飼料中玉米赤霉烯酮的測定 征求意見稿

1飼料中玉米赤霉烯酮的測定本文件描述了飼料中玉米赤霉烯酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和高效液相色譜法。本文件適用于植物性飼料原料、配合飼料、精料補充料和濃縮飼料中玉米赤霉烯酮的測定。本文件的檢出限為2μg/kg、定量限為10μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（仲裁法）4.1原理試樣中的待測物用乙腈水溶液提取，提取液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋，經(jīng)免疫親和柱凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，基質(zhì)匹配標準曲線校準，外標法定量。4.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。4.2.1水：GB/T6682，一級。4.2.2甲醇：色譜純。4.2.3乙腈：色譜純。4.2.4甲酸：色譜純。4.2.5氯化鈉。4.2.6氫氧化鈉溶液（0.2mol/L稱取8.0g氫氧化鈉，用水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，定容，混勻。4.2.780%乙腈溶液：量取800mL乙腈（4.2.3）于1000mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。24.2.80.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸（4.2.4）于1000mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。4.2.9磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：稱取8.0g氯化鈉、1.16g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀，用水溶解稀釋定容至1000mL，用氫氧化鈉溶液（4.2.6）調(diào)節(jié)pH至7.4。4.2.10乙腈-0.1%甲酸溶液：量取100mL乙腈（4.2.3）于1000mL容量瓶中，用0.1%甲酸溶液（4.2.8）稀釋、定容，混勻。4.2.11標準儲備溶液（100μg/mL稱取玉米赤霉烯酮標準品（CAS號：17924-92-4，純度不低于99.5%）10mg（精確至0.01mg）于100mL容量瓶中，用乙腈（4.2.3）溶解、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期12個月。4.2.12標準中間溶液（10μg/mL）：準確移取5mL標準儲備溶液（4.2.11）于50mL容量瓶中，用乙腈（4.2.3）稀釋、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期6個月。4.2.13標準系列溶液：準確移取適量的標準中間溶液（4.2.12）于10mL容量瓶中，用乙腈-0.1%甲酸溶液（4.2.10）配制成質(zhì)量濃度分別為2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的標準系列溶液。臨用現(xiàn)配。4.2.14玉米赤霉烯酮免疫親和柱：柱容量≥1.5μg，柱回收率≥80%（驗證方法參見附錄A），或性能相當(dāng)者。4.2.15微孔濾膜：0.22μm，有機系。4.3儀器設(shè)備4.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。4.3.2電子天平：精度0.01g、0.00001g。4.3.3渦旋混合器。4.3.4超聲波清洗器：功率≥250W。4.3.5離心機：轉(zhuǎn)速≥10000r/min。4.3.6氮吹儀：溫控范圍30℃~60℃。4.3.7固相萃取裝置。4.3.8空氣壓力泵。4.4樣品按GB/T20195規(guī)定制備試樣，至少200g，粉碎使其全部通過0.425mm孔徑的試驗篩，混合均勻，裝入密閉容器中，備用。選取類型相同、均勻一致、且在待測物保留時間處，儀器響應(yīng)值小于方法定量限30%的飼料樣品，作為空白樣品。4.5試驗步驟4.5.1提取平行做兩份試驗。稱取試樣約5.0g（精確至0.01g），置于50mL離心管中，準確加入0.5g氯化鈉（4.2.5）和25mL80%乙腈溶液（4.2.7），渦旋混合2min，在250W的超聲功率下提取30min（每5min渦旋混合1次10000r/min離心5min，移取5mL上清液于50mL離心管中，加入20mLPBS（4.2.9），超聲混勻，備用。4.5.2凈化3將免疫親和柱連接至固相萃取裝置，將空氣壓力泵（4.3.8）與固相萃取裝置連接。準確移取5mL樣品提取液（4.5.1），調(diào)節(jié)壓力使溶液以不大于2mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，抽干。分別以10mL純水淋洗柱子兩次（對顏色較重的樣品，第一次改用10mL10%甲醇水溶液清洗柱子一次），保持流速不大于2mL/min~3mL/min，并抽干。準確加入1.5mL甲醇（4.2.2）洗脫，流速不大于2mL/min，上機測定。4.5.3基質(zhì)匹配標準系列溶液的配制取基質(zhì)空白樣品，按4.5.1和4.5.2進行提取和凈化處理，得到基質(zhì)空白溶液。分別準確移取標準系列溶液（4.2.13）各1mL，于40℃下氮氣吹至近干，準確加入1mL基質(zhì)空白溶液，渦旋混勻。配制成質(zhì)量濃度分別為2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的基質(zhì)匹配標準系列溶液。臨用現(xiàn)配。4.5.4測定4.5.4.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18柱，柱長150mm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑1.8μm，或性能相當(dāng)者；b）柱溫：40℃;c）流速：0.4mL/min；d）進樣量：3μL；e）流動相：A相為乙腈（4.2.3），B相為0.1%甲酸溶液（4.2.8），梯度洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序04584.5.4.2質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：a）電離模式：電噴霧電離，負離子模式（ESI-）；b）檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；c）毛細管電壓：3kV；e）霧化器溫度：500℃;多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子對及碰撞能量參考值見表2。表2玉米赤霉烯酮特征離子及參考質(zhì)譜條件m/zm/zV44.5.4.3基質(zhì)匹配標準系列溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，分別取基質(zhì)匹配標準系列溶液（4.5.3）和試樣溶液（4.5.2）上機測定?；|(zhì)匹配標準溶液的定量離子色譜圖見附錄圖B.1。4.5.4.4定性在相同試驗條件下，試樣溶液中待測物的保留時間應(yīng)與基質(zhì)匹配標準系列溶液（濃度相當(dāng)）中待測物的保留時間一致，其相對偏差在±2.5%之內(nèi)。根據(jù)表2選擇的定性離子對，比較試樣譜圖中待測物監(jiān)測離子對的相對離子豐度與質(zhì)量濃度接近的基質(zhì)匹配標準系列溶液中對應(yīng)的監(jiān)測離子對的相對離子豐度，若偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。表3定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差±20±304.5.4.5定量以基質(zhì)匹配標準系列溶液中待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子色譜峰的面積為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。試樣溶液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在標準曲線線性范圍之內(nèi)，若超出線性范圍，應(yīng)重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中待測物的質(zhì)量濃度與基質(zhì)匹配標準溶液的質(zhì)量濃度相差不超過30%。4.6試驗數(shù)據(jù)處理試樣中玉米赤霉烯酮的含量以質(zhì)量分數(shù)wi計，數(shù)值以微克每千克(μg/kg）表示，多點校準按式（1）計算，單點校準按式（2）計算：wi=×f……（1）式中：ρ——由基質(zhì)匹配標準曲線查得試樣溶液中待測物的質(zhì)量濃度，單位納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V3——氮氣吹干后加入復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）f——試樣稀釋倍數(shù)；1000——換算系數(shù)；V2——凈化時所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。wi=×f………………（2）5式中：A——試樣溶液中待測物的色譜峰面積；ρs——基質(zhì)匹配標準溶液中待測物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V3——氮氣吹干后加入復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL1000——換算系數(shù)；f——試樣稀釋倍數(shù)；As——基質(zhì)匹配標準溶液中待測物的色譜峰面積；V2——凈化時所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。測定結(jié)果以平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。4.7精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值不大于該算術(shù)平均值的20%。5高效液相色譜法5.1原理試樣中的待測物經(jīng)乙腈水溶液提取后，提取液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋，用免疫親和柱進行凈化，高效液相色譜儀測定，外標法定量。5.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.2.1水：GB/T6682，一級。5.2.2乙腈：色譜純。5.2.3甲醇：色譜純。5.2.4氯化鈉。5.2.5氫氧化鈉溶液（0.2mol/L稱取8.0g氫氧化鈉，用水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，定容，混勻。5.2.680%乙腈溶液：移取800mL乙腈（5.2.2）于1000mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。5.2.7磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：稱取8.0g氯化鈉、1.16g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀，用水溶解稀釋定容至1000mL，用氫氧化鈉溶液（5.2.5）調(diào)節(jié)pH至7.4。5.2.8流動相：量取460mL乙腈（5.2.2）至1000mL容量瓶中，混勻，備用。5.2.9標準儲備溶液（50μg/mL稱取玉米赤霉烯酮標準品（CAS號：17924-92-4，純度不低于99.5%）5mg（精確至0.01mg）于100mL容量瓶中，用乙腈（5.2.2）溶解、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期12個月。5.2.10標準中間溶液（5μg/mL）：準確移取10mL標準儲備溶液（5.2.9）于100mL容量瓶中，用乙腈（5.2.2）稀釋、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期6個月。65.2.11標準系列溶液：準確移取適量標準中間溶液（5.2.10），用流動相（5.2.8）稀釋成質(zhì)量濃度分別為20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的標準工作液。臨用現(xiàn)配。5.2.12玉米赤霉烯酮免疫親和柱：柱容量≥1.5μg，柱回收率≥80%（驗證方法參見附錄A），或性能相當(dāng)者。5.2.13玻璃微纖維濾紙：無熒光特性。5.2.14微孔濾膜：0.22μm，有機系。5.3儀器設(shè)備5.3.1高效液相色譜儀：配有熒光檢測器。5.3.2電子天平：精度0.01g、0.00001g。5.3.3振蕩器：振蕩頻率≥50r/min。5.3.4氮吹儀：溫控范圍30℃~60℃。5.3.5高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速≥18000r/min。5.3.6固相萃取裝置。5.3.7空氣壓力泵。5.4樣品5.5試驗步驟5.5.1提取平行做兩份試驗。稱取試樣40g（精確至0.0及100mL80%乙腈溶液（5.2.6于振蕩器（5.3.3）上振蕩60min，或于高速均質(zhì)器（5.3.5）均質(zhì)2min后，用定量濾紙過濾，準確移取10mL濾液并加入40mLPBS（5.2.7）稀釋，用玻璃纖維濾紙（5.2.13）過濾1次~2次，至濾液澄清，備用。5.5.2凈化將免疫親和柱連接至固相萃取裝置，將空氣壓力泵（5.3.7）與固相萃取裝置連接。準確移取10mL樣品提取液（5.5.1），調(diào)節(jié)壓力使溶液以不大于2mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，抽干。分別以10mL純水淋洗柱子兩次（對顏色較重的樣品，第一次改用10mL10%甲醇水溶液清洗柱子一次），保持流速不大于2mL/min~3mL/min，并抽干。準確加入1.5mL甲醇（5.2.3）洗脫，流速不大于2mL/min，收集洗脫液于40℃氮氣吹干，用1mL流動相（5.2.8）溶解殘渣，渦旋混勻，過濾膜（5.2.14），上機測定。5.5.3測定5.5.3.1高效液相色譜參考條件高效液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18柱，柱長150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或性能相當(dāng)者；b）流動相：甲醇（5.2.3）+水+乙腈（5.2.2）=46+8+46；c）流速：0.8mL/min；7d）檢測波長：激發(fā)波長274nm，發(fā)射波長440nm；e）進樣量：20μL；f）柱溫：30℃。5.5.3.2標準系列溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，分別取標準系列溶液（5.2.11）和試樣溶液（5.5.2）上機測定。玉米赤霉烯酮標準溶液的高效液相色譜圖見附錄圖C.1。5.5.3.3定性以保留時間定性，試樣溶液中玉米赤霉烯酮的保留時間應(yīng)與標準系列溶液（濃度相當(dāng)）中玉米赤霉烯酮的保留時間一致，其相對偏差在±2.5％之內(nèi)。5.5.3.4定量以玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度為橫坐標，色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標，繪制標準曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。試樣溶液中玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度應(yīng)在標準曲線的線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應(yīng)將試樣溶液稀釋后重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度與標準溶液的質(zhì)量濃度相差不超過30%。5.6試驗數(shù)據(jù)處理試樣中玉米赤霉烯酮的含量以質(zhì)量分數(shù)wi計，數(shù)值以微克每千克(μg/kg）表示，多點校準按式（3）計算，單點校準按式（4）計算：wi=×f……（3）式中：ρ——由標準曲線查得試樣溶液中待測物的質(zhì)量濃度，單位納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V3——氮氣吹干后加入復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；1000——換算系數(shù)；f——試樣稀釋倍數(shù)；V2——凈化時所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。wi=×f……（4）式中：A——試樣溶液中待測物的色譜峰面積；ρs——標準溶液中待測物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V3——氮氣吹干后加入復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；1000——換算系數(shù)；f——試樣稀釋倍數(shù)；As——標準溶液中待測物的色譜峰面積；8V2——凈化時所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。測定結(jié)果以平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。5.7精密度在重復(fù)性條件下，獲得的玉米赤霉烯酮的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不大于其算術(shù)平均值的20%。9玉米赤霉烯酮免疫親和柱質(zhì)量驗證方法A.1柱容量驗證A.1.1在5mL的80%乙腈溶液-PBS（1:4，v:v）中加入9000ng玉米赤霉烯酮標準品，充分混勻。分別取同一批次3根免疫親和柱，每根柱的上樣量為1mL。經(jīng)上樣、淋洗、洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干至1mL，用流動相定容至1mL，用液相色譜儀分離測定玉米赤霉烯酮的含量。A.1.2結(jié)果判定：玉米赤霉烯酮含量≥1500ng，為可使用商品。A.2柱回收率驗證A.2.1在5mL的80%乙腈溶液-PBS（1:4，v:v）中加入9000ng玉米赤霉烯酮標準品，充分混勻。分別取同一批次3根免疫親和柱，每根柱的上樣量為1mL。經(jīng)上樣、淋洗、洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干至1mL，用流動相定容至1mL，用液相色譜儀分離測定玉米赤霉烯酮的含量。A.2.