25-血管內(nèi)皮祖細(xì)胞對共同植入缺血再灌注模型大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖

1/125-血管內(nèi)皮祖細(xì)胞對共同植入缺血再灌注模型大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、25-血管內(nèi)皮祖細(xì)胞對共同植入缺血再灌注模型大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞對共同植入缺血再灌注模型大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡和血管形成的調(diào)節(jié)富奇志1，齊志國1,朱曉峰2,謝鵬3(400016重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)：

第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科1，神經(jīng)科學(xué)中心3；154002黑龍江佳木斯，佳木斯大學(xué)神經(jīng)科學(xué)中心2)［提要］目的研究血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）與神經(jīng)干細(xì)胞（neuronstemcells,NSCs）構(gòu)建的復(fù)合移植體對移植入缺血再灌注模型大鼠缺血半暗帶的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡和血管重建的影響。

方法線栓法建大鼠腦缺血再灌注模型；血管內(nèi)皮祖細(xì)胞、層粘連蛋白和神經(jīng)干細(xì)胞構(gòu)建的移植復(fù)合體移入模型鼠腦缺血半暗帶；免疫組化觀察Brdu標(biāo)記的移入腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞和缺血半暗帶血管新生，免疫熒光雙標(biāo)觀察神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡情況。

結(jié)果移植后各時(shí)間點(diǎn)Brdu標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)NSCs+EPCs組明顯高于NSCs組（P0.05）；NSCs+EPCs組在各時(shí)間點(diǎn)的凋亡率明顯低于NSCs組（P0.05）；各時(shí)間點(diǎn)NSCs+EPCs組血管新生數(shù)量明顯多于EPCs組、缺血對照組和NSCs組（P0.05）。

結(jié)論血管內(nèi)皮祖細(xì)胞可以促進(jìn)移植入缺血再灌注模型大鼠缺血半暗帶的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，減少其凋亡；2種細(xì)胞共移植可以促進(jìn)缺血半暗帶的血管新生。

［關(guān)鍵詞］神經(jīng)干細(xì)胞；毛細(xì)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞；缺血再灌注［中圖法分類號］R322.81;R329.28;R743.31［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］AEndothelialprogenitorcellscombinedimplantationimprovesproliferationandsuppressesapoptosisofneuralstemcellsandangiogenesisofMCAO/RratsFuQizhi1,QiZhiguo1,ZhuXiaofeng2,XiePeng3(1DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospital,3NeuroscienceCenter,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400016;2NeuroscienceCenter,JiamusiUniversity,Jiamusi,HeilongjiangProvince,154002,China)［Abstract］ObjectiveToinvestigatetheeffectofendothelialprogenitorcells(EPCs)whichcomplexedwithneuronstemcells(NSCs)aftertransplantedintoischemiaandreperfusion(I/R)ratmodelontheproliferationandapoptosisoftheNSCsandvasalconstruction.MethodsTotally150SDadultmaleratswererandomlyandequallydividedinto5groups,shamoperationgroup,I/Rgroup,I/R+NSCsgroup,I/R+EPCsgroup,andI/R+NSCs+EPCsgroup.Theratswerefurtherdividedinto5subgroupsaccordingtothetimepointsof3,7,14,30and60daftertransplantation.I/Rratmodelwasestablishedbyreversiblyligatingmiddlecerebralarteryocclusion.NSCswerederivedfromthehippocampusofSDratsbornin24handidentifiedwithNestinstaining.EPCswereobtainedfromthearterybloodofSDratsandverifiedwithimmunocytochemicalstainingsofCD31,CD34andKDRafterculture.ThecomplexofNSCsandEPCswasproducedwithaidoflaminin.Thenthecomplexweretransplantedintotheischemiapenumbraofcorrespondingmodelratbrain.TheproliferationandapoptosisofNSCs,andthefomationofnewvesselswereobservedthroughimmunohistochemistryanddouble-labeledimmunofluorescencestaining.ResultsTheproliferationofNSCswasincreased,apoptosiscellsweredecreasedandthenewvesselswereraisedinthecomplextransplantationwhencomparedwithsingleNSCsorEPCstransplantationgroups.ConclusionThecomplexofNSCsandEPCstransplantationimprovestheproliferationofNSCs,suppressescellapoptosisandpromotestheformationofnewvessels.［Keywords］neuralstemcells;endothelialprogenitorcells;ischemicandreperfusionSupportedbytheNationalBasicResearchProgram(973Program,2009CB008300).Correspondingauthor:XiePeng,Tel:86-23-68485490,E-mail:xiepeng58@21cn.com________________________[基金項(xiàng)目]國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃，2009CB008300）[通信作者]謝鵬，電話：

(023)68485490，E-mail:xiepeng58@21cn.com缺血性腦血管病是人類腦血管疾病中高致死致殘率的疾病之一。

缺血性腦血管病包括兩大病理損害，即神經(jīng)元的缺損和局部血循環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞。

近年來，神經(jīng)再生和神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)為干細(xì)胞移植療法修復(fù)腦梗死病灶提供了依據(jù)[1]。

但NSCs移植后成活率和神經(jīng)元轉(zhuǎn)化率低嚴(yán)重制約了NSCs移植在臨床上的應(yīng)用[2]。

1997年，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)分離培養(yǎng)成功，并發(fā)現(xiàn)可以移植EPCs可以促進(jìn)血管重建。

研究發(fā)現(xiàn)，成人海馬與脈管系統(tǒng)相連的稠密叢中存在正在分裂的細(xì)胞，表明神經(jīng)再生的發(fā)生在血管生成的環(huán)境中，腦內(nèi)血管再生和神經(jīng)再生有緊密聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)研究血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞中間填充神經(jīng)間黏附因子形成微細(xì)胞團(tuán)移入缺血再灌注大鼠缺血半暗帶，觀察神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和凋亡情況及缺血半暗區(qū)血管形成情況，為二者聯(lián)合移植治療缺血性腦血管病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法1.1主要試劑和儀器成年雄性SD大鼠150只，實(shí)驗(yàn)動物包括兩組第一組新生24h內(nèi)SD大鼠60只和雄性SD大鼠20只（用于NSCs、EPCs原代細(xì)胞培養(yǎng)）成年雄性SD大鼠培養(yǎng)，以上動物均（由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，符合國家級動物標(biāo)準(zhǔn))，后者體質(zhì)量250～350g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血對照組、缺血后神經(jīng)干細(xì)胞移植組（NSCs組）、缺血后血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組（EPCs組）、缺血神經(jīng)干細(xì)胞加血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組（NSCs+EPCs組），各組又根椐移植后不同時(shí)間點(diǎn)分為3、7、14、30、60d5個(gè)亞組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。

1.2藥品及試劑M-199培養(yǎng)基、胎牛血清、纖維連接蛋白（FN）、VEGF、bFGF、兔抗大鼠CD31單克隆抗體、兔抗大鼠CD34單克隆抗體、兔抗大鼠KDR單克隆抗體、羊抗兔(二抗)免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒(以上購自美國Sigma公司)；5溴脫氧尿苷（BrdU）、小鼠抗巢蛋白（Nestin）單克隆抗體、表皮生長因子（EGF）、兔抗大鼠VEGF單克隆抗體、小鼠抗大鼠caspaseIgG、小鼠抗大鼠BrduIgG單克隆抗體、抗小鼠免疫組化試劑盒（購自晶美生物工程公司）；層粘連蛋白（LN）（購自美國Invitrogen公司）；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基(購自美國GibicoBRL公司)、SABCCY3試劑盒、B27(購自美國Boster公司)。

1.3大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定在無菌條件，取新生24h內(nèi)SD大鼠的海馬組織，剪碎后反復(fù)吹打，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，離心5min，棄上清，加入完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM/F12，2％B27，20g/L,EGF）1ml，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5108/L，加入25cm培養(yǎng)瓶中，放入適量完全培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件靜置培養(yǎng)7d，每隔2天換液1次，7d后傳代，傳3代后備用。

采用免疫組織化學(xué)法Nestin染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。

1.4EPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定參照Wang等[3]方法，抽取SD大鼠動脈血10～15ml，室溫下400r/min離心30min，吸出第2層的單核細(xì)胞層，然后用PBS清洗，細(xì)胞吹打成懸液后計(jì)數(shù)，將單核細(xì)胞以(1～3)105的密度，分別接種于鋪有FN的塑料培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)液，放入37℃，5%CO2，濕度100%細(xì)胞培養(yǎng)箱，每4天換液1次。

對培養(yǎng)的第4、7、10、14天的細(xì)胞，用甲醇固定2次，每次20min，胎牛血清工作液封閉非特異性抗原30min，分別加入鼠抗人CD31、CD34及兔抗人KDR單克隆抗體（1∶50），37℃孵育2h，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育20min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，DAB顯色。

封片后上鏡觀察。

1.5EPCs和NSCs共移植復(fù)合體構(gòu)建將傳代的EPCs用2.5g/L胰酶消化20min，輕輕吹打成單細(xì)胞，以3107/L的密度接種在培養(yǎng)瓶中，12h貼壁后吸出EPCs培養(yǎng)液，涂以一層細(xì)胞外基質(zhì)（層粘連蛋白）后接種經(jīng)1.25g/L胰酶消化20min后吹打成單細(xì)胞的NSCs（以Brdu標(biāo)記），密度為6108/L，加入NSCs完全培養(yǎng)液。

培養(yǎng)3～6h，經(jīng)鏡下觀察NSCs完全貼壁后吸出培養(yǎng)液，涂以一薄層細(xì)胞外基質(zhì)，再接種以上相同密度的EPCs，加入神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。

70ml培養(yǎng)瓶分別接種兩種細(xì)胞4ml，共培養(yǎng)12～24h，鏡下觀察最后接種的EPCs貼壁，并由消化后的圓形變?yōu)闄E圓或不規(guī)形。

用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從瓶壁上依次刮起，適力吹打成1～3個(gè)EPCs與5～18個(gè)NSCs相互包繞的細(xì)胞團(tuán)，用150目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，取濾液再用500目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，取篩網(wǎng)上細(xì)胞團(tuán)即為共移植復(fù)合體。

然后用免疫熒光方法進(jìn)行鑒定。

1.6大腦中動脈缺血/再灌注動物模型的制備除假手術(shù)組外，各組均采用Longa等[4]線栓法建立局灶性腦缺血再灌注動物模型。

手術(shù)結(jié)束麻醉清醒后，神經(jīng)缺損評分標(biāo)準(zhǔn)觀察大鼠神經(jīng)癥狀，選擇行走時(shí)身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈作為移植對象。

假手術(shù)組只麻醉，頸部皮膚切口，即縫合、不作其他處理。

1.7EPCs、NSCs及共移植復(fù)合體的移植體溶解于磷酸鹽緩沖液中，細(xì)胞濃度調(diào)整為21010/L。

EPCs組、NSCs組和NSCs+EPCs組分別移植3種細(xì)胞懸液10l在立體定位儀下，經(jīng)微量注射器進(jìn)行移植，移植速度為0.5l/min，在缺血側(cè)缺血半暗帶區(qū)(前囟后0.5mm，矢狀縫右旁開3.5mm)，垂直進(jìn)針，在進(jìn)針5.0min后緩慢推入細(xì)胞懸液，留針10min后緩慢拔針。

1.8神經(jīng)干細(xì)胞增殖和凋亡的檢測Brdu陽性細(xì)胞免疫組化檢測：

切片常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)，加入小鼠抗大鼠Brdu一抗（1∶100）4℃過夜，PBS沖洗；生物素化山羊抗小鼠IgG25℃孵育，PBS沖洗，DAB顯色，復(fù)染，鏡下計(jì)數(shù)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)。

免疫熒光雙標(biāo)染色：

石蠟切片，按常規(guī)下行入水，加Brdu（1∶100）抗體與Caspase3（1∶200）的組合抗體，4℃過夜，以含0.1%TritonX-100的PBS沖洗3次，加入CY3和FITC的二抗（CY3標(biāo)記Brdu，F(xiàn)ITC標(biāo)記Caspase-3），37℃孵育45min，0.05mol碳酸緩沖液甘油封固。

熒光顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

顯微鏡高倍視野(400)下，在缺血側(cè)皮質(zhì)隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞的平均數(shù)。

凋亡率=NSCs雙陽性熒光細(xì)胞/Brdu陽性熒光細(xì)胞100%1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以s表示，組間比較行方差分析及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果2.1EPCs、NSCs和共移植復(fù)合體鏡下所見及鑒定結(jié)果海馬NSCs原代分離后在12h內(nèi)單NSC相互聚集成云霧狀，4d時(shí)即可見大量細(xì)胞球，由幾十個(gè)到上百個(gè)懸浮生長的圓球形細(xì)胞組成，相差鏡下該細(xì)胞球立體感強(qiáng)，周邊光滑，但球中央可見細(xì)胞碎片摻雜。

經(jīng)傳代后雜質(zhì)減少以至消失，克隆后經(jīng)Nestin免疫熒光鑒定，陽性細(xì)胞球呈細(xì)胞。

新鮮分離的外周血單核細(xì)胞呈圓形，體積小浮在培養(yǎng)液中。

3～4d可見細(xì)胞開始增大貼壁，細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞呈梭形；7~10d出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞團(tuán)并呈典型線樣排列。

培養(yǎng)第4、7、10天時(shí)EPCsCD31、CD34及KDR免疫組化染色細(xì)胞呈陽性，10～14d細(xì)胞免疫熒光染色CD31、CD34及KDR表達(dá)在95%以上。

顯微鏡下可見共移植體細(xì)胞團(tuán)不規(guī)則，NSCs被EPCs包繞或相互粘貼，平均每個(gè)共移植體復(fù)合細(xì)胞數(shù)8～15個(gè)，其中EPCs平均2.8個(gè)。

免疫熒光可見紅色EPCs包被綠色NSCs，或相互粘貼（圖1）。

圖1免疫熒光觀察神經(jīng)干細(xì)胞和血管內(nèi)皮組細(xì)胞構(gòu)建的共移植復(fù)合體（熒光顯微鏡200）2.2NSCs增殖情況假手術(shù)組、缺血對照組和EPCs組各時(shí)間點(diǎn)未見Brdu陽性細(xì)胞；NSCs組和NSCs+EPCs組3、7dBrdu陽性細(xì)胞主要集中在針跡部位；14dBrdu陽性細(xì)胞數(shù)最多，散在分布，部分與周圍組織整合；30、60d陽性細(xì)胞數(shù)有所下降，細(xì)胞與周圍組織充分整合；各時(shí)間點(diǎn)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)NSCs+EPCs組明顯高于NSCs組（P0.05）（表1、圖2）。

表1NSCs組和NSCs+EPCs組移植后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖數(shù)比較（個(gè)，n=6，s）組別3d7d14d30d60dNSCs組20.963.5828.743.2539.285.5222.653.7810.252.63NSCs+EPCs組38.644.33b45.384.97a58.326.04a30.565.42a19.351.68ba：

P0.05，b：

P0.01，與NSCs組比較............................................................3討論神經(jīng)干細(xì)胞的移植在缺血性腦血管疾病治療中的作用已經(jīng)明確，但植入缺血區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞分發(fā)生依賴于bax基因啟動的凋亡和失巢凋亡。

其原因單純將神經(jīng)干細(xì)胞植入缺血半暗區(qū)，神經(jīng)干細(xì)胞不具備足夠的神經(jīng)因子分泌能力使細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)不足和細(xì)胞間微信號調(diào)節(jié)中斷而引發(fā)了相關(guān)基因表達(dá)。

這使神經(jīng)干細(xì)胞在缺血性腦血管疾病的應(yīng)用受到限制的主要因素。

Asahara等[5]首次從人外周血中分離EPCs，并可分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特殊血細(xì)胞，具有歸巢能力、分泌功能和參與出生后血管再生等特性。

Rehman等[6]研究發(fā)現(xiàn)EPCs能夠分泌多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子、粒細(xì)胞克隆刺激因子、粒巨細(xì)胞克隆刺激因子等。

其分化成熟后也可以分泌一些可溶性細(xì)胞因子，如胰島素樣生長因子（insulinlikegowthfactor1，IGF-1）、白細(xì)胞干擾素、血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、粒細(xì)胞克隆刺激因子等[7]。

在EPCs及其分化成熟細(xì)胞分泌的一些因子中，如胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖抑制其凋亡[8,9]。

層黏連蛋白是一種神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)，其對神經(jīng)干細(xì)胞有保護(hù)作用減少其凋亡，還模擬類神經(jīng)生長因子的營養(yǎng)神經(jīng)的作用，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并通過模擬體內(nèi)環(huán)境解決失巢凋亡的發(fā)生[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在早期將EPCs、層粘連蛋白和NSCs復(fù)合體移入大鼠缺血半暗帶后，神經(jīng)干細(xì)胞增殖較單純神經(jīng)干細(xì)胞移植增多且凋亡減少，這與EPCs的旁分泌和其與層黏連蛋白共同構(gòu)成神經(jīng)干細(xì)胞生存的微環(huán)境有關(guān)。

后期由于移入的內(nèi)皮祖細(xì)胞加快了腦缺血區(qū)血管重建的發(fā)生，進(jìn)一步改善了移入腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的生存條件。

本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在復(fù)合體移植1個(gè)月后腦缺血半暗區(qū)仍有移入的神經(jīng)干細(xì)胞增生，且凋亡細(xì)胞明顯少于單純神經(jīng)干細(xì)胞移植組。

血管新生和神經(jīng)再生是通過相同的因子進(jìn)行調(diào)控協(xié)同和信號的相互聯(lián)系，這些因子主要括包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子、IGF-1和轉(zhuǎn)化生長因子Q等，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的已知可作用于神經(jīng)元的有絲分裂原和分化存活的因子有bFGF、IGF-l、血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子和腦源性生長因子(brainderivedneurotrophicf-actor，BDNF)。

在血管新生中產(chǎn)生的神經(jīng)因子對神經(jīng)干細(xì)胞保護(hù)作用的同時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞分泌的因子如BDNF、膠質(zhì)源性生長因子和神經(jīng)因子等[11,12]，也可以促進(jìn)新生血管的形成。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EPCs、層黏連蛋白和神經(jīng)干細(xì)胞復(fù)合體移入缺血半暗帶后血管新生的度明顯高于單純EPCs移植。

這也說明血管新生和神經(jīng)發(fā)生具有協(xié)同作用。

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