2014年荊芥揮發(fā)油對LPS所致大鼠急性肺損傷模型肺組織中NF-κB IκBTNF-α和IL1-β含量的影響【藥學(xué)論文】

1/12014年荊芥揮發(fā)油對LPS所致大鼠急性肺損傷模型肺組織中NF-κB，IκB，TNF-α和IL1-β含量的影響【藥學(xué)論文】藥學(xué)論文-荊芥揮發(fā)油對LPS所致大鼠急性肺損傷模型肺組織中NF-B，IB，TNF-和IL1-含量的影響作者：

解宇環(huán)沈映君金沈銳徐世軍【摘要】目的觀察荊芥揮發(fā)油（VOHS）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）大鼠模型肺組織中核因子-B(NF-B)，IB-，IL1-和TNF-含量的影響，探討荊芥揮發(fā)油抗炎作用的細(xì)胞信號調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

方法雄性SD大鼠60只隨機分為6組，分別為空白對照組，模型對照組，陽性對照組（地塞米松），荊芥揮發(fā)油高、中、低劑量組。

尾靜脈注射LPS(1.0mg/kg體重)或生理鹽水，6h后處死動物，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定肺組織NF-Bp65、磷酸化IB-、IL1-和TNF-含量。

結(jié)果與模型對照組比較，VOHS高、中、低劑量組均可顯著降低大鼠肺組織中的NF-Bp65和磷酸化IB-含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05，P0.01,P0.001），同時VOHS各劑量組也可顯著降低大鼠肺組織中IL1-和TNF-含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01，P0.001）。

結(jié)論荊芥揮發(fā)油抗炎作用機制之一可能是抑制IB-磷酸化降解和NF-B活性，進而減少炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL1-，TNF-的合成和釋放。

【關(guān)鍵詞】急性肺損傷脂多糖荊芥揮發(fā)油抗炎機制Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofthevolatileoilofHerbaSchizonepetaeonlevelofNF-B,IкB，IL1-andTNF-inlungtissueofALIratsinducedbyLPS,sotoexplorethemodulatormechanismsofthevolatileoilofHerbaSchizonepetaeinsignaltransductionofinflammation.MethodsSixtymaleratswererandomlydividedintosixgroups:normalcontrolgroup,modelgroup,LPS+DexgroupandthreevolatileoilofHerbaSchizonepetaegroups.LPSwasinjectedintravenouslytoprepareALImodel.ThelevelofNF-B,IкB,IL1-andTNF-inlunghomogenatesweremeasuredbyELISA.ResultsThelevelofNF-BinratlungssignificantlyincreasedafterLPSstimulationthanthatofthenormalgroup(P0.05，P0.01,P0.001);theVolatileoilofHerbaSchizonepetaegroupscoulddecreasethelevelofNF-B,IкB,IL1-andTNF-inratlungsofthemodelgroups（P0.01，P0.001）.ConclusionThevolatileoilofHerbaSchizonepetaecaninhibittheIB-phosphorylationandNF-Bactivivty,thenreducethesynthetiseandreleaseofcytokines(IL1-,TNF-).ThismaybeoneofthemechanismthatVOHShastheeffectofanti-inflammation.Keywords:Acutelunginjury;Lipopolysaccharide;ThevolatileoilofHerbaSchizonepetae;Mechanismofanti-inflammation荊芥為常用解表藥，前期的實驗已經(jīng)證實其揮發(fā)油對多種炎癥動物模型均具有良好的抗炎作用［1,2］。

核因子-B對前炎癥因子IL1和TNF的基因表達調(diào)節(jié)起重要作用,而NF-B的活化受NF-B抑制蛋白IB的調(diào)控［3］，荊芥揮發(fā)油能否通過干預(yù)NF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑達到抗炎作用，目前尚無研究報道。

本研究應(yīng)用脂多糖（LPS）復(fù)制大鼠急性肺損傷（ALI)模型，通過觀察荊芥揮發(fā)油(VOHS)對大鼠肺組織中核因子Bp65，IB-，IL1-和TNF-含量的影響進一步探討荊芥揮發(fā)油抗炎作用機制。

1材料1.1荊芥揮發(fā)油荊芥(HerbaSchizonepetae)購自成都市中藥材公司，由我校中藥鑒定教研室王光志博士鑒定符合現(xiàn)行《中國藥典》藥用標(biāo)準(zhǔn)，按《中國藥典》2005版Ⅰ部附錄ⅩD揮發(fā)油測定法中甲法提取，得淡黃色澄明油狀液體，氣味芳香，揮發(fā)油含量為1.2%，無水硫酸鈉充分脫水后，密閉貯存于棕色瓶中,4℃冰箱保存?zhèn)溆?，實驗時用0.5%吐溫-80溶液配制使用。

前期實驗測得VOHS小鼠灌胃給藥LD50為1.10ml/kg，實驗中所用VOHS劑量約為LD50的1/10,1/20,1/40。

1.2動物健康SD雄性大鼠（SPF級），體重180～220g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK（川）2004-12。

1.3試劑LPS（E.Coli0111：

B4）Sigma公司產(chǎn)品；地塞米松磷酸鈉注射液，西南藥業(yè)股份有限公司，批號66040099；RatNF-Bp65ELISAKit，RatIB-ELISAKit，批號0504；RatIL1-ELISAKit，批號0509；RatTNF-ELISAKit，批號0509，以上均由上?？党缮镉邢薰咎峁?/p>

1.4儀器MultiskanMK3酶標(biāo)儀,Thermo公司；JY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝科器研究所。

2方法與結(jié)果2.1LPS致大鼠ALI模型的制備取SD雄性大鼠（SPF級）60只，按體重分層，隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組（地塞米松），VOHS高、中、低劑量組，每組10只。

除陽性對照組第5天予地塞米松腹腔注射1次給藥外，其它組均連續(xù)灌胃給藥5d，1次/d，空白對照組和模型對照組灌相同體積的生理鹽水。

末次給藥后1h，每鼠尾靜脈注射LPS1.0mg/kg體重，6h后處死動物，在無菌條件下取出肺臟，用無菌濾紙吸干肺臟表面的血液后錫箔紙包裹，-70℃保存。

2.2肺組織總蛋白的抽提及指標(biāo)的檢測稱取肺組織250mg,并加入預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提試劑，以超聲波細(xì)胞粉碎機低速粉碎細(xì)胞，低溫冷凍離心14000r/min,15min后，取上清液，按BCA法測定蛋白濃度。

用ELISAKit，參照試劑盒說明測定活化的NF-Bp65和磷酸化的IB-以及IL1-,TNF-含量：

采用雙抗體夾心法。

酶標(biāo)板上已包被捕獲抗體。

待測樣品加入微孔孵育后加檢測抗體孵育，隨后加HRP偶聯(lián)的抗小鼠二抗，最后加TMB顯色。

酶標(biāo)儀450nm處讀OD值，OD值大小與蛋白的量成正比。

2.3統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)均以s表示,統(tǒng)計采用單因素方差分析（ANOVA）。

2.4結(jié)果2.4.1VOHS對LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型肺組織中NF-Bp65，IкB-含量的影響結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，造模各組與空白對照組相比，NF-кBp65含量升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05，P0.01,P0.001）。

與模型對照組比較，VOHS高、中、低劑量組均可顯著降低大鼠肺組織中的NF-Bp65含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05，P0.001）；VOHS高、中、低劑量組均可降低大鼠肺組織中的磷酸化IкB-含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05，P0.01,P0.001）。

表1VOHS對ALI大鼠肺組織NF-Bp65及IкB-含量的影響（略）2.4.2VOHS對LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型肺組織中TNF-，IL1-含量的影響結(jié)果表明，造模各組與空白對照組比較，TNF-，IL1-含量明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.001）。

與模型對照組相比，VOHS各劑量組均可降低大鼠肺組織中IL1-和TNF-含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01，P0.001）。

結(jié)果見表2。

表2VOHS對ALI大鼠肺組織IL1-及TNF-含量的影響（略）3討論急性肺損傷(ALI)是臨床常見的危重病癥,其病理基礎(chǔ)是由多種炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)介導(dǎo)的肺臟局部炎癥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)失控所致的肺毛細(xì)血管膜損傷，是多器官功能障礙綜合征(MODS)或全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)中最常出現(xiàn)的一種器官組織損傷［4］。

革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分脂多糖(LPS)具有明顯的致ALI作用［5］。

LPS可引起中性白細(xì)胞(PMN)在肺內(nèi)聚集、激活,黏附于內(nèi)皮細(xì)胞,釋放氧自由基、蛋白水解酶等而參與ALI的發(fā)生［6］。

研究表明，LPS的這些作用是通過一系列細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)的［7］，其中NF-B信號通路是與機體免疫及炎癥反應(yīng)最為密切的相關(guān)的信號通路。

NF-B是一種幾乎存在于所有真核細(xì)胞中的核因子,對細(xì)胞的生長、分化、黏附、凋亡及炎癥反應(yīng)等具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。

典型的NF-B復(fù)合體由兩個亞單位P50、P65/c-Rel組成，并主要通過與其抑制蛋白IB緊密結(jié)合以無活性的形式存在于細(xì)胞漿中。

外源性損傷或毒性物質(zhì)(如細(xì)菌毒素)都可誘導(dǎo)NF-B的活化，進而調(diào)控免疫炎性基因的轉(zhuǎn)錄［8］。

細(xì)菌LPS通過與血漿中急性期蛋白的脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)形成LPS-LBP復(fù)合物,后者能與單核-巨噬細(xì)胞膜上的CD14受體緊密結(jié)合。

但是,CD14為糖基化磷脂酰肌醇膜蛋白,錨定在細(xì)胞膜上,無胞內(nèi)區(qū)不能獨立進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。

近年研究已經(jīng)證實,TOLL樣受體(toll-likereceptor,TLR)4在CD14和LBP存在時可作為LPS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,使TLR4聚合而活化,通過其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域募集細(xì)胞內(nèi)髓樣分化蛋白88(MyD88)和IL1受體相關(guān)激酶發(fā)生自身磷酸化,引發(fā)酶系級聯(lián)反應(yīng),使IB磷酸化與NF-B解離。

正常時，NF-B的P50、P65亞基與抑制性亞基IB形成三聚體存在于胞漿中。

IB磷酸化后被非特異性蛋白酶水解，從而使RelA蛋白的核定位信號暴露，導(dǎo)致NF-B被激活后轉(zhuǎn)位入核,活化后其亞基p50、p65由細(xì)胞質(zhì)進入細(xì)胞核內(nèi),與其目的靶基因的啟動子或增強子上特定的B系列特異結(jié)合，啟動和調(diào)控一系列參與炎癥反應(yīng)的炎癥因子基因表達（如促炎細(xì)胞因子、黏附分子、環(huán)氧化酶等）從而介導(dǎo)多種炎癥性疾病的產(chǎn)生［8］。

在機體對組織損傷和感染的炎癥反應(yīng)中，炎性細(xì)胞因子(IL1-、TNF-等）介導(dǎo)的反應(yīng)是創(chuàng)傷、感染反應(yīng)的基本部分，但在炎癥免疫反應(yīng)過程，機體在重度感染時，在內(nèi)毒素刺激下過量釋放IL1-、TNF-，進一步激活多形核白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)，形成瀑布效應(yīng)［10］，從而導(dǎo)致多臟器功能障礙及衰竭［11,12］，如能阻斷炎性細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生，則能阻止損害性炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。

本研究證實，LPS刺激后，大鼠肺組織中NF-BP65、磷酸化IB-、IL1-和TNF-含量顯著升高，這說明LPS可能通過NF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過度激活而誘導(dǎo)肺損傷。

而VOHS給藥各組大鼠肺組織中NF-B和磷酸化IB-含量顯著減少，同時IL1-和TNF-水平顯著降低。

可見VOHS可通過抑制IB的磷酸化，保護IB免于降解，而影響IB-與NF-B的解離，減少NF-B轉(zhuǎn)位、入核，并啟動炎癥因子相關(guān)基因，從而減少炎癥因子IL1-、TNF-表達，減輕肺組織損害。

因此我們推測，VOHS抑制NF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過度激活，進而減少炎癥介質(zhì)的合成和釋放，是其抗炎的作用機制之一。

關(guān)于VOHS對NF-B信號通路具體的作用機制還有待進一步研究。

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