分子生物學(xué)教案

第一章緒論

重點(diǎn)：1.分子生物學(xué)的基本含義

2.DNA的發(fā)現(xiàn)

3.分子生物學(xué)與其他學(xué)科的關(guān)系

難點(diǎn)：DNA的發(fā)現(xiàn)

課時分配：1.5學(xué)時

分子生物學(xué)的基本含義

分子生物學(xué)是從分子水平研究生命本質(zhì)為目的的一門新興邊緣學(xué)科,它

以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的

作用為研究對象，是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正在與其它學(xué)科廣泛交叉與

滲透的重要前沿領(lǐng)域。分子生物學(xué)的發(fā)展為人類認(rèn)識生命現(xiàn)象帶來了前所未

有的機(jī)會，也為人類利用和改造生物創(chuàng)造了極為廣闊的前景。

所謂在分子水平上研究生命的本質(zhì)主要是指對遺傳、生殖、生長和發(fā)

育等生命基本特征的分子機(jī)理的闡明，從而為利用和改造生物奠定理論基礎(chǔ)

和提供新的手段。這里的分子水平指的是那些攜帶遺傳信息的核酸和在遺傳

信息傳遞及細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間通訊過程中發(fā)揮著重要作用的蛋白質(zhì)等生物大分

子。這些生物大分子均具有較大的分子量，由簡單的小分子核甘酸或氨基

酸排列組合以蘊(yùn)藏各種信息，并且具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)以形成精確的相互作

用系統(tǒng)，由此構(gòu)成生物的多樣化和生物個體精確的生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)控

制系統(tǒng)。闡明這些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是分子生物學(xué)的主要任

務(wù)。

1.1引言

現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的目標(biāo)是要在分子水平上掌握細(xì)胞的功能并揭

不生命是本質(zhì)。

1.1.1創(chuàng)世說與進(jìn)化論

多少年來，人們常常會反復(fù)提出下面3個與生命和一切生物學(xué)現(xiàn)象有

關(guān)的問題：

(1)生命是怎樣起源的？

(2)為什么“有其父必有其子”？

(3)動、植物是怎樣從一個受精卵發(fā)育而來的？

對這些問題的回答：

創(chuàng)世說：

西方：上帝先創(chuàng)造了世間萬物，后來又創(chuàng)造了男人亞當(dāng)，再從亞當(dāng)身上

抽一根肋骨，這就成了女人夏娃，亞當(dāng)和夏娃繁衍了人類。

中國：女婿團(tuán)土造人

進(jìn)化論：

1859年，偉大的英國生物學(xué)家達(dá)爾文(CharlesDarwin)發(fā)表了著名的

《物種起源》一書，確立了進(jìn)化論的觀點(diǎn)。正是達(dá)爾文的生物進(jìn)化學(xué)說，打

破了上帝造人的傳統(tǒng)觀念，改變了社會對人類在整個世界中的地位的看法，

極大地推動了人類思想的發(fā)展。

達(dá)爾文用大量事實(shí)證明“物竟天擇，適者生存”的進(jìn)化論思想，他認(rèn)為

世界上的一切生物都是可變的，并預(yù)言從低級到高級的變化中必定有過渡物

種存在o他指出物種的變異是由于大自然的環(huán)境和生物群體的生存競爭造成

的，徹底否定了上帝創(chuàng)造萬物的舊思想，推翻了物種不變的神話，使生物學(xué)

真正邁入實(shí)證自然科學(xué)的行列。

1.1.2細(xì)胞學(xué)說

早期生物科學(xué)家的另一大貢獻(xiàn)是提出細(xì)胞理論(CellTheory)。17世紀(jì)

末，荷蘭籍顯微鏡專家Leeuwenhoek成功制作了世界上第一架顯微鏡。大

約與Leeuwenhoek同時代的Hooke,第一次用“細(xì)胞”這個概念來形容組成

軟木的最基本單元。

動、植物的基本單元是細(xì)胞，這是19世紀(jì)三大發(fā)現(xiàn)之一的細(xì)胞學(xué)說的

核心。建立這一學(xué)說的是德國植物學(xué)家Schleiden和動物學(xué)家Schwann?

1.1.3經(jīng)典的生物化學(xué)和遺傳學(xué)

現(xiàn)代生物學(xué)的兩大支柱：生物化學(xué)和遺傳學(xué)

進(jìn)化論和細(xì)胞學(xué)說相結(jié)合，產(chǎn)生了作為實(shí)驗(yàn)科學(xué)之一的現(xiàn)代生物學(xué)，

而以研究動、植物的遺傳變異規(guī)律為目標(biāo)的遺傳學(xué)和以分離純化、鑒定細(xì)胞

內(nèi)含物質(zhì)為目標(biāo)的生物化學(xué)則是這一學(xué)科的兩大支柱。

生物化學(xué)家Buchner第一個實(shí)現(xiàn)了用酵母無細(xì)胞液和葡萄糖進(jìn)行氧化

反應(yīng)，生成乙醇，證明化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換并不需要完整的細(xì)胞而僅僅需要細(xì)胞

中的某些成分。蛋白質(zhì)是生活細(xì)胞中所有化學(xué)反應(yīng)的執(zhí)行者和催化劑。

生物化學(xué)從一開始就執(zhí)行著雙重使命，首先，分析細(xì)胞的組成成分；

其次，弄清楚這些物質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)生命現(xiàn)象的聯(lián)系。

孟德爾通過豌豆實(shí)驗(yàn)，總結(jié)出生物遺傳的兩條基本規(guī)律一一基因分離

規(guī)律和自由組合規(guī)律，被公認(rèn)為經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基人。

在孟德爾遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上，美國著名的遺傳學(xué)家Morgan又提出了基因

學(xué)說。

當(dāng)所研究的兩個基因位于同一染色體上而距離又較近時，Morgan的連

鎖遺傳規(guī)律起主導(dǎo)作用；而當(dāng)所研究的兩個基因位于不同染色體上時，孟德

爾的自由組合規(guī)律起主導(dǎo)作用。

1.1.4DNA的發(fā)現(xiàn)

直到1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋模型之前，人們對于基

因的理解仍然是抽象的、概念化的，缺乏準(zhǔn)確的物質(zhì)內(nèi)容。

首次證明DNA是遺傳物質(zhì)的是Avery的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖1-1DNA是轉(zhuǎn)化源

早在1928年，英國科學(xué)家Griffith等人就發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌使小鼠死

亡的原因是引起肺炎。細(xì)菌的毒性是由細(xì)胞表面莢膜中的多糖決定的。具有

光滑外表的S型肺炎鏈球菌因?yàn)閹в星v膜而能使小鼠發(fā)病，具有粗糙外表的

R型肺炎鏈球菌因?yàn)闆]有莢膜而失去致病力，（莢膜多糖使細(xì)菌免受動物白

細(xì)胞的攻擊）。

首次用實(shí)驗(yàn)證明基因就是DNA分子的是美國著名的微生物學(xué)家Avery。

他和同事首先將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后在侵染小鼠，發(fā)現(xiàn)

這些死細(xì)菌自然喪失了致病力。再用活的粗糙型細(xì)菌（R型）來侵染小鼠，

也不能使之發(fā)病，因?yàn)榇植谛图?xì)菌無致病力。然而，當(dāng)他們將燒煮殺死的S

型細(xì)菌和活的R型細(xì)菌混合再感染小鼠時，小鼠死亡。解剖死鼠，發(fā)現(xiàn)有

大量活的S型細(xì)菌（而不是R型）。他們推測，死細(xì)菌中的某一成分——轉(zhuǎn)

化源將無致病力的細(xì)菌轉(zhuǎn)化成致病菌。10多年后，實(shí)驗(yàn)證明，DNA就是轉(zhuǎn)

化源。死細(xì)菌DNA指導(dǎo)了這一可遺傳的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致了小鼠死亡。

再次證明DNA是遺傳物質(zhì)的噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。

圖1-2

噬菌體專門寄生在細(xì)菌體內(nèi)，它的頭、尾外部都是由蛋白質(zhì)組成的外

殼，頭內(nèi)主要是DNA。噬菌體侵染細(xì)菌的過程可以分為以下5個步驟：

1.噬菌體用尾部的末端（基片、尾絲）吸附在細(xì)菌表面，

2.噬菌體通過尾軸把DNA全部注入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼則留在

細(xì)胞外。

3.噬菌體的DNA一旦進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，它就能利用細(xì)菌的生命過程合

成自身的DNA和蛋白質(zhì)。

4.新合成的DNA和蛋白質(zhì)能組裝成許許多多與親代完全相同的子代

噬菌體。

5.子代噬菌體由于細(xì)菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細(xì)菌。

1.2分子生物學(xué)簡史

分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其

重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)。

1.3分子生物學(xué)研究的內(nèi)容

現(xiàn)代生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，所有生物體中的有機(jī)大分子都是以碳原子為核

心，并以共價(jià)鍵的形式與氫、氧、氮及磷以不同的方式構(gòu)成的。不僅如此,

一切生物體中的各類有機(jī)大分子都是由完全相同的單體，如蛋白質(zhì)分子中的

20種氨基酸及DNA利RNA中的5種堿基組合而成，由此產(chǎn)生了分子生物

學(xué)的3條基本原理：

1.構(gòu)成生物體各類有機(jī)大分子的單體在不同生物中都是相同的。

2.生物體內(nèi)一切有機(jī)大分子的建成都遵循共同的規(guī)則。

3.某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了它的屬性。

從表面上看，分子生物學(xué)涉獵范圍極為廣泛，研究內(nèi)容似乎包羅萬象。

事實(shí)上，它所研究的不外乎以下四個方面：

1.DNA重組技術(shù)

2.基因表達(dá)調(diào)控

3.生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能

4.基因組、功能基因組與生物信息學(xué)

分子生物學(xué)與其他學(xué)科的關(guān)系

分子生物學(xué)是由生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、

以至信息科學(xué)等多學(xué)科相互滲透、綜合融會而產(chǎn)生并發(fā)展起來的，凝聚了不

同學(xué)科專長的科學(xué)家的共同努力。它雖產(chǎn)生于上述各個學(xué)科，但已形成它獨(dú)

特的理論體系和研究手段，成為一個獨(dú)立的學(xué)科。

生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切。兩者同在我國教委和科委頒布的

一個二級學(xué)科中，稱為“生物化學(xué)與分子生物學(xué)”，但兩者還是有區(qū)別的。

生物化學(xué)是從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，它著重研究生物體內(nèi)各種生物

分子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)變與新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學(xué)的中心內(nèi)容是代謝，包括糖、

脂類、氨基酸、核甘酸、以及能量代謝等與生理功能的聯(lián)系。分子生物學(xué)則

著重闡明生命的本質(zhì)一一主要研究生物大分子核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、

生命信息的傳遞和調(diào)控?！秶H生物化學(xué)學(xué)會》和《中國生物化學(xué)學(xué)會》

現(xiàn)均已改名為《國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會》和《中國生物化學(xué)與分子

生物學(xué)學(xué)會》。

細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切。傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)主要研究

細(xì)胞和亞細(xì)胞器的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能。細(xì)胞作為生物體基本的構(gòu)成單位是由

許多分子組成的復(fù)雜體系，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下所見到的規(guī)則結(jié)構(gòu)是

各種分子有序結(jié)合而形成的。探討組成細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)比單純觀察大體結(jié)構(gòu)

能更加深入認(rèn)識細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，因此現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展越來越多地

應(yīng)用分子生物學(xué)的理論和方法。分子生物學(xué)則是從研究各個生物大分子的結(jié)

構(gòu)入手，但各個分子不能孤立發(fā)揮作用，生命絕非組成成分的隨意加和或混

合，分子生物學(xué)還需要進(jìn)一步研究各生物分子間的高層次組織和相互作用，

尤其是細(xì)胞整體反應(yīng)的分子機(jī)理，這在某種程度上是向細(xì)胞生物學(xué)的靠攏。

分子細(xì)胞學(xué)或細(xì)胞分子生物學(xué)就因此而產(chǎn)生，成為人們認(rèn)識生命的基礎(chǔ)。

由于分子生物學(xué)涉及認(rèn)識生命的本質(zhì)，它也就自然廣泛的滲透到醫(yī)學(xué)各

學(xué)科領(lǐng)域中，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的基礎(chǔ)。在醫(yī)學(xué)各個學(xué)科中，包括生理學(xué)、

微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)以及臨床各學(xué)科分子生物學(xué)都正在廣泛

地形成交叉與滲透，形成了一些交叉學(xué)科，如分子免疫學(xué)、分子病毒學(xué)、分

子病理學(xué)和分子藥理學(xué)等，大大促進(jìn)了醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

1.4分子生物學(xué)展望（自學(xué)內(nèi)容）

第二章染色體與DNA

重點(diǎn)：1.原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

2.DNA的修復(fù)

難點(diǎn)：1.DNA的修復(fù)

2.DNA的轉(zhuǎn)座

課時分配：3.5學(xué)時

第四節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

一.原核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

大腸桿菌基因組以雙鏈環(huán)狀DNA分子的形式存在，其DNA復(fù)制的之間產(chǎn)

物可形成一個。，復(fù)制從定點(diǎn)開始雙向等速進(jìn)行。

1.大腸桿菌DNA復(fù)制起始點(diǎn)（oriC）保守序列分布圖（圖2-21）

2.由大腸桿菌oriC復(fù)制起始點(diǎn)出引發(fā)的DNA復(fù)制過程

（a）大約有20個DnaA擔(dān)保在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保

守序列相結(jié)合；（b）在HU蛋白和1ATP的共同作用下，DnaA復(fù)制起始復(fù)合物

使3X13bp直接重復(fù)序列變性，形成開鏈；（c）DnaB（解鏈酶）六體分別與

單鏈DNA相結(jié)合，（需要DnaC的幫助），進(jìn)一步解開雙鏈。在一些重要的酶

和蛋白質(zhì)的相互作用下，DNA開始復(fù)制。

3.參與DNA復(fù)制的酶和蛋白因子

（1.）DNA解鏈酶（Helicase）

促使DNA在復(fù)制叉處打開雙鏈，與單鏈DNA結(jié)合，與ATP結(jié)合，分

解成ADP+Pi,產(chǎn)生能量沿DNA鏈向前運(yùn)動，促使DNA雙鏈解開。

(2)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSBP)

與單鏈DNA結(jié)合，防止解開的單鏈重新配對形成雙鏈或被核酸酶降

解;使單鏈DNA呈伸展?fàn)顟B(tài)，無彎曲和結(jié)節(jié)，利于作為模板；

SSBP可重復(fù)使用。

原核生物的SSBP具有協(xié)同效應(yīng)。

SSBP只保持單鏈的存在，并不能起解鏈的作用。

(3)拓?fù)洚悩?gòu)酶Topoisomerase----解開負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共

同作用解開雙鏈。

(4)引物酶Primase

催化引物RNA分子的合成

(5)DNA聚合酶DNAPolymerase

A.概念：是指以脫氧核甘三磷酸作為底物催化合成DNA的一類酶。

B.特點(diǎn):

a.以dNTP為前體催化合成DNA；

b.需要模板和引物；

c.催化dNTP加到DNA鏈的3'-0H端;

d.催化合成方向5'f3'。

C.分類：

DNA聚合酶I(主要保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性)

DNA聚合酶II(主要起DNA修復(fù)的作用)

DNA聚合酶III(DNA復(fù)制的主導(dǎo)酶)

(6)DNA連接酶

將雙鏈DNA上的切口連接起來；

主要用于岡崎片段的連接，DNA修復(fù)、重組，兩個復(fù)制單元間片段

的連接。

連接雙鏈DNA的要求：

切口

3，-0H

5'-磷酸基團(tuán)

需要能量

4.岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制

由于DNA的兩條鏈為反向平行，以復(fù)制叉移動的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，一條鏈為

3'-5'，其新合成的DNA鏈沿5'-3'連續(xù)進(jìn)行一一前導(dǎo)鏈

另一條鏈為5'-3'，新生的DNA鏈先合成短的岡崎片段，不連

續(xù)合成一一滯后鏈，再由DNA連接前連接成完整的DNA鏈。

這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制稱為半不連續(xù)復(fù)制。

5.復(fù)制的引發(fā)和終止

（1）引發(fā)

先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從

RNA引物的3'端開始合成新的DNA鏈。

滯后鏈的引發(fā)由引發(fā)體來完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n'、n"、

DnaB、C和I共同組成。引發(fā)體在滯后鏈分叉的方向上移動，并在模板上斷

斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成滯后鏈的RNA引物，，再由DNA聚合酶HI作用合成DNA,

直到遇到下一個引物或?qū)槠螢橹?。RNaseH降解RNA引物，DNA聚合酶

I將缺口補(bǔ)齊，DNA連接酶將兩個岡崎片段連在一起形成大分子DNA?

（2.）終止

（圖2-23）

當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止序列（Ter）時，Ter-Tus復(fù)

合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后，在拓?fù)洚悩?gòu)

前IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA,

二.真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)

1.與原核生物相似

（1）半保留、半不連續(xù)復(fù)制

（2）復(fù)制過程：引發(fā)一延伸一終止三個階段

（3）需要酶和蛋白因子

2.與原核生物不同

（1）原核生物是單復(fù)制子，真核生物是多復(fù)制子（每條染色體上有多個

復(fù)制起點(diǎn)）;

（2）DNA全部復(fù)制完畢才進(jìn)行第二輪復(fù)制，原核生物在第一輪復(fù)制未完

成就進(jìn)行第二輪復(fù)制。

（3）有5種DNA聚合酶，即聚合酶a、B、丫、8、eo

3.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控（3個水平）

真核細(xì)胞的生活周期可以分為4個時期：G”S、G?和M期。Gi是復(fù)制

預(yù)備期，S期是復(fù)制期，的是有絲分裂準(zhǔn)備期，M期為有絲分裂期。DNA復(fù)

制只發(fā)生在S期。

（1）細(xì)胞生活周期水平調(diào)控（決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入S期）

許多外部因素和細(xì)胞因子參與限制點(diǎn)調(diào)控。促細(xì)胞分裂劑、致癌劑等都

可以誘發(fā)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。一些細(xì)胞質(zhì)因子如四磷酸二腺首和聚ADP-

核糖也可誘導(dǎo)DNA復(fù)制。

（2）染色體水平調(diào)控（決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子

按一定順序在S期起始復(fù)制。這種有序復(fù)制的機(jī)理還不清楚。

（3）復(fù)制子水平調(diào)控（決定復(fù)制的起始與否）

這種調(diào)控從單細(xì)胞到多細(xì)胞生物是高度保守的。

第五節(jié)DNA的修復(fù)

1.錯配修復(fù)

該系統(tǒng)識別母鏈的依據(jù)來自Dam甲基化酶，它能使位于5'GATC序列

中腺甘酸的曲位甲基化。一旦復(fù)制叉通過復(fù)制起使點(diǎn)，母鏈就會在幾秒至

幾分鐘內(nèi)被甲基化。此后，只要兩條DNA鏈上出現(xiàn)堿基配對錯誤，錯配修復(fù)

系統(tǒng)就會根據(jù)“保存母鏈，修正子鏈”的原則，找出錯誤堿基所在的DNA

鏈，并在對應(yīng)于母鏈甲基化腺甘酸上游鳥甘酸的5'位置切開子鏈，再根

據(jù)錯誤堿基相對于DNA切口的方向啟動修復(fù)，合成新的子鏈片段。

（圖2-25）（a）發(fā)現(xiàn)堿基錯配；（b）在水解ATP的作用下，MutS,

MutL與堿基錯配位點(diǎn)的DNA雙鏈相結(jié)合；（c）MutS-MutL在DNA雙鏈上移動，

發(fā)現(xiàn)甲基化DNA后由MutH切開非甲基化的子鏈。

（圖2-26）當(dāng)錯配堿基位于切口3'下游端時，在MutS-MutL、解鏈酶

II、DNA外切前VII或RecJ核酸沒的作用下，從錯配堿基3'下游端開始切除

單鏈DNA直到原切口，并在polIII和SSB的作用下合成新的子鏈片段。若

錯配堿基位于切口5'端上游時，則在DNA外切酶I或X的作用下，從錯配

堿基位5'上游端開始切除單鏈DNA直到原切口，再合成新的子鏈片段。

2.堿基切除修復(fù)

AP位點(diǎn)：由糖甘水解酶切除受損核甘酸上的N-B-糖昔鍵，在DNA

鏈上形成的去喋吟或去喀咤位點(diǎn)。

DNA分子中一旦產(chǎn)生了AP位點(diǎn)，AP核酸內(nèi)切酶就會把受損核首

酸的糖昔磷酸鍵打開，并移去包括AP位點(diǎn)核甘酸在內(nèi)的小片段DNA,由DNA

聚合酶I合成新的片段，最終由DNA連接酶把兩者連成新的被修復(fù)的DNA

鏈。

3.核甘酸切除修復(fù)

當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核甘酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無法形成氫

鍵，則由核甘酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)修復(fù)。

損傷發(fā)生后，首先由DNA切割醐在已損傷的核昔酸5'和3'分別切開磷

酸糖甘鍵，產(chǎn)生一個由12sl3（原）或27s29（真）個核甘酸的小片段，

移去小片段后由DNA聚合酶1（原核）或e（真核）合成新的片段，并由DNA

連接酶完成最后修復(fù)。

（圖2-28）在原核生物中，DNA切割酶從受損核甘酸3'端的第5

位和5'端的第8位切開磷酸糖甘鍵。在人類細(xì)胞中，DNA切割酶從受損核

甘酸3'端的第6位和5'端的第22位切開磷酸糖昔鍵。

4.DNA的直接修復(fù)

是在DNA光解酶的作用下把在光下或紫外光照射形成的胸腺喀咤二聚

體等還原成單體的過程。

第六節(jié)DNA的轉(zhuǎn)座

DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位，是由可移位因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。

與DNA的同源重組相比，頻率較低，但有重要的生物學(xué)意義，可以解釋基因

缺失或倒轉(zhuǎn)現(xiàn)象，可被用于構(gòu)建新的突變體。

1.轉(zhuǎn)座子（Transposon,Tn）

能夠進(jìn)行復(fù)制并將一個拷貝插入新位點(diǎn)的DNA序列。（能在基因組中

移動的DNA序列叫轉(zhuǎn)位因子)由于它可以從染色體基因組上的一個位置轉(zhuǎn)

移到另一個位置，甚至在不同的染色體之間躍遷所以又稱跳躍基因

(jump-gene)?最簡單的轉(zhuǎn)座子不含任何宿主基因而常被稱為插入序列

(insertionalsequence,IS)?轉(zhuǎn)座子常常被定位特定的基因中，造成該

基因突變。

存在：

原核生物、植物中廣泛存在，少數(shù)存在于動物中。

2.轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(圖2-31)

(1)兩端存在末端重復(fù)序列(TIR),是轉(zhuǎn)位過程中至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)；

(2)絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)位因子含有開放閱讀框，(ORF),編碼一個轉(zhuǎn)位酶，促進(jìn)

轉(zhuǎn)位因子的轉(zhuǎn)位；

(3)受體DNA在接受插入DNA后，在插入序列的兩側(cè)形成同向重復(fù)序列；

(4)受體(靶序列)沒有確定的特異性，但趨向于一個“熱點(diǎn)”區(qū)域一

即所謂“區(qū)域性優(yōu)先”。取決于DNA雙螺旋狀態(tài)，或DNA-PRO結(jié)合狀態(tài)。

IS序列都是一些小的DNA片段，末端具有倒置重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座時往往

復(fù)制宿主靶位點(diǎn)一小段(4-15bp)DNA,形成位于IS序列兩端的正向重復(fù)。

3.轉(zhuǎn)位機(jī)制：

轉(zhuǎn)座子的復(fù)制

靶序列的斷裂及倍生一一同向重復(fù)序列

轉(zhuǎn)位是一種復(fù)制過程。

4.轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)

(1)轉(zhuǎn)座引起插入突變

各種IS、Tn轉(zhuǎn)座子都可以引起插入突變。如果插入位于某操縱子的前

半部分，就可能造成極性突變，導(dǎo)致該操縱子后半部分結(jié)構(gòu)基因表達(dá)失活。

(2)轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因

如果轉(zhuǎn)座子上帶有抗藥性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突

變，同時也使這個位點(diǎn)產(chǎn)生抗藥性。

(3)轉(zhuǎn)座產(chǎn)生染色體畸變(2-35)

當(dāng)復(fù)制性轉(zhuǎn)座發(fā)生在宿主DNA原有位點(diǎn)附近時，往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子兩個拷

貝之間的同源重組，引起DNA的缺失或倒位。若同源重組發(fā)生在兩個正向重

復(fù)之間，就導(dǎo)致宿主染色體DNA缺失；若重組發(fā)生在兩個反向重復(fù)轉(zhuǎn)座區(qū)之

間，則引起染色體DNA倒位。

(4)轉(zhuǎn)座引起生物進(jìn)化

由于轉(zhuǎn)座作用，使一些原來在染色體上相距甚遠(yuǎn)的基因整合到一起，構(gòu)

建成一一操縱子或表達(dá)單元，也可能產(chǎn)生一些具有新的生物學(xué)功能的基因和

新的蛋白質(zhì)分子。

5.真核生物中的轉(zhuǎn)座子

(1)玉米中的轉(zhuǎn)位因子

分兩類：

自主轉(zhuǎn)位因子一一本身可以轉(zhuǎn)位；

非自主轉(zhuǎn)位因子一一本身不能轉(zhuǎn)位，但在自主因子存在下可以轉(zhuǎn)位.

最早于20世紀(jì)40年代由美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室B.MeClintock發(fā)現(xiàn)玉米的

顏色變化與某些基因的關(guān)啟有關(guān)，而這些基因的關(guān)啟可能與某些因子的控制

有關(guān)，而這些因子在基因組中是可以移動的一一控制因子。當(dāng)時這一發(fā)現(xiàn)并

沒有引起人們的注意；直到70年代Shapiro發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的乳糖操縱子

的突變是由于插入了一段序列，后來又發(fā)現(xiàn)了其它轉(zhuǎn)位因子后，McClintock

的發(fā)現(xiàn)才被重視；

1983年Clintock榮獲諾貝爾生物學(xué)醫(yī)學(xué)獎。

第五章分子生物學(xué)技術(shù)

重點(diǎn)：1.DNA操作技術(shù)

2.基因克隆的主要載體系統(tǒng)

難點(diǎn)：1.DNA操作技術(shù)

2.基因克隆的主要載體系統(tǒng)

課時分配：5學(xué)時

第一節(jié)重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件

1.基因操作genemanipulation

主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)

化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子

生物學(xué)研究的核心技術(shù)。

2.基因工程geneticengineering

將外源DNA,通過具有復(fù)制能力的載體分子形成重組DNA分子，導(dǎo)入

受體細(xì)胞，進(jìn)行持久穩(wěn)定的復(fù)制和表達(dá)，使受體細(xì)胞產(chǎn)生外源DNA或蛋白

質(zhì)。是核酸操作技術(shù)的一部分。

3.二十世紀(jì)分子生物學(xué)的三大成就

（1）20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA

而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；

（2）50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制，解

決了自我復(fù)制和世代交替問題；

（3）50年代至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，成功地

破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制O

4.DNA重組技術(shù)recombinantDNAtechnique

其核心是用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶對DNA分子進(jìn)行體外切

割與連接。

5.重組DNA技術(shù)史上的主要事件?1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)

?1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白

藥物

?1982第一個基因工程藥物一重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

?1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚

,1993基因工程西紅柿在美國上市

?1997英國愛丁堡羅斯林研究所多莉羊

?1999.9中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測定人類基因組全部

序列的1%

?2000.6.26科學(xué)家公布人類基因組工作草圖

?2001.2.11公布人類基因組基本信息

6.生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程

第二節(jié)DNA操作技術(shù)

一.DNA的分離，提取

1.材料的選擇：物種、組織的選擇

2.組織勻漿：細(xì)胞分散、破碎

3.破碎細(xì)胞：SDS表面活性劑

4.除蛋白：蛋白酶K、酚、氯仿抽提

5.除RNA：RNA酶

6.DNA回收：乙醇、異丙醇沉淀7.純度鑒定：(1)電

泳：常用瓊脂糖凝膠電泳，也用聚丙烯酰胺凝膠電泳，用澳化乙錠(EB)

染色，紫外燈下檢測。

檢測量可達(dá)ug,ng級

檢測信息：DNA的有無

DNA的大小

構(gòu)象

純度

(2)純度檢測:

紫外吸收法(260nm)

OD26O■???決定DNA的量

OD28O決定Protein的量

1.8WOD260/280<2.0純樣品

<1.8不純

》2.0RNA(純)

二.限制性內(nèi)切酶圖譜

(1)限制性內(nèi)切醐的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(SnMth)和內(nèi)森斯(Nathans),獲1978年諾貝爾

生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。

?1967年，Smith,分析限制性內(nèi)切酶的識別和切割序列，認(rèn)為它由5-6

個堿基組成?原因：限制性酶將T7DNA切成平均長度為1000堿基的片段。

?識別和切割序列:中心對稱的回文結(jié)構(gòu)。?限制性酶：Hindll-Nathans：

用限制性酶切割猴子SV40DNA,DNA測序。

(2)限制性內(nèi)切酶的定義：特異性的識別某些核酸序列，并將切斷的酶(雙

鏈)。

(3)DNA物理圖譜：

定義:指DNA鏈的限制性醐切片段的排列順序,即酶切片段在DNA鏈上

的定位。

(4)意義：

基因定位

基因重組

剪接

DNA測序

三.DNA突變分析

1.DNA-RNA-Protein-性狀堿基改變后，或會影響蛋白質(zhì)的

形成，一關(guān)鍵部位，或無改變——非關(guān)鍵部位。

2.DNA結(jié)構(gòu)變化：點(diǎn)突變、缺失、擴(kuò)增

3.RFLP—限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RestrictionFragmentLength

Polymorphisms)

制作方法：前切一電泳一(轉(zhuǎn)膜一雜交)一分析

4.AFLP—擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析(AmplifiedFragmentLength

Polymorphism)

制作方法：酶切一加接頭一PCR—電泳一分析。

RFLP、AFLP用于突變分析的局限性：突變必須發(fā)生于酶

切位點(diǎn)區(qū)域，否則檢測不到。

5.SSCP—單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Singlestrandconformation

polymorphism)

(1)基本原理：

單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)

部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或

多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA

分子在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率不同。

(2)基本過程是：

①PCR擴(kuò)增靶DNA;

②PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性；

③聚丙烯酰胺凝膠電泳；

④顯色分析結(jié)果.

若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該

鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變.

(3)局限性：

只有突變位點(diǎn)影響其空間構(gòu)象才能被檢出來。檢出率：70%

6.DGGE—變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradientGel

Electrophoresis)

DNA片段在變性劑梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳，凝膠中自上而下所含

變性劑濃度呈梯度增加。DNA片段在進(jìn)入變性劑某一濃度時，此濃度下

DNA片段在最低溫度解鏈區(qū)域解鏈(Tm值)，此時DNA分子成分枝狀結(jié)構(gòu)，

它使DNA分子在膠中的移動減慢。如果梯度條件選擇恰當(dāng)，因單個堿基變

化使不同的DNA片段在凝膠中的不同位置分叉，隨后DNA片段移動減慢,

從而使DNA片段最終分離開來。

變性梯度膠凝電泳能夠?qū)⒕哂袉蝹€堿基差別的DNA分子分離開來。點(diǎn)

突變檢出率可達(dá)100%,但操作復(fù)雜，技術(shù)要求較高。

四.核酸的凝膠電泳

自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按相對分子質(zhì)量大

小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析重組DNA分子及蛋

白質(zhì)與核酸相互作用的重要手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方

法，如DNA分型、DNA核甘酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制

性內(nèi)切酶作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。

1.基本原理

帶有電荷的分子在電場作用下的遷移速度，叫電泳的遷移率，它與電

場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，在無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支

持介質(zhì)中，與分子的摩擦系數(shù)成反比。也就是說，電場強(qiáng)度越大，電泳分子

所攜帶的凈電荷數(shù)越多，分子越小，其遷移的速度越快，反之越慢。因此，

根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所攜帶的凈電荷數(shù)的多寡，便

可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分分離開來。核酸帶負(fù)

電荷，放置在電場中，會向正極方向遷移。相同堿基數(shù)量的雙鏈DNA分子

兒乎帶有等量的凈電荷，能以同樣的速度向正極方向遷移。在一定電場強(qiáng)度

下，電泳的遷移率取決于核酸分子大小和構(gòu)型，可以通過電泳將核酸分子混

合物中大小不同的片段分離開來。

2.瓊脂糖凝膠電泳

(1.)凝膠的分辨能力同凝膠的濃度和類型有關(guān)。

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，從紅色海澡產(chǎn)物瓊脂中提取出來?將

瓊脂糖粉末加熱到熔點(diǎn)后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)，其密度由瓊脂

糖的濃度決定。

凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其

分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力就隨之減弱。

(2)瓊脂糖凝膠的分辨范圍：0.2~50kb

(3)聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍：l~1000bp

(4.)澳化乙錠染色

在凝膠電泳中，加入適量嗅化乙錠染料對核酸分子進(jìn)行染色，然后將

電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA

的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05ug的微量DNA,也可以被清晰

地檢測出來。濱化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA

分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。把含有

DNA分子的凝膠浸泡在溪化乙錠的溶液中，或是將澳化乙錠直接加到DNA的

凝膠介質(zhì)中，此種染料便會在一切可能的部位與DNA分子結(jié)合，然而卻不能

與瓊脂糖凝膠或聚內(nèi)烯酰胺凝膠相結(jié)合，因此，只有DNA分子能吸收澳化乙

錠并發(fā)出熒光。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光強(qiáng)度與DNA片段的大小或數(shù)量成

正比。

五.核酸的分子雜交

將帶有互補(bǔ)的特定核甘酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的

同源片段就會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，

所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來

源的DNA分子，其親緣關(guān)系較為密切；反之，其親緣關(guān)系則比較疏遠(yuǎn)。因此,

DNA/DNA的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)

系，而DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的

位置。

1.Southernblotting雜交中常用的濾膜：尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜、

二乙氨基乙基纖維素濾膜

2.主要步驟：

（1）將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上

（2）將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標(biāo)記的DNA或RNA

探針進(jìn)行雜交。

雜交的具體步驟是將含有經(jīng)電泳分離的不同相對分子質(zhì)量DNA片段的

瓊脂糖凝膠，通過堿變性等預(yù)處理之后平鋪在已用電泳緩沖液飽和了的濾紙

上，在凝膠上部覆蓋一張待用的濾膜。接著加一疊干濾紙，最后再壓上一重

物。這樣，由于干濾紙的吸引力，凝膠中的單鏈DNA便隨著電泳緩沖液一起

轉(zhuǎn)移。這些DNA分子一旦與濾膜接觸，就會被吸附在上面，而且嚴(yán)格地保留

了它們在凝膠中的譜帶模式。在80℃下烘烤或用紫外線膠聯(lián)發(fā)，就能將DNA

片段永久地固定在濾膜上（圖5-6）。然后，將濾膜放到加有放射性同位素

標(biāo)記的探針溶液中進(jìn)行雜交。這些探針是與被吸印DNA序列互補(bǔ)的RNA或單

鏈DNA,一旦與濾膜上的單鏈DNA雜交之后，就很難再解鏈。因此，可以用

漂洗法去掉游離的沒有雜交上的探針分子，用X底片暴光后得到放射自顯影

圖片。

六.細(xì)菌轉(zhuǎn)化

1.轉(zhuǎn)化作用transformation

通過自動獲取或人為地供給外源DNA使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得

新的遺傳表型

的過程.

2.基本過程

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一中細(xì)菌由于捕獲了來自另--種細(xì)菌菌株的DNA

而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫供體菌

株，接受轉(zhuǎn)化DNA的菌株則被稱為受體菌株。

大腸桿菌是細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)這的常用材料。將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)

低溫(0℃)預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液這，便會造成細(xì)胞膨脹，并與轉(zhuǎn)化混

合物中的外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。立即將該體系轉(zhuǎn)移到42℃

下作短暫的熱處理，復(fù)合物并會被細(xì)胞所吸收。在全培養(yǎng)基中生長一段時間

使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，就可涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化因子。

利用噬菌體顆粒能夠有效地將DNA注入寄主細(xì)胞中這一特點(diǎn)，科學(xué)家又

發(fā)明了重組體DNA分子的體外包裝法。經(jīng)包裝的基因工程噬菌體能夠借助細(xì)

菌表面的噬菌體接受器位點(diǎn)將DNA注入受體細(xì)菌，并在這些細(xì)胞中得到繁殖

和表達(dá)。

七.核昔酸序列分析

DNA測序(Sequence)

基本原理：先進(jìn)行末端標(biāo)記，作為長度參考位置，把核甘酸的序列測定。

1.Sanger雙脫氧鏈終止法

1977年，英國劍橋生化學(xué)家Sanger等人發(fā)明。

Sanger首先提出“加減法”，后又對其進(jìn)行了改進(jìn)一雙脫氧鏈終止法

原理：利用DNA聚合酶I的聚合反應(yīng)，在反應(yīng)混合物中加入模板、放

射性標(biāo)記的引物，DNA聚合酶I和四種dNTP,另外加入一定比例的2',

3'-ddNTP,當(dāng)合成時ddNTP參與后，鏈將不能再延伸而停止。

注意：樣品中加入一定比例的ddNTP。dNTP/ddNTP=1：50或1：

100

該方法又叫引物合成法或酶催引物合成法。它利用了DNA聚合酶所具

有的兩種酶催化反應(yīng)的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈DNA作為模

板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2',3'-雙脫

氧核甘酸作為底物，將其摻入到寡核甘酸鏈的3'-末端，從而終止DNA鏈

的生長。

在DNA測序反應(yīng)中，加入模板DNA、特意性引物、DNA聚合酶、dNTP

和一種ddNTP,當(dāng)這種2',3'-ddNTP(圖5-9,ddTTP)摻入到寡核昔

酸鏈的生長末端，取代了dTTP之后，由于ddTTP沒有3'-末端，寡核甘

酸鏈不再繼續(xù)延長，在本該由dTTP摻入的位置上發(fā)生了鏈有效終止。如果

在同一個反應(yīng)中，加入一種帶32P放射性標(biāo)記的dNTP。那么，經(jīng)過適當(dāng)?shù)?/p>

溫育之后，將會產(chǎn)生不同長度的DNA片段混合物，它們都具有同樣的5'-

末端，并在3'-末端的ddNTP處終止。將這種混合物加到變性凝膠上進(jìn)行

電泳分離，就可以獲得一系列全部以3'-末端ddNTP為終止殘基的DNA

片段的電泳譜帶模式。分別加入ddATP、ddGTP和ddCTP,在不同的試管中

溫育后，點(diǎn)樣于同一變性凝膠上進(jìn)行電泳分離，再通過放射自顯影的方法檢

測單鏈DNA的放射性帶，就利益直接讀出DNA的核甘酸序列。

（圖5T0）在每一個凡庸管中，都加入一種互不相同的ddNTP和全部

種dNTP,其中一種帶有32P放射性標(biāo)記。反應(yīng)混合物加到聚丙烯酰胺凝膠

中進(jìn)行電泳分離，電泳凝膠用X底片作放射自顯暴光，產(chǎn)生出可見的譜帶。

從膠的底部開始判讀譜帶，逐漸讀向頂部。所得出的核甘酸序列，是同模板

鏈5'-3'方向的堿基順序互補(bǔ)。圖中*號表示放射性標(biāo)記的核甘酸

2.Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法

1977年，由美國哈佛大學(xué)Maxam和Gilbert發(fā)明。

原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特

異性修飾和切斷，產(chǎn)生一組具有各種不同長度的DNA鏈的混合物，經(jīng)電泳

分離和放射性自顯影后，便可讀出待測DNA片段的核昔酸序列。

通常用的化學(xué)試劑是硫酸二甲酯和駢

其作用原理是：

（1）破壞糖環(huán)相連的堿基，將堿基從糖環(huán)上切除；

（2）進(jìn)一步從這一位置將磷酸二酯鍵斷裂。

（05-11）：（a）用T4多核甘酸激酶標(biāo)記DNA限制性片段的5'-末端,

或用T4DNA聚合酶標(biāo)記其3'-末端；（b）將32p-末端標(biāo)記的DNA片段（單

鏈的或雙鏈的）分成4個反應(yīng)管，進(jìn)行化學(xué)切割反應(yīng)；（c）將切割反應(yīng)物加

到聚丙烯酰胺序列膠上，進(jìn)行電泳分離，經(jīng)放射自顯影后在X底片上顯現(xiàn)出

可判讀的譜帶。

*號表示32P標(biāo)記的核甘酸。由于在聚丙烯酰胺凝膠中，相對分子質(zhì)量

小的DNA片段遷移速度快，因此在本例中跑在所有帶的最前面，亦即是凝膠

底部的帶是單核甘酸分子A,第二條帶是二核昔酸分子A-C,其余類推。因

為硫酸二甲酯特異性地切割G,而甲酸則特異性地切割G和A,因此具G-

末端的DNA片段，在G反應(yīng)和G+A反應(yīng)序列膠中，都將出現(xiàn)一條G帶。

同理，由于腫在NaCI條件下專門切割C,而無NaCI時專門切割T和C,

所以具有C末端的DNA片段，在C反應(yīng)和T+T反應(yīng)序列膠中，都將出現(xiàn)

一條C帶。

3.DNA序列分析的自動化

傳統(tǒng)的測序方法通用、有效，但操作步驟繁瑣、效率低、速度慢。

DNA序列分析的自動化“分析反應(yīng)咱動化，“讀片過程”自動化

（1）標(biāo)記物----四甲基若丹明tetramethylrhodamine

(2)讀取——在電泳凝膠的側(cè)面，固定一個激光通道小孔，安裝熒光

信號接收器。

(3)雙脫氧法一ddNTP分別用四種不同顏色的熒光標(biāo)記。

A.基因擴(kuò)增(PCR技術(shù))

1.定義

又稱體外基因擴(kuò)增法，在體外(試管、反應(yīng)管中)將要研究的目的基

因或DNA片段在短時間內(nèi)擴(kuò)增上百萬倍，稱為DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(PolymeraseChainReaction,PCR)

2.發(fā)展簡史

1971年Korana最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與

合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆

tRNA基因”。

1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反

應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中進(jìn)行DNA的體外合成。

Mullis最初使用的DNA聚合前是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow

片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，

容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR。

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus

aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫,

在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%,在93℃下反應(yīng)2h后其

殘留活性是原來的60%,在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②

在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)

增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。將此酶命名為TaqDNA

多聚酶(TaqDNAPolymerase)o此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

3.基本原理

第一步“加熱變性”:高溫下使DNA的雙鏈解開成為兩條單鏈DNA分子；

第二步“退火”：引物附著到模板DNA兩側(cè)；

第三步“延伸”:DNA聚合醐在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度下促使核甘酸依次按與模

板堿基互補(bǔ)配對原則，在引物3'端一個個地連接上去，直至形成一個完整的

DNA分子。

(圖5-16)：(a)起始材料，雙鏈DNA；(b)反應(yīng)混合物加熱后發(fā)生鏈

分離，降溫使引物結(jié)合到待擴(kuò)增靶DNA區(qū)段兩端的退火位點(diǎn)上；(c)Taq

DNA聚合酶以單鏈DNA為模板在引物的引導(dǎo)下利用反應(yīng)混合物中的

dNTPs合成互補(bǔ)的新鏈DNA；(d)將反應(yīng)混合物再次加熱，使舊鏈和新鏈

分開；(e)重復(fù)(b);(g)重復(fù)(c)……

4.PCR反應(yīng)所需成分：

(1)DNA模板

(2)引物(前、后)

(3)dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)(4)反應(yīng)緩沖液

(5)Mg++

(6)DNA聚合酶

反應(yīng)要求引物的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于模板的量，Why?

保證引物與模板配對的可能性大于模板與模板配對的可能性。

5.特點(diǎn):

(1)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度及位置由引物確定；

(2)特異性(取決于引物的特異性)(3.)靈敏性(擴(kuò)增效率)

理論上：2門(230=109)

實(shí)際：106~1。7

6.應(yīng)用：

(1)PCR產(chǎn)物的克??；

(2)檢測(疾病、突變、育種、法醫(yī)

鑒定、生物進(jìn)化、分類等)

(3)多態(tài)性分析

7.常見問題：

污染(試劑、實(shí)驗(yàn)室、樣品)

酶活性及種類

第三節(jié)基因克隆的主要載體系統(tǒng)

一.名詞

1.克隆(clone)

(1)細(xì)胞學(xué)定義，即無性繁殖，從一個共同祖先無性繁殖下來的一群

遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的特殊的生命群體。

(2)分子生物學(xué)定義，指將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA

中，是之得以永久保存和復(fù)制的過程。

2.基因克隆genecloning應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體

DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子(重組體)，繼而通過轉(zhuǎn)化或

轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得

大量同一DNA分子拷貝

3.載體vector

(1)概念：能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)外源DNAo

(2)分類：克隆載體、表達(dá)載體、原核載體、真核載體

(3)載體的基本要求：

①復(fù)制單位；

②克隆位點(diǎn)(多個單克隆位點(diǎn))；

③篩選標(biāo)記；

④分子量盡可能小；

⑤外源DNA插入后不影響載體本身的復(fù)制.

沒有一個天然的DNA完全符合載體條件，故使用時需進(jìn)行改造.

二.常用的克隆載體：

1.質(zhì)粒plasmid

2.A-噬菌體X-phage

3.Ml3

4.柯斯質(zhì)粒cosmid

1.質(zhì)粒(plasmid)—存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。

(1)理想的質(zhì)粒

拷貝數(shù)多；

兩三個遺傳標(biāo)志，如抗藥性基因：抗氨-青霉素基因(ampr)、抗四

環(huán)素基因(terr)；B-半乳糖普酶基因(半cZ)篩選標(biāo)志；

多個限制酶的單一切點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)

(2)大小2~10kb；

(3)優(yōu)點(diǎn)：易于操作、保存；

(4)缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較低，一般106-7done/1ug

(5)轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)法、電轉(zhuǎn)

(6)應(yīng)用：

①小基因組的克隆

②單一序列的克隆(目的基因的克隆)

2.人噬菌體(入phage)

特點(diǎn)：一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型為雙鏈線狀DNA分子,

長度48.5kb,分子兩端各有一個12bp組成的粘性末端，感染大腸桿菌后,

線狀DNA通過粘性末端互補(bǔ)連接成環(huán)，連接處稱COS位點(diǎn)。

(1)本身有復(fù)制體系；

(2)中間(J-N間)是人生長非必需區(qū)，可被其它外源DNA取代；(3)

ADNA在體外可包裝成病毒顆粒，感染效率高；

(4)載體容量大，可裝入大片段外源DNA(20kb)；

(5)可人工加入多克隆位點(diǎn)；

(6)篩選容易——噬菌斑篩選；

(7)主要用于DNA文庫構(gòu)建.

3.M13噬菌體

一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)正鏈ssDNA,全長6.5kb,感染大腸桿菌后,

ssDNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA,可用作克隆載體.

最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈DNA,可制備單鏈DNA探針.

4.粘性質(zhì)粒(cosmid)

是一種人工改造的載體，雙鏈環(huán)狀DNA,XDNA的cos區(qū)+質(zhì)粒，克隆

容量：40~50kb

(1)入-DNA的COS位點(diǎn)；

(2)質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和抗藥性標(biāo)記(Ampr);

(3)多種單一的酶切位點(diǎn).

cosmid較小，約4—6kb,可容納40-45kb的外源DNA,重組體可象

噬菌體一樣進(jìn)行外殼裝配，形成噬菌體顆粒，感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得

多，進(jìn)入宿主細(xì)胞后，只能象質(zhì)粒一樣擴(kuò)增，并依賴抗藥性被篩選.

優(yōu)缺點(diǎn)：

(1)克隆效率高；

(2)可利用質(zhì)粒DNA的方式擴(kuò)增；

(3)可克隆較大DNA片段；

主要用于真核基因的克隆，基因組文庫構(gòu)建

(4)缺點(diǎn)：產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。5.pBR系列

來源于PSC101、C0IE1和RSF2124三個天然質(zhì)粒改造重組而成，

PBR322是應(yīng)用最多的大腸桿菌質(zhì)粒載體，用氯霉素?cái)U(kuò)增法可使質(zhì)粒DNA

占細(xì)胞DNA總量的50%,這對制備大量質(zhì)粒DNA極為有利。

6.pUC系列

pUC系列質(zhì)粒(pUC8、9、12、13、18、19)具有pBR和M13

的許多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

篩選指示系統(tǒng)一藍(lán)白斑篩選

在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物IPTG(異丙基硫代半乳糖昔)和底物x-gal,

IPTG誘導(dǎo)LacZ表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖甘酶，使x-gal水解，產(chǎn)生蘭色化合物,

形成蘭色菌落；

當(dāng)插入外源片段，使LacZ基因失活，形成無色菌斑。

第四節(jié)基因的分離與鑒定

基本步驟

(1)用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化；

(2)外源DAN片段與載體分子的體外連接；

(3)將人工重組的DNA分子導(dǎo)入它們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞；

(4)重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選

重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑

1.原核細(xì)胞和低等真核細(xì)胞：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)

2.高等真核細(xì)胞：顯微注射、電穿孔

三.克隆基因的分離

1.看家基因(house-keepinggene)

以其組成型表達(dá)模式維持細(xì)胞的基本代謝活動的基因。

2.發(fā)育調(diào)控基因(developmentalregulatedgene)

以其時空特異性表達(dá)模式完成個體的正常生長、發(fā)育與分化的基因。

3.基因的差別表達(dá)(differentialexpression)

不同基因在生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細(xì)胞中

發(fā)生的按時間、空間進(jìn)行有序表達(dá)的方式。

4.克隆基因的分離主要方法：mRNA差別顯示PCR(DDRT-PCR)

第三章生物信息的傳遞(上)——從DNA到RNA

重點(diǎn)：1.啟動子與轉(zhuǎn)錄起始

2.原核生物和真核生物mRNA的特征比較

3.內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾

難點(diǎn)：1.啟動子與轉(zhuǎn)錄起始

2.終止和抗終止

3.內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾

課時分配：6學(xué)時

第二節(jié)啟動子與轉(zhuǎn)錄起始

大腸桿菌RNA聚合酶與啟動子的相互作用主要包括啟動子區(qū)的識別、酶

與