GB∕ T 40255-2021 對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒病診斷規(guī)程 PCR檢測法（正式版）

GB/T40255—2021對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒病診斷規(guī)程PCR檢測法國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40255—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC156)歸口。本文件起草單位：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所、全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站。1GB/T40255—20211范圍本文件規(guī)定了對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒病診斷規(guī)程中普遍適用的核酸檢測技術(shù)的要求，針對(duì)肝胰腺細(xì)驗(yàn)步驟和結(jié)果判定。本文件適用于對(duì)蝦各生活期樣品中HPV帶毒情況的定性檢測，以進(jìn)行對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒病的2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文GB/T28630.4—2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第4部分：組織病理學(xué)診斷法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。bp:堿基對(duì)(basepair)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)HCl:鹽酸(hydrogenchloride)HPV:肝胰腺細(xì)小病毒(hepatopancreaticparvovirus)NaOH:氫氧化鈉(sodiumhydroxide)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸(sodiumdodecylsulfate)TE:Tris鹽酸和EDTA緩沖液(EDTATris·HCl)Tris:三羥甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)25.7Tirs飽和酚(pH≥7.8):分5.8酚/氯仿/異戊醇(25:24:1):分析純。5.9氯仿/異戊醇(24:1):分析純。5.1170%乙醇：按A.11配制。5.16引物HPV-F(10μmol/L):5'-GGT-GAT-GTG-GAG-GAG-AGA-3',-20℃保存。5.17引物HPV-R(10μmol/L):5'-GTA-ACT-ATC-GCC-GCC-AAC-3',-20℃保存。擴(kuò)增HPV核5.18內(nèi)參引物CF(10μmol/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3',-20℃保存。5.19內(nèi)參引物CR(10μmol/L):5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3',-20℃保存。擴(kuò)增十足目生物DNA中的848bp片段。6.7普通冰箱。37樣品8.1DNA的提取8.1.3將溶液冷卻至室溫，加入等體積平衡酚，顛倒混合10min,于10000r/min離心3min分離8.1.4水相移至新1.5mL離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),顛倒混合10min,于8.1.5水相移至一新1.5mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1),顛倒混合10min,于8.1.7用70%乙醇洗滌沉淀2次，每次10000r/min離心5min,小心棄掉上清，將沉淀于室溫晾干。8.1.8加入100μL滅菌雙蒸水溶解DNA。8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取試劑盒。4試劑試劑終濃度10×PCR緩沖液(無Mg2+)1×PCR緩沖液4mmol/LdNTPs(各2.5mmol/L)引物HPV-F(10μmol/L)引物HPV-R(10μmol/L)滅菌雙蒸水TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.02U/pL8.2.2將上述加有DNA模板的PCR管按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min、8.2.3每份樣品均設(shè)立十足目生物內(nèi)參對(duì)照，擴(kuò)增十足目生物組織DNA的PCR試劑25pL體系試劑終濃度10×PCR緩沖液(無Mg2+)1×PCR緩沖液dNTPs(各2.5mmol/L)內(nèi)參引物CF(10μmol/L)內(nèi)參引物CR(10μmol/L)滅菌雙蒸水TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.02U/μL8.3.3在1V/cm～5V/cm的電壓下電泳，使DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)。當(dāng)載樣緩沖液中5GB/T40255—2021十足目生物組織樣品在848bp處有特定條帶，陽性對(duì)照在628bp處有特定條帶，陰性對(duì)照在檢測樣品在628bp處有條帶，測序結(jié)果同參考序列(參見附錄C)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果符合的可判為PCR結(jié)果陽性；檢測樣品在628bp處無條帶可判為PCR結(jié)果陰性。6GB/T40255—2021試劑配方A.11mol/LTris·HCl(pH8.0)Tris水溶解后加入約42加水定容至800mLmL濃鹽酸調(diào)pH接近8.0,冷卻至室溫，再用2.5mol/LHCl調(diào)整pH至8.0。A.20.5mol/LEDTA(pH8.0)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?·2H?O)18.6gA.3TE緩沖液(pH8.0)1mol/LTris·HCl(pH8.0)2mLA.41mg/mL胰RNA酶A.510%SDSSDS微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，稱量時(shí)要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作臺(tái)區(qū)和天平上7A.6抽提緩沖液lmol/LTris·HCl(pH8.0)0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL加水定容至100mL混勻，室溫貯存。A.720mg/mL蛋白酶K蛋白酶K20mg溶解后分裝于1.5mL離心管中(0.25mL/管),—20℃下保存。乙酸銨77g加水定容至100mL,經(jīng)0.45μm濾膜過濾除菌。4℃貯存。A.950×電泳緩沖液Tris冰乙酸57.1mL0.5mol/LEDTA(pH8.0加水定容至1000mL室溫貯存。A.101×電泳緩沖液50×電泳緩沖液20mL加水定容至1000mL室溫貯存。無水乙醇70mL加水30mL,混勻，定容至100mL分裝后，室溫貯存。8GB/T40255—2021A.1210mg/mLEB貯存液磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解。室溫保存于棕色瓶或用鋁鉑包裹的瓶中。9GB/T40255—2021(資料性)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒病(Infectionwithhepatopancreaticparvovirusofpenaeidshrimp)是由肝胰腺細(xì)小病毒(HPV)感染引起的對(duì)蝦疾病，在病毒分類中屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae),濃核病毒亞科(Densovirinae)。HPV核酸為單鏈線性DNA,基因組大小約6kb,由單一核衣殼蛋白包裹。病毒粒子無囊膜，正二十面體形，直徑22nm～23nm?；蚪M有3個(gè)和1個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白——核衣殼蛋白。目前，GenBank數(shù)據(jù)庫中已提交的HPV全基因序列有5條，分別為泰國株(DQ002873)、澳大利亞株(DQ458781)、印度株(FJ410797)、中國株(GU371276)和韓國株(JN082231)。HPV不同地理株的基因序列分析數(shù)據(jù)表明HPV基因組存在較多的遺傳變異情況。自1984年新加坡首次報(bào)道HPV感染野生墨吉對(duì)蝦(Penaeusmerguiensis)以來，其他國家及地區(qū)細(xì)角濱對(duì)蝦(L.stylirostris)和羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii),在中國明對(duì)蝦中尤為常見。病毒感染可導(dǎo)致幼蝦死亡或引起矮小殘缺綜合征(RDS)。蟹類等其他甲殼類動(dòng)物也可攜帶并傳播該受感染宿主肝胰腺細(xì)胞內(nèi)可觀察到HPV病毒包涵體，宿主細(xì)胞細(xì)胞核形成“帽狀結(jié)構(gòu)”,伴隨在HPV包涵體旁。肝胰腺細(xì)小病毒PCR產(chǎn)物序列HPV-F61CACAAGACTCATATGTTCAGGAAGCCTGTATTTTTGACTAATCAGCATCACCCATTGGTA121GACATATCACATTATGATGACAGAAGAGCTATAGAGAATAGAAGTTTCATGTATAAAGTA181GAGTTAGGAAAGGAACCAGTAAATGCACATATAAAGTTTCCTAATAGGATGATTCCAATC241AAGAAGAACCAGAACTAACGCAGTTTGTATTGGCCAGCATGCAGTATGTTCATACAAACT301ATATGAACAGACCAGACAAGAAGTTTAAAATTGGATTTTTCAACAAGCTTTATGACGCGC361TGTTTGAGAACAGCTAAAACTATGTACGCAGGGTTCAAGTTTTCCCGGCATAAATAAAGT421GATAAGATAAGATTGAGAGTTTGAATATCCACGTCACACACAAAGGTAGTATACCATGAG481TCTAGTATGGGAGCAGTCGTATCTGCAGTT