水沖洗10分鐘。13.核固紅液染胞核5~10分鐘。14.稍水洗。15.常規(guī)膠水透明,中性樹膠封固。(三)結(jié)果網(wǎng)狀纖維呈黑色,細(xì)胞核呈紅色,膠原纖維呈黃色至黃棕色,胞質(zhì)呈淡黃色。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病原微生物

卡氏肺囊蟲

卡氏肺囊蟲是屬原蟲還是真菌,目前還沒有明確分類(多數(shù)學(xué)者認(rèn)為屬原蟲)?？ㄊ戏文蚁x的生活史是在肺泡里完成,成熟包囊為圓形或橢圓形,直徑約5~10um,外圍以囊壁,內(nèi)含8個(gè)囊內(nèi)小體,小體大小約1~2um,呈半月形。

卡氏肺囊蟲病多為合并感染引起,當(dāng)人體抵抗力降低時(shí),特別是兔疫功能低下的患者如AIDS患者就容易被感染,肺囊蟲大量緊殖引起肺囊蟲性肺炎。

卡氏肺囊蟲在HE片上不易被識(shí)別,卡氏肺囊蟲性肺炎時(shí),在HE染色片僅見肺泡腔內(nèi)囊蟲呈淺酸性小顆粒,常被誤診為滲出液中的蛋白,用特殊染色方法顯示卡氏肺囊蟲,則容易識(shí)別。顯示卡氏肺囊蟲的特染色方法主要有六胺銀法,熒光桃紅一石黃法、Giemsa法、PAS法和Gram法等,以前三種方法為佳。六胺銀法

（改良

Grocott）(-)試劑配制

1.8%的鉻酸(

chromic

acid）

2.0.5%的偏重亞硫酸鈉(

sodium

metabisulphite）

3.5%的硝酸銀(

silver

nitrate)

4.3%的六次甲基四胺(

hexamethylene

teramone）

5.5%的四硼酸鈉(

sodium

tetraborat)

6.六胺銀貯備液

5%的硝酸銀5ml

3%的六次甲基四胺100ml

取5%的硝酸銀5ml,慢慢傾入3%的六次甲基四胺100ml內(nèi),即形成白色沉淀,此沉淀在慢慢搖動(dòng)中即溶解變清,此澄清液用棕色小口砂塞瓶盛裝,置于4℃的冰箱可保存約6個(gè)月。

7.六胺銀工作液

六胺銀貯備液10ml

蒸餾水25ml

5%的四硼酸鈉2ml

依次加入,混合后即可使用。

8.0.1%的氯化金(

gold

chloride)先用棕色小口砂寒瓶配成1%的貯存液,再以小滴瓶配制0.1%的氯化金,即取蒸餾水與原液作9:1稀釋即成0.1%的氯化金。9.5%的硫代硫酸鈉(

sodium

thiosulphate）

10.

Mayer蘇木精

蘇木精(

hematoxylin)0.1g

蒸餾水

100ml

碘酸鈉(

sodium

iodate)20mg

硫酸鋁銨(

aluminum

ammonium

sulphate）5g

檸檬酸(

citric

acid)0.1g

水合氯醛(

chloral

hydrate)5g

取一只200ml潔凈三角燒瓶盛蒸餾水,加入蘇木精并輕輕搖動(dòng)使完全溶解(可稍加溫)，再加入碘酸鈉及硫酸鋁銨,用玻璃棒輕輕攪動(dòng)使硫酸鋁銨完全溶解,最后加入檸檬酸與水合氯醛,此時(shí)溶液呈淡紅紫色,過濾于小口砂塞瓶內(nèi)。置4℃的冰箱可保存1年以上。

(二)染色步驟

1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。

2.切片厚4~5um,常規(guī)脫蠟至水。

3.8%的鉻酸氧化20分鐘。

4.流水稍洗。

5.0.5%的偏重亞硫酸鈉處理1分鐘。

6.流水沖洗5分鐘,再用蒸餾水浸洗2次。7.切片置入預(yù)熱至58~60℃的六胺銀工作液內(nèi)并加蓋,于58~60℃的溫箱內(nèi)作用

20-60分鐘,至切片呈淡黃色,即取出經(jīng)蒸餾水洗后在顯微鏡下觀察有否菌體出現(xiàn),如有淡棕色的菌體出現(xiàn),以后每隔5~10分鐘取出鏡檢以控制菌體著色深淺,至認(rèn)為顯色恰當(dāng)為止。8.蒸餾水洗。

9.滴入0.1%的氯化金調(diào)色1分鐘。

10.蒸餾水稍洗。

11.5%的硫代硫酸鈉處理2分鐘。

12.流水沖洗5分鐘。

13.

mayer蘇木精染液染色5分鐘。

14.流水沖洗10分鐘。

15.常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。(三)結(jié)果

卡氏肺囊蟲包囊壁呈棕黑色,圓形或橢圓形。成熟的包囊內(nèi)含約8個(gè)囊內(nèi)小體,小體不著染。部分包囊壁可見增厚形成括弧樣結(jié)構(gòu)。真菌也呈棕黑色,應(yīng)根據(jù)各種真菌的形態(tài)特點(diǎn)。

病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病原微生物

抗酸菌抗酸染色是指對(duì)抗酸桿菌(acid-fast

bacilli)而言。抗酸桿菌屬分枝桿菌,由于菌體胞體壁上含有不等量的類脂質(zhì),主要是磷脂、脂肪酸和蠟質(zhì)三種成分,故一般不易著染。但一旦著染后可抵抗酸的脫色作用,故稱為抗酸菌。常見的抗酸菌為結(jié)核桿菌和麻風(fēng)桿菌。

結(jié)核桿菌(

tubercle

bacilli)為細(xì)長和稍彎曲的桿狀菌,可長短不一,常單條散在分布或平行相聚排列,有時(shí)呈分支狀。多見于結(jié)核性干酪樣壞死灶,它主要侵犯肺、淋巴結(jié)和腎臟。在病理組織中結(jié)核桿菌有多形性變化。麻風(fēng)桿菌(

leprosy

bacilli)較粗短筆直,常呈束狀排列或聚集成堆。在泡沫細(xì)胞(麻風(fēng)細(xì)胞)內(nèi)可見到大量麻風(fēng)桿菌,稱為麻風(fēng)球。它主要侵犯皮膚、黏膜和外周神經(jīng)(尺神經(jīng)、橈神經(jīng)等而引起鷹爪)，晚期還可侵犯各臟器。

抗酸桿菌在退行性改變時(shí)可呈顆粒狀,隨后染色減弱甚至完全不著色。例如麻風(fēng)桿菌在經(jīng)治療后,制作切片染色即呈小點(diǎn)狀。

顯示抗酸桿菌傳統(tǒng)是采用

Ziehl-Neelsen法,該法是用堿性品紅和苯酚進(jìn)行染色,在染色時(shí)進(jìn)行加熱處理,以促進(jìn)染液對(duì)菌體穿透。多年來此法是作為古典的抗酸菌染法。其后Wade-Fite在

Ziehl-Neelsen法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改良。下面的方法是根據(jù)此法稍改進(jìn),效果良好。

苯酚堿性品紅法(抗酸染色)

(改良Wade-fite）(-)試劑配制1.汽油松節(jié)油混合液

汽油1份

松節(jié)油1份

2.堿性品紅乙醇液

堿性品紅(

basic

fuchsin)5g

95%的乙醇100ml

取小口砂塞瓶盛裝,混合后輕輕搖動(dòng)多次使徹底溶解。

3.5%的苯酚(

phenol)取苯酚置入約50℃的溫箱使其溶解,量取5ml與蒸餾水95ml充分混溶。

4.苯酚堿性品紅液

堿性品紅乙醇液10ml

5%的苯酚水溶液90ml

5.20%的硫酸(sulphuric

acid)

(二)染色步驟

組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。

2.切片厚4um。

3.切片在汽油松節(jié)油混合液脫蠟2次,每次約5~10分鐘。

4.用吸水紙將切片周圍余液抹干,但切片應(yīng)保持稍濕潤。

5.流水漂洗1分鐘。

6.滴入苯酚堿性品紅液于室溫染20~30分鐘。

7.流水洗去多余染液。

8.20%的硫酸分化。

9.流水沖洗5分鐘。

10.

Mayer蘇木精淺染胞核。

11.流水沖洗10分鐘。

12.于50~60℃烘箱烘干,經(jīng)二甲苯透明,中性樹膠封固。

(三)結(jié)果

抗酸菌(包括麻風(fēng)桿菌和結(jié)核桿菌)呈紅色,胞核呈藍(lán)色。(六)應(yīng)用

本法常用以檢查結(jié)核桿菌和麻風(fēng)桿菌。例如:對(duì)于疑似干酪性壞死和結(jié)核樣結(jié)節(jié),為確定是否是結(jié)核菌所致,用抗酸染色有助于確定。對(duì)皮膚組織來說,如懷疑麻風(fēng)時(shí)一般都要作抗酸染色以檢查有否麻風(fēng)菌。如為瘤型麻風(fēng)可在病灶內(nèi)找到大量麻風(fēng)桿菌；類結(jié)核型麻風(fēng)則找不到麻風(fēng)桿菌；界線類麻風(fēng)在瘤型病灶內(nèi)有大量麻風(fēng)桿菌存在,而結(jié)核樣型病灶內(nèi)則找不到菌；未定類麻風(fēng)偶爾可找到少量麻風(fēng)桿菌。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病原微生物

螺旋體螺旋體(spirochaeta)是一類細(xì)長、柔軟、彎曲呈螺旋狀,運(yùn)動(dòng)活潑的原核細(xì)胞型微生物，具有細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁有脂多糖和壁酸。螺旋體在自然界和動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，而對(duì)人類能致病的有以下幾種。

1.密螺旋體(treponema)菌體長約6~14um,寬為0.25~0.5um,有8~12個(gè)細(xì)密而均勻的螺旋,兩端尖直。對(duì)人致病的有梅毒螺旋體。2.疏螺旋體(borrelia)有5~10個(gè)稀疏而排列不規(guī)則的螺旋。對(duì)人致病的有回歸熱螺旋體。3.鉤端螺旋體(leptospira)菌體細(xì)長,螺旋數(shù)目較多而細(xì)密,一端或兩端彎曲成鉤狀。菌體常屈曲呈C形、S形。常在染色后,由于菌體粗大,細(xì)密的螺旋看不清楚。如引起高熱、出血和黃疸等多種癥狀的鉤端螺旋體。

梅毒螺旋體多用組織塊鍍銀的Levaditi法顯示,切片亦可用Warthin-Starry法、改良的Dieterle法、Steiner和Steiner法,這些都屬鍍銀法。顯示鉤端螺旋體則多用Warthin-Starry鍍銀法?；貧w熱螺旋體則可取血液涂片作Giemsa染色。硝酸銀法(I)

根據(jù)(Levaditi)(一)試劑配制1.2%的硝酸銀(silvernitrate)2.還原液

焦性沒食子酸(pyrogallicacid)4g

濃甲醛(formaldehyde)5ml

蒸餾水100ml(二)染色步驟1.取組織厚約1-2mm為宜,10%的甲醛固定2-4天。2.流水沖洗一晚。3.95%的乙醇浸泡24小時(shí)。4,蒸水沒洗,并不時(shí)輕輕搖動(dòng),至組織下沉為止。5.再換餾水浸洗約10分鐘。6.移入2%的硝酸銀液(加蓋),置于37℃的溫箱內(nèi)3天,其間于第2天更換新的2%的硝酸銀液1次。

7.蒸餾水浸洗3次,每次10分鐘。

8.還原液(加蓋)于室溫置暗處2天。

9.蒸餾水浸洗3次,每次約2分鐘。

10.常規(guī)脫水透明,浸蠟包埋。

11.切片厚6~8um,貼片,烤干。

12.二甲苯脫蠟2次。

13.中性樹膠封固。(三)結(jié)果

梅毒螺旋體呈黑色或棕黑色,背景呈淡黃色至淡棕黃色。(四)染色機(jī)制梅毒螺旋體用通常的染色方法是不易著染的,但它有嗜銀性,在一定條件下,螺旋體可從銀液中吸附銀離子,經(jīng)還原液處理后,螺旋體內(nèi)吸附的銀離子被還原為黑色的金屬銀而顯色。(五)應(yīng)用這方法可顯示梅毒螺旋體,也可顯示鉤端螺旋體(leptospira)。梅毒螺旋體有8~12個(gè)均勻的螺旋,兩端尖直；鉤端螺旋體細(xì)長,螺旋數(shù)目較多而細(xì)密,一端或兩端彎曲成鉤狀，菌體亦常屈曲呈C形或S形。對(duì)疑為梅毒樹膠種的肝和鉤端螺旋體病的肝行此法染色,有助于確定病變性質(zhì)。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病原微生物

胃幽門螺桿菌胃幽門螺桿菌(

helicobacter

pyloric)過去又稱胃幽門彎曲菌(

campylobacter

pyloric)。與慢性胃炎和消化性潰瘍有密切關(guān)系。胃幽門螺桿菌一般呈弧形、S形或海鷗狀,有時(shí)可見3~4個(gè)彎曲呈螺旋狀,常呈魚群狀分布。該菌多見于胃黏膜表面上皮與黏膜層之間,并貼近表面上皮細(xì)胞,部分進(jìn)入上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),胃小凹和黏膜淺層腺腔內(nèi)亦有此菌。

顯示胃幽門螺桿菌常采用硝酸銀法。May-Griinwald

giemsa法(邁格林華-吉姆薩法)、Giemsa法(吉姆薩法)、堿性品紅法、硼酸亞甲藍(lán)法和檸檬酸甲苯胺藍(lán)法等。硝酸銀法把幽門螺桿菌染成棕黑色,背景黃色,對(duì)比清晰,染片可長期保存,但該法操作較煩瑣費(fèi)時(shí)。其他方法均較簡便,但染片容易褪色。

硝酸銀法

(改良

Warthin-Starry)(一)試劑配制

1.1%的檸檬酸(citric

acid)

2.酸化水(pH4.0)取一大燒杯,加入500ml雙蒸餾水,然后再加入1%的檸檬酸3~4ml,以玻璃棒攪勻,用pH試紙或酸度計(jì)測pH值,再慢慢加入1%的檸檬酸,邊加邊測pH值,直至達(dá)到pH=4.0為止。

3.1%的硝酸銀液

硝酸銀(

silver

nitrate)0.5g

酸化水,pH4.050ml4.2%的硝酸銀液

硝酸銀(

silver

nitrate)0.2g

酸化水,pH4.010ml

5.5%的明膠

明膠(

gelatine)5g

酸化水,pH4.0100ml取廣口砂塞瓶一只,傾入明膠和酸化水,置于37℃溫箱內(nèi)使慢慢溶解混勻,必要時(shí)可加汞硫代水楊酸鈉(merthiolate)lomg作為保存劑。6.0.15%的對(duì)苯二酚

對(duì)苯二酚(hydroquinone)15mg

酸化水,pH4.010ml7.顯影液2%的硝酸銀液6ml5%的明膠18ml0.15%的對(duì)苯二酚8ml此液需在下述染色步驟第4步操作完成之前依次充分混合,置于56℃的水浴箱內(nèi)保溫待用。(二)染色步驟1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。2.切片厚4~6um,常規(guī)脫蠟至水。3.蒸餾水浸洗切片2次,每次1分鐘。4.切片置入1%的硝酸銀液內(nèi)(加蓋)于56℃的水浴箱孵育1小時(shí)。5.從1%的硝酸銀液取出切片,不用水洗,即置入顯影液內(nèi)(加蓋),維持在56℃的水浴箱內(nèi),至切片呈淡黃棕色時(shí)取出,平放在玻璃架上,用預(yù)熱至56℃的自來水徹底沖洗。6.流水沖洗5分鐘。7.常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。(三)結(jié)果胃幽門螺桿菌呈棕黑色,背景呈黃棕色。螺旋體亦呈棕黑色。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病原微生物

細(xì)菌細(xì)菌(bacteria)是屬原核生物界的一種單細(xì)胞微生物。細(xì)菌體積從1um至數(shù)微米,直徑約0.8-1.2um。按其外形主要分為球菌、桿菌及螺形菌三大類。球菌菌體呈球形,又分為雙球菌、鏈球菌、葡萄球菌等；桿菌菌體呈桿狀,長短不一,有些桿菌是直的,有些則稍彎曲,有些又有分支；螺形菌菌體彎曲,又可分為弧菌和螺菌?；【挥幸粋€(gè)彎曲,呈逗點(diǎn)狀，螺菌菌體可有數(shù)個(gè)彎曲。

細(xì)菌由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)構(gòu)成。細(xì)胞壁是一層較薄的膜狀結(jié)構(gòu),其功能是維持細(xì)胞的外形。細(xì)胞膜位于細(xì)胞壁的內(nèi)層,由磷脂和蛋白質(zhì)構(gòu)成；細(xì)胞質(zhì)為細(xì)胞膜所包裹,是細(xì)菌的基礎(chǔ)物質(zhì),內(nèi)含核糖體等物質(zhì)。核質(zhì)多在菌體中央,無核膜和核仁。此外,有些細(xì)菌還有莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊結(jié)構(gòu)。

細(xì)菌染色常用革蘭(Gram)法,該法是由丹麥細(xì)菌學(xué)家Christiangram于1884年創(chuàng)建，至今有一百多年仍在廣泛應(yīng)用。Gram染色可把細(xì)菌區(qū)分為兩類。標(biāo)本先用結(jié)晶紫染色,再加碘媒染,使之生成結(jié)晶紫-碘復(fù)合物,此時(shí)不同細(xì)菌均被染成藍(lán)紫色。繼后通過用苯胺、丙酮等分化處理,仍保持不脫色的為Gram陽性菌,完全脫色的或經(jīng)堿性品紅、碳酸鋰胭脂紅染成紅色的為Gram陰性菌。Gram染色,最古老的是Gram法,其后有Gram-Weigert法,Conn等改良Weigert法，Brown和Brenn的改良Gram法,Brown和Hopps改良的Gram法等。不管那一種方法，顯示Gram陽性菌都是以結(jié)晶紫作為主要染料,結(jié)晶紫是一種六甲基對(duì)玫瑰苯胺,染色后呈明亮的藍(lán)紫色，是一種較為理想的細(xì)菌染料。苯胺結(jié)晶紫法

(改良

gram-weigert)(-)試劑配制

1.苯胺結(jié)晶紫染液

結(jié)晶紫(

crystal

violet)2g

無水乙醇(

absolute

alcohol)10ml

苯胺(

aniline)2ml

蒸餾水88ml

結(jié)晶紫溶于無水乙醇,苯胺與蒸餾水盛于小口砂塞瓶加塞后稍用力搖勻混合,再與完全溶解的結(jié)晶紫液混合。此液用前需過濾,約可保存2~3個(gè)月。

2.

Weigert碘液

碘片(

iodine)

1g

碘化鉀(

potassium

iodine)2g

蒸餾水100ml

取蒸餾水4ml,加入碘化鉀使完全溶解,繼續(xù)加入碘片,輕輕搖動(dòng)使完全溶解后再加入其余蒸餾水。

3.苯胺二甲苯

苯胺(

aniline)1份

甲苯(

xylene)2份

(二)染色步驟

1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。2.切片厚4um,常規(guī)脫蠟至水。

3.

Mayer蘇木精液復(fù)染胞核3分鐘。

4.流水沖洗10分鐘。

5.伊紅液于56℃的溫箱內(nèi)染5分鐘。

6.稍水洗。

7.苯胺結(jié)品紫(用小濾紙過濾在切片上)染色5分鐘。

8.傾去染液,用濾紙吸干切片周圍染液。

9.

Weigert碘液直接滴在切片上約2分鐘。

10.傾去碘液,稍水洗,用濾紙徹底吸干切片上的水分。

11.苯胺二甲苯進(jìn)行分化,并輕輕搖動(dòng)切片,必要時(shí)可更換新的苯胺二甲苯進(jìn)行分化，至切片無顏色脫出,立即傾去切片上的苯胺二甲苯。

12.滴入二甲苯以洗去苯胺,然后在鏡下觀察。如分化不夠,可再次滴入苯胺二甲苯進(jìn)行分化,至切片上革蘭陽性菌顯示清晰為止。

13.二甲苯反復(fù)多次洗切片,徹底把苯胺除去。

14.中性樹膠封固。(三)結(jié)果

組織中革蘭陽性藍(lán)紫色,陰性菌不著染。纖維素也是藍(lán)紫色,胞核呈藍(lán)色,其他組織成分呈淡紅色。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病原微生物乙型肝炎病毒病毒性肝炎(

viral

hepatitis)是由肝炎病毒引起的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性壞死為主要病變的傳染病。現(xiàn)已知肝炎病毒主要有五種型別:甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒及戊型肝炎病毒。近年還發(fā)現(xiàn)有庚型肝炎病毒、TT型肝炎病毒等。而乙型肝炎病毒在世界范圍內(nèi)傳播,嚴(yán)重危害人類健康。

乙型肝炎病毒有三種不同的形態(tài):①小球形顆粒；②管形顆粒；③大球形顆粒。大球形顆粒又稱Dane顆粒,是一種具有內(nèi)核外殼的、雙層結(jié)構(gòu)的、完整的病毒顆粒。內(nèi)核有20面體的對(duì)稱結(jié)構(gòu),表面含有乙型肝炎核心抗原(HBcAg),外殼有乙型肝炎表面抗原(HbsAg）。

HBcAg顆粒主要存在于乙型肝炎患者的肝細(xì)胞核內(nèi),而

HBsAg顆粒則存在于肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，通過免疫酶組化方法可顯示肝切片內(nèi)的

HBcAg和

HBsAg。近年用地衣紅等可顯示

HBsAg。

顯示

HBsAg的染色有地衣紅法、醛品紅法和維多利亞藍(lán)法等。地衣紅法染液配制簡易,特異性高,但染色效果受不同廠家和批號(hào)的染料影響,肝細(xì)胞內(nèi)的脂褐素也著染。醛品紅法染液配制也簡單,染色時(shí)間短,也著染脂褐素。維多利亞藍(lán)法著色深,特異性高,可復(fù)染胞核,紅藍(lán)對(duì)比清晰,染液保存期長。不足之點(diǎn)染液配制較煩瑣,配制后1周才能使用，染色時(shí)間也較長。地衣紅法

(根據(jù)

Shikata)(一)試劑配制

1.0.5%的高錳酸鉀(

potassium

permanganate）

2.0.5%的硫酸(

sulphuric

acid)

3.酸化高錳酸鉀液

0.5%的高錳酸鉀1份

0.5%的硫酸1份

臨用前混合后用,不能保存。

4.2%的草酸(

oxalic

acid）

5.酸化地衣紅乙醇液

地衣紅1g

70%的乙醇100ml

鹽酸(

hydrochloric

acid）1ml

先將地衣溶解于70%的乙醇,待其徹底溶解后,再加入濃鹽酸,其pH相當(dāng)于1.0，放置2天后即可用。(二)染色步驟

1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。

2.切片厚4um,常規(guī)脫蠟至水。

3.酸化高錳酸鉀液氧化5分鐘。

4.稍水洗。

5.2%的草酸漂白2分鐘,脫去高錳酸鉀著色。

7.70%的乙醇稍浸洗。

8.酸化地衣紅乙醇液浸染(加蓋)5小時(shí)或更長。

9.70%的乙醇浸洗2次,每次約10~30秒,其間把切片提起放下,至切片無染液脫出為止。

10.常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。(三)結(jié)果

肝細(xì)胞內(nèi)的HBsAg陽性物質(zhì)呈棕紅色至深棕色(圖3-13),微細(xì)顆粒狀或均質(zhì)狀。陽性物質(zhì)可形成圓形或橢圓形的團(tuán)塊,也可充滿整個(gè)胞質(zhì),呈環(huán)形或半月形圍繞胞核；有時(shí)可見于肝細(xì)胞胞質(zhì)邊緣,呈花邊狀。彈性纖維、脂褐素也染為深棕色,其余底色為較淺淡的灰棕色,肝細(xì)胞胞核不著色。陽性物質(zhì)的輪廓很清楚。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病原微生物真菌真菌(fung)舊稱霉菌,真菌的種類很多,在自然界分布極廣,其中有很多與人類的日常生活有密切聯(lián)系,但大部分為非致病性,僅少數(shù)真菌可感染人體形成真菌病。真菌一般不產(chǎn)生外毒素和內(nèi)毒素,其致病作用可能與在人體內(nèi)繁殖引起的機(jī)械性損傷和所產(chǎn)生的酶類、酸性代謝產(chǎn)物有關(guān)。

真菌有單細(xì)胞和多細(xì)胞兩種類型。在病理切片上常見的深部真菌有單細(xì)胞真菌,菌體呈圓形或橢圓形,如組織胞漿菌、新型隱球菌等；多細(xì)胞真菌,菌體呈絲狀,并分支交織成團(tuán),稱為絲狀菌,其結(jié)構(gòu)分菌絲和孢子,如曲菌、白色念珠菌等。大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁是由纖維素和明角質(zhì)混合組成,含有多糖,故用高碘酸無色品紅法均能染成紅色。真菌用HE染色一般著色不良,因此,用特殊染色方法顯示,高碘酸無色品紅法可顯示大多數(shù)真菌,這是廣泛采用的常規(guī)檢驗(yàn)方法。無色品紅-醛品紅法和六胺銀法適用于曲菌、白色念珠菌等,特別是六胺銀法對(duì)馬爾尼菲青霉菌和毛霉菌的染色效果甚佳,新型隱球菌主要應(yīng)用黏液朋脂紅法或愛爾新藍(lán)法(pH2.5),也可用六胺銀法顯示。

高碘酸-無色品紅法

(根據(jù)

McManus)(-)試劑配制1.0.5%的高碘酸(

predic

acid)

2.無色品紅液

堿性品紅1g

蒸餾水200ml

1mol/l的鹽酸(

hydrochlore

acid）20ml

偏重亞硫酸鈉1-1.5g

活性炭

2g配制方法

(1)取一只500ml的潔凈三角燒瓶,內(nèi)盛蒸餾水200ml,置于電爐上煮沸后取出。

(2)加入堿性品紅lg于煮沸后的蒸餾水內(nèi),輕輕搖動(dòng)數(shù)分鐘使堿性品紅徹底溶解,此時(shí)溶液為深紅色。

(3)待冷卻至50℃時(shí),過濾至另一只潔凈的三角燒瓶內(nèi)。

(4)加入1mol/L的鹽酸20ml并稍搖勻。

(5)待冷至約25℃時(shí),加入偏重亞硫酸鈉,塞緊瓶口,并輕輕搖動(dòng)使其溶解,此時(shí)堿性品紅液明顯變淡。（6）于室溫置黑暗處作用24小時(shí),此時(shí)溶液應(yīng)呈淡紅或淡的稻草黃色。

(7)取出加入活性炭粉,塞緊瓶口輕輕搖動(dòng)2分鐘后靜置1小時(shí),用雙層濾紙過濾到棕色小口砂塞瓶內(nèi),此時(shí)溶液應(yīng)完全無色,稱無色品紅液,又稱

Schift試劑。

(8)塞緊密封置4℃冰箱內(nèi)保存待用。3.0.5%的偏重亞硫酸鈉4.

Maver蘇木精

蘇木精(

hematoxylin)0.1g

蒸餾水100ml

碘酸鈉(

sodium

iodate)20mg

硫酸鋁銨(

aluminum

ammonium

sulphate)

5g

檸檬酸(

citric

acid)0.1g

水合氯醛(

chloral

hydrate)5g

取一只200m潔凈三角燒瓶盛蒸餾水,在電爐上稍加溫至40~50℃,傾入蘇木精并輕輕搖動(dòng)數(shù)分鐘使完全溶解,再加入碘酸鈉和硫酸鋁銨,用玻璃棒攪動(dòng)使硫酸鋁銨溶解,最后加入檸檬酸與水合氯醛,此時(shí)溶液應(yīng)呈淡紅紫色,過濾于小口砂塞瓶內(nèi),置冰箱可保存1年。(二)染色步驟

1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。

2.切片厚4um,常規(guī)脫蠟至水。

3.0.5%的高碘酸氧化5~8分鐘。

4.流水沖洗2分鐘,再用蒸餾水浸洗2次。

6.0.5%的偏重亞硫酸鈉滴洗2次,每次2分鐘。

7.流水沖洗2分鐘。

8.

Mayer蘇木精淺染核2~3分鐘。

9.流水沖洗10分鐘。

10.常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。

(三)結(jié)果

真菌呈紅紫色,胞核呈藍(lán)色。

病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病理性沉著物鈣鹽鈣在人體內(nèi)大量存在,主要構(gòu)成骨骼,作為支持人體的支架。它在分泌、運(yùn)送、肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)等也起重要作用。

鈣在機(jī)體內(nèi)以兩種形式存在,一種是離子鈣,存在血液循環(huán)內(nèi),即所謂血鈣;另一種是結(jié)合鈣,和蛋白、碳酸或磷酸結(jié)合而沉著在組織內(nèi)。除骨骼和牙齒外,正常時(shí)鈣滲透在所有組織和細(xì)胞中,一般不以固體狀態(tài)出現(xiàn)在組織內(nèi)。但在某些情況下,鈣析出成固體并沉著于組織內(nèi),則為病理性鈣鹽沉著。沉著的鈣鹽主要是磷酸鈣,其次為碳酸鈣。

在HE染色中,鈣鹽和蘇木精結(jié)合形成藍(lán)紫色的色淀。鈣鹽在微量時(shí),有時(shí)和細(xì)菌不易區(qū)別,但鈣鹽的顆粒粗細(xì)不一。用以證明鈣鹽的方法有兩種,一種是

Von

kossa的硝酸銀法,另一種是茜素紅S法。硝酸銀法(根據(jù)

Von

kossa)(-)試劑配制1.1%的硝酸銀(

silver

nitrate)2.5%的硫代硫酸鈉(

sodium

thiosulphate)(二)染色步驟1.組織固定于10%的緩沖中性甲醛液,常規(guī)脫水包埋。2.切片厚5um,常規(guī)脫蠟至水。3.蒸餾水洗1分鐘。4.切片置入1%的硝酸銀于強(qiáng)陽光處照射15~60分鐘。5.蒸餾水洗1分鐘。6.5%的硫代硫酸鈉處理2分鐘。7.流水沖洗5分鐘。8.HE染色復(fù)染。9.常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。(三)結(jié)果鈣鹽呈褐黑色至深黑色,細(xì)胞核呈藍(lán)色,背景呈紅色。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病理性沉著物

尿酸鹽尿酸鈉多沉積在跖趾關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)及手指各關(guān)節(jié)的骨中，亦可沉積在關(guān)節(jié)的軟組織、韌帶和耳軟骨等處,形成痛風(fēng)結(jié)節(jié)(又稱痛風(fēng)石),在結(jié)節(jié)中大量的尿酸鹽結(jié)晶體沉積。鏡下見結(jié)晶體為針狀,互相平行排列,周圍有肉芽組織形異物性巨細(xì)胞反應(yīng)。尿酸鹽易溶于水而不溶于乙醇;在用甲醛固定的常規(guī)制片中,結(jié)晶體全部被溶解,只看到針狀的空隙。因此,顯示尿酸鹽時(shí),應(yīng)采用乙醇固定,選用特殊的染方法。

六胺銀法(根據(jù)

Gomori)（一）試劑配制1.5%的硝酸銀(

silver

nitrate)2.3%的六次甲基四胺(

hexamethylenetetramine)3.六胺銀貯備液5%的硝酸銀

5ml3%的六次甲基四胺100ml將5%的硝酸銀傾入3%的六次甲基四胺,即出現(xiàn)白色沉淀,此沉淀物在搖動(dòng)中很快溶解,溶液變清。置于4℃的冰箱可保存約半年。4.5%的四硼酸鈉(

sodium

tetraborat）5.六胺銀工作液

六胺銀貯備液10ml

蒸餾水25ml5%的四硼酸鈉

2ml將六胺銀貯備液加入蒸餾水中混合,然后加入5%的四硼酸鈉,待徹底混合后即可用，此液應(yīng)于臨用時(shí)配。6.0.1%的氯化金水溶液7.5%的硫代硫酸鈉(

sodium

thiosulphate)8.0.5%的伊紅液

伊紅Y,水溶性(

eosin

y,

water

soluble)1g

蒸餾水200ml

冰醋酸1滴（二）染色步驟1.小塊組織固定于無水乙醇中16小時(shí)(過夜),再經(jīng)無水乙醇3次,每次約30分鐘,滴甲苯2次,每次約15~20分鐘,浸蠟包埋。2.切片厚5um,二甲苯脫蠟至無水乙醇。3.浸入預(yù)熱的六胺銀工作液(加蓋)于58~60℃的恒溫箱內(nèi)作用30分鐘,此時(shí)如有尿酸鹽存在,切片即呈黑色。

4.蒸餾水稍洗。5.0.1%的氯化金處理1分鐘。6流水稍洗。7.5%的硫代硫酸鈉處理5分鐘。8.流水沖洗5分鐘。9.0.5%的伊紅液淺染30秒。10.稍水洗。11.常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。（三）結(jié)果尿酸鹽結(jié)晶呈黑色,背景呈淡紅色。（四）應(yīng)用若指(趾)關(guān)節(jié)等腫大時(shí)疑為尿酸鹽沉積所致的痛風(fēng)結(jié)節(jié),可用此染色協(xié)助確診。病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色病理性沉著物

纖維素纖維素(abrin)又稱纖維蛋白,它是由存在于血液內(nèi)的纖維蛋白原分子聚合形成的特殊蛋白質(zhì).正常的凝血過程分三步：第一步是一系列凝血酶原激活物的形成；第二步為凝血酶原激活物催化凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?；第三步為凝血酶催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白,從而使血液凝固形成凍膠狀的血凝塊。

組織內(nèi)出現(xiàn)的纖維素,可以是血管壁破裂,血液成分直接溢出；也可以是由于血管壁損傷較重,血管壁通透性增高,使血漿內(nèi)的纖維蛋白原分子通過,這多見于局部的炎癥反應(yīng)或過敏性反應(yīng)的表現(xiàn)。纖維素嗜酸性,HE染色為紅染的細(xì)絲,并互相連接成網(wǎng)狀,也可相互融合。新鮮的纖維素有嗜蘇丹反應(yīng),用類脂染色法染色呈弱陽性,陳舊的纖維素呈膠原染色反應(yīng)。纖維素樣變(fibrinoiddegeneration)是結(jié)締組織中膠原纖維或小血管壁發(fā)生的一種變性,它具有纖維素的染色反應(yīng),所以稱為纖維素樣變。這種物質(zhì)稱為纖維素樣物質(zhì)。纖維素樣變其形態(tài)在HE染色為邊界不清的顆粒狀或小條、小塊狀的無結(jié)構(gòu)物質(zhì),折光性強(qiáng),強(qiáng)嗜酸性,故被染為深紅色,頗像纖維素,用纖維素染色有時(shí)也呈陽性反應(yīng)。顯示纖維素和纖維素樣變的方法有Mallory磷鎢酸蘇木精法和改良的Gram-Weigert法,此兩法把纖維素染成藍(lán)紫色至藍(lán)黑色。

Lendrum等介紹的馬休黃猩紅藍(lán)法(MSB)把纖維素染成紅色,顏色較鮮艷。磷鎢酸蘇木精法(根據(jù)

Mallory)（一）試劑配制1.0.5%的高錳酸鉀(

potassium

permanganate)2.0.5%的硫酸(

sulphuric

acid)3.酸化高錳酸鉀液0.5%的高錳酸鉀1份0.5%的硫酸1份臨用前混合后用,不能保存。4.2%的草酸(

oxalic

acid)磷鎢酸蘇木精法(根據(jù)

Mallory)5.磷鎢酸蘇木精液

蘇木精0.1g

蒸餾水100ml

磷鎢酸(

phosphotungstic

acid）2g取潔凈三角燒瓶一只盛蒸餾水30ml,傾入蘇木精,稍加溫使蘇木精完全溶解。另取三角燒瓶盛蒸餾水70ml,加入磷鎢酸后輕輕搖動(dòng)使其完全溶解。待蘇木精液冷卻后與磷鎢酸液混合,加塞后置于光亮處,隔數(shù)天輕輕搖動(dòng)一次,待3~6個(gè)月成熟后才使用。（二）染色步驟1.組織固定于10%甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。2.切片厚4μm,常規(guī)脫蠟至水。3.高錳酸鉀液氧化5分鐘。4.稍水洗。5.2%的草酸漂白1~2分鐘。6.流水沖洗2分鐘,蒸餾水洗一次。7.磷鎢酸蘇木精液浸染(加蓋)24~48小時(shí)。8.取出切片直接用95%的乙醇迅速洗去多余染液。9.常規(guī)脫水透明,中性樹膠固定。（三）結(jié)果纖維素、胞核、紅細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)纖維呈深藍(lán)色,橫紋肌的橫紋也呈深藍(lán)色。膠原纖維、軟骨基質(zhì)呈棕紅色,粗的彈性纖維呈紫色。(四)應(yīng)用磷鎢酸蘇木精液可染纖維素,如各種炎癥滲出的纖維素。對(duì)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的切片,用磷鎢酸蘇木精液染色可在毛細(xì)血管內(nèi)發(fā)現(xiàn)藍(lán)色的纖維素細(xì)絲。病理檢驗(yàn)技術(shù)

含鐵血黃素染色方安寧性質(zhì)1.由于出血、淤血或其他疾病時(shí)產(chǎn)生的一種自身性色素2.HE切片鏡下呈金黃色或黃棕色的大小不等、形態(tài)不一的顆粒3.形成是由于巨噬細(xì)胞作用于血紅蛋白的結(jié)果4.不溶于堿性溶液，溶解于酸性溶液應(yīng)用1.證明和鑒別含鐵血黃素與其他色素2.用以顯示組織內(nèi)各種出血性或淤血性病變普魯士藍(lán)染色法1.試劑配制（1）普魯士藍(lán)液：2%亞鐵氰化鉀水溶液：亞鐵氰化鉀2g蒸餾水加至100ml2%鹽酸水溶液：純鹽酸2ml蒸餾水加至100ml

臨用前將兩液等量混合，靜置5min后即可使用，臨用前配制。1.試劑配制（2）胞質(zhì)、胞核復(fù)染液1）核固紅染液：核固紅0.1g

硫酸鋁5g

蒸餾水100ml

麝香草酚50mg

首先將硫酸鋁溶解于100ml蒸餾水中，然后加入核固紅，稍加熱溶解，冷卻過濾，之后加入麝香草酚。2）1%中性紅水溶液：中性紅1g

蒸餾水加至100ml3）0.1%沙紅水溶液4）堿性品紅乙醇溶液：堿性品紅0.5g50%乙醇100ml普魯士藍(lán)染色法2.染色步驟（1）石蠟切片脫蠟至水（2）蒸餾水洗2次（3）進(jìn)入新鮮配制的普魯士藍(lán)染液作用10～20min（4）蒸餾水洗（5）進(jìn)入胞質(zhì)、胞核復(fù)染液中的任一種染色3～5min（6）蒸餾水洗（7）脫水、透明、封固普魯士藍(lán)染色法3.染色結(jié)果含鐵血黃素呈藍(lán)色其他組織為復(fù)染顏色普魯士藍(lán)染色法4.注意事項(xiàng)（1）普魯士藍(lán)染液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，不能久用，溶液呈現(xiàn)微淡綠色，不能再用。（2）鐵離子會(huì)影響染色效果或造成假陽性，所以操作過程中所使用容器要求化學(xué)純凈，所使用的試劑應(yīng)是分析純，避免操作過程中用含鐵的自來水沖洗，而影響染色效果。（3）在染色時(shí)用陽性片做對(duì)照，可保證染色效果。普魯士藍(lán)染色法小結(jié)1.含鐵血黃素是一種不穩(wěn)定的鐵蛋白聚合體，含鐵質(zhì)的棕色色素。2.主要用于某些出血、淤血或相關(guān)疾病的診斷。3.常用的染色方法是普魯士藍(lán)染色法，使含鐵血黃素呈藍(lán)色。病理檢驗(yàn)技術(shù)

方安寧胰島細(xì)胞染色概述1.胰島是胰腺的內(nèi)分泌部，由A、B、D、PP四種細(xì)胞組成2.HE染色，胰島細(xì)胞著色較淺，細(xì)胞排列成團(tuán)索狀，大小不一，細(xì)胞間有豐富的毛細(xì)血管。3.胰島細(xì)胞染色可顯示胰島細(xì)胞的過度增生，鑒別胰島細(xì)胞腫瘤的細(xì)胞起源。Halmi醛品紅染色法1.試劑配制（1）醛品紅染液：堿性品紅1g

三聚乙醛2ml60%乙醇100ml

鹽酸1ml先將堿性品紅溶于乙醇中，加入鹽酸和三聚乙醛，常溫下5～7天，過濾后4℃冰箱可保存2～3個(gè)月Halmi醛品紅染色法1.試劑配制（2）復(fù)染液：淡綠0.2g

磷鎢酸0.5g

冰醋酸1ml

蒸餾水100ml混合溶解，過濾后使用（3）天青石藍(lán)液：Halmi醛品紅染色法2.染色步驟（1）石蠟切片，脫蠟至水（2）Lugol碘液氧化8～10min（3）水洗（4）2.5%硫代硫酸鈉漂白2min（5）水洗，蒸餾水洗（6）70%乙醇2min（7）醛品紅染液染色20～30min（8）95%乙醇洗，水洗（9）天青石藍(lán)液染色3minHalmi醛品紅染色法2.染色步驟（10）水洗（11）明礬蘇木素液染3min（12）水洗（13）正常分化（14）蒸餾水洗（15）淡綠復(fù)染液