分子生物學(xué)重點(diǎn)考點(diǎn)總結(jié)詳細(xì)

分子生物學(xué)總結(jié)蛋白質(zhì)分子病(MolecularDiseases)結(jié)構(gòu)異常，分子減少或缺失所引起的疾病。例子：鐮刀狀細(xì)胞貧血(Sicklecellanemia)(anemia)——HbSHbS?223.HBSb亞基第6位谷變成疏水的纈，導(dǎo)致其溶解性降低而析出，鐮刀狀，溶血.蠶豆病：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏家族型高膽固醇血癥：LDL受體缺乏痛風(fēng)?。毫姿岷颂墙沽姿岷铣擅溉狈Π谆。豪野彼崦溉狈μ悄虿。阂葝u素缺乏構(gòu)象?。旱鞍踪|(zhì)折疊錯誤導(dǎo)致功能改變?nèi)缗两鹕喜?，AlzheimerAlzheimer’’s病,Madcowdiseases。各種氨基酸殘基在不同的二級結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的頻率不同a.形成αα螺旋能力強(qiáng)的氨基酸有：Glu、Met、Ala、Leub.形成ββ折疊能力強(qiáng)的氨基酸有：Val、Ile、Tyrc.形成ββ轉(zhuǎn)角能力強(qiáng)的氨基酸有：Pro、Gly、Asn、Asp、Ser一級結(jié)構(gòu)：指多肽鏈中氨基酸的排列順序，穩(wěn)定因素：肽鍵二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈中某一段肽鏈中，鄰近的氨基酸殘基之間，通過氫鍵形成有規(guī)律重復(fù)的（α-螺旋和β折疊），部分有規(guī)律的（β轉(zhuǎn)角和環(huán)）或無序的一種局部構(gòu)象。超二級結(jié)構(gòu)：由幾個二級結(jié)構(gòu)相互作用形成的有規(guī)律的組合體。又叫基序或motif。包括αα、ββ、βαβ等。結(jié)構(gòu)域：超二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步組合折疊成半獨(dú)立緊密的球狀。相對獨(dú)立并與該妃子功能特性相關(guān)的機(jī)構(gòu)單位?；绢愋桶ǎ浩叫笑?β型：(1）單繞平行ββ(2)雙繞平行ββ片層；反平行β-型：(1)希臘花邊ββ(2)升降ββ-筒；全α型：（1）升降螺旋束（2）希臘花邊螺旋束；小不規(guī)則結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)：在二級結(jié)構(gòu)，超二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)上，一級結(jié)構(gòu)相隔較遠(yuǎn)的aa殘基以次級鍵相連，盤旋折疊成特定空間排布．穩(wěn)定因素：側(cè)鏈RR基團(tuán)之間相互作用形成的各種非共價鍵，包括疏水鍵、氫鍵、離子鍵和范德華力等。四級結(jié)構(gòu)：某些蛋白由兩條或者兩條以上的多肽鏈組成，每條多肽鏈為一個亞基。各個亞基之間的相對空間排布和相互作用形成四級結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定因素為次級鍵。變性：物理化學(xué)因素使理化性質(zhì)變化而引起生物學(xué)功能降低或改變的現(xiàn)象。實(shí)質(zhì)是破壞維系蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級鍵，但不涉及一級結(jié)構(gòu)的改變。復(fù)性：在較弱的變性因素下，當(dāng)出去變性因素后蛋白質(zhì)可恢復(fù)其生物活性的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)前體激活的意義：（胰蛋白酶原的激活：防止自身的消化，同時產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，放大信號。）別構(gòu)效應(yīng)（allostericeffect）：指蛋白質(zhì)與配基結(jié)合后能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，而改變蛋白質(zhì)的生物活性的現(xiàn)象。正協(xié)同效應(yīng)：當(dāng)?shù)谝粋€亞基與配體結(jié)合后，可促進(jìn)下一個亞基與配體的結(jié)合。（以血紅蛋白α1α2β1β2為例）導(dǎo)致AS的因素：環(huán)境因素：高脂膳食、缺乏運(yùn)動、吸煙等遺傳因素：肥胖、糖尿病低、LDL/VLDL升高、LP(a)升高、HDL低等等。血漿脂蛋白的結(jié)構(gòu)：具極性及非極性基團(tuán)的載脂蛋白、磷脂、游離膽固醇，以單分子層借其非極性疏水基團(tuán)與內(nèi)部疏水鏈相聯(lián)系，極性基團(tuán)朝外。疏水性較強(qiáng)的TG及膽固醇酯位于內(nèi)核。四種主要脂蛋白的分離方法：超速離心法，即是根據(jù)脂蛋白在一定密度的介質(zhì)中進(jìn)行超速離心時漂浮速率不同而進(jìn)行分離的方法。關(guān)鍵步驟是形成密度梯度。五種脂蛋白的組成：CM：含TG最多，蛋白質(zhì)含量最少，主要為apoB48。VLDL：含TG也多，但蛋白質(zhì)含量高于CM，主要為apoB100，CI，CII，CIII0~2LDL：含膽固醇及其酯最多，幾乎只含apoB100HDL：及蛋白質(zhì)含量最多，主要為apoAI和apoAII。Lp(a)：脂質(zhì)成分類似于LDL,但多含一分子apo(a)，TG多于LDL，Ch少于LDL。乳糜微粒(CM,Chylomicron）：主要含有外源性甘油三酯，是運(yùn)輸外源性甘油三酯及膽固醇的主要形式。正常人血漿中的乳糜微粒空腹12小時后就被完全清除，不是動脈粥樣硬化的主要危險因素，但容易誘發(fā)胰腺炎。極低密度脂蛋白(VLDL,VeryLowDensityLipoprotein)：是運(yùn)輸內(nèi)源性甘油三酯的主要形式。正常人極低密度脂蛋白大部分代謝變成低密度脂蛋白。這類脂蛋白由于攜帶膽固醇數(shù)量相對較少，且它們的顆粒相對較大，不易透過血管內(nèi)膜，因此，正常的極低密度脂蛋白沒有致動脈硬化作用，像乳糜微粒一樣也不是冠心病的主要危險因素，極低密度脂蛋白代謝產(chǎn)生的中密度脂蛋白具有致動脈硬化作用。VLDL大小為30-80nm，含有甘油三酯、膽固醇、膽固醇酯和磷脂，TG占50％左右，蛋白質(zhì)部分為ApoAⅠ、AⅣ、B100、C、E等。VLDL在肝臟合成，利用來自脂庫的脂肪酸作為合成材料，其中膽固醇來自CM殘粒及肝自身合成的部分。低密度脂蛋白(LDL,LowDensityLipoprotein)：LDL是富含膽固醇的脂蛋白，其膽固醇主要來自從CE運(yùn)的高密度脂蛋白中的膽固醇。目前認(rèn)為血漿LDL來源有兩條途徑：①主要途徑是由VLDL異化代謝轉(zhuǎn)變而來；②次要途徑是肝合成后直接分泌到血液中。LDL的降解是經(jīng)LDL受體途徑進(jìn)行代謝。當(dāng)?shù)兔芏戎鞍走^量時，它攜帶的膽固醇便積存在動脈壁上，久了容易引起動脈硬化。因此低密度脂蛋白被稱為“壞的膽固醇”。甘油三酯及膽固醇酯構(gòu)成內(nèi)核,載脂蛋白、磷脂及膽固醇等兼性分子以單分子層借助其非極性的疏水基團(tuán)與內(nèi)核相連，而極性的親水基團(tuán)位于表面。高密度脂蛋白(HDL,HighDensityLipoprotein)：比較富含磷脂質(zhì)，在血清中的含量約為300mg/dl。其蛋白質(zhì)部分,AⅠ約為75％，AⅡ約為2020％。由于可輸膽固醇促進(jìn)膽固醇的代謝，所以作為動脈硬化預(yù)防因子而受到重視。HDL主要由肝和小腸合成。肝合成的新生HDL磷脂ApoAⅠ為主。在LCAT作用下，游離膽固醇變成膽固醇酯，脂蛋白則變成成熟球形HDL3,再經(jīng)LPL作用轉(zhuǎn)變成HDL2。HDL可將蓄積于末梢組織的游離膽固醇與血液循環(huán)中脂蛋白或與某些大分子結(jié)合而運(yùn)送到各組織細(xì)胞，主要是肝臟。實(shí)際上是膽固醇逆轉(zhuǎn)（RCR），RCT促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)膽固醇的清除，維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇量的相對衡定，從而限制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，起到抗動脈粥樣硬化作用。Lipoproteins功能：CM:轉(zhuǎn)運(yùn)外源性甘油三酯及膽固醇酯；VLDL:轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性甘油三酯；LDL:將肝合成的內(nèi)源性膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝外組織；HDL:參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。脂蛋白受體：脂蛋白受體是一類位于細(xì)胞膜上的糖蛋白，它們能以高親和性的方式和其相應(yīng)的脂蛋白配體相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞對脂蛋白的攝取和代謝，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)血漿脂蛋白和血脂的水平。a.參與脂蛋白代謝b.參與視黃酸和類固醇的內(nèi)吞性攝取。如Megalin。c.參與體內(nèi)細(xì)胞信號的傳遞，如LRP，VLDL-R及apoE--R2。LDL受體途徑：LDL受體在細(xì)胞膜上以單體形式存在，當(dāng)其與血漿中的LDL結(jié)合后，受體聚集成簇，并隨被覆陷窩內(nèi)陷，形成被覆小泡，被覆小泡脫去衣被后與內(nèi)小體融合。LDL在內(nèi)小體的酸性環(huán)境中與LDL受體分離。1.含受體部分的小泡成再循環(huán)小泡，又回到細(xì)胞表面—LDL受體的再循環(huán)途徑。2.LDL被運(yùn)送到溶酶體，并被溶酶體內(nèi)的酶類分解，載脂蛋白（主要為apoB100）降解成氨基酸，膽固醇酯則被酸性酯酶水解為游離膽固醇。LDL受體的功能：1.結(jié)合LDL或其它含apoB100或apoE的脂蛋白，內(nèi)吞入細(xì)胞以獲得脂類，主要為膽固醇。2.50%LDL在肝臟經(jīng)LDL受體途徑降解。3.影響LDL的生成速率以及VLDL代謝，并能在CM代謝中發(fā)揮作用。LDL受體的結(jié)構(gòu)：由839個氨基酸組成的單鏈多肽。包括蛋白質(zhì)部分（93kD）；18個O-連接糖鏈，2個N-連接糖鏈。總分子量115kD。包括五個結(jié)構(gòu)域：1，配體結(jié)合域：2，EDF前體同源域（與LDL受體的再循環(huán)途徑有密切關(guān)系）；3，O-連接糖鏈的結(jié)構(gòu)域，對LDL受體起支撐作用。4，跨膜域；5，胞漿域，序列Asn-Pro-X-Tyr是受體定位于被覆陷窩所必需。LDL受體基因突變（家族性高膽固醇血癥）：1.用抗體或其他方法無法檢得LDL受體；2.LDL受體不能或遲緩地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面；3.LDL受體不能結(jié)合LDL；4.受體結(jié)合LDL后不能內(nèi)移。LDL受體家族：一類位于細(xì)胞膜表面，結(jié)構(gòu)與LDL受體像是的內(nèi)吞性受體所組成的。包括LDL受體，VLDL受體，LDL受體相關(guān)蛋白，apo-E受體-2等。LDL非受體代謝途徑：血漿中的LDL還可被修飾，修飾的LDL如氧化修飾LDL(ox-LDL)可被清除細(xì)胞。即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞清除。這兩類細(xì)胞膜表面具有清道夫受體(scavengerreceptor,SR)，攝取清除血漿中的修飾LDL。Lp（a）：其中脂質(zhì)組分和LDL相似，TG含量高于LDL，Ch少于LDL。apoB100于apo(a)以二硫鍵相連。結(jié)構(gòu)：疏水性脂質(zhì)為核心，外周包繞蛋白質(zhì)和磷脂復(fù)合物。其含有Kringle結(jié)構(gòu)域（由80個氨基酸殘基組成，富含Cys并含有3個內(nèi)部二硫鍵，形成一種形狀頗似丹麥蛋糕結(jié)構(gòu)。這個結(jié)構(gòu)域和纖溶酶(plasminogen,PG)的分子結(jié)構(gòu)。Lp(a)與動脈粥樣硬化：1.Lp(a)是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因素之一。Lp(a在血液中的含量分布差別極大(0~100mg/dL)。當(dāng)a)＞30mg/dL時，表明As危險性增高。Lp(a)致As的機(jī)制：Lp(a)與纖溶酶原結(jié)構(gòu)同源Lp(a)與纖溶酶原競爭底物的結(jié)合部位:Lp(a)中的apo(a)與纖溶酶原競爭同一底物纖維蛋白或纖維蛋白原，但由于apo(a)不具備酶的活性，導(dǎo)致其不能溶解或分解與其結(jié)合的纖維蛋白，相反它還促進(jìn)纖維蛋白沉著于血管壁，參與血栓形成，繼而啟動As的發(fā)生和發(fā)展。Lp(a)競爭性抑制纖溶酶原與細(xì)胞纖溶酶原受體的結(jié)合。纖溶酶原受體的主要作用是加速纖溶酶原的活化，促進(jìn)血栓的溶解，保護(hù)纖溶酶不被抑制。但由于Lp(a)的分子結(jié)構(gòu)與纖溶酶原極為相似，因此它能與纖溶酶原競爭纖溶酶原受體，從而抑制血栓的溶解，促進(jìn)血栓的形成。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體：指細(xì)胞識別和結(jié)合化學(xué)信息分子（激動劑或抑制劑）并能激發(fā)靶細(xì)胞產(chǎn)生特異生物效應(yīng)的細(xì)胞膜或者細(xì)胞核內(nèi)的特殊蛋白質(zhì)分子。受體的分類：質(zhì)膜受體。a，離子通道性受體，又稱為配體門控離子通道，受神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控。主要在神經(jīng)沖動傳遞中發(fā)揮作用；b，催化性受體，這類受體在其胞質(zhì)面具有酪氨酸蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域，配體受體結(jié)合后，可激活酶使得受體具有催化活性。c，G蛋白偶聯(lián)受體，這類受體接受的信息要G蛋白的轉(zhuǎn)換才能傳遞到靶細(xì)胞中。胞內(nèi)受體。核內(nèi)受體。脂溶性因子透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)后，與胞質(zhì)或核內(nèi)受體特異結(jié)合，調(diào)節(jié)某一特異基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的代謝。受體作用的特點(diǎn)：1.受體與配體的結(jié)合具有高度特異性。2.受體與配體結(jié)合時高親和力的。3.受體與配體結(jié)合具有可飽和性。4.受體與配體通過非共價鍵結(jié)合，因而具有可逆性。5.受體的數(shù)目和親和力大小可以被調(diào)節(jié)。6.于配體相似的化合物，可發(fā)生競爭性抑制。7.具有協(xié)同和放大效應(yīng)。G蛋白：G蛋白又稱鳥苷酸結(jié)合蛋白，是一類能與鳥苷酸可逆結(jié)合的膜蛋白，廣泛存在于多種細(xì)胞，結(jié)構(gòu)相似，功能有別，共同構(gòu)成G蛋白家族。G蛋白的結(jié)構(gòu)：G蛋白種類多，單結(jié)構(gòu)相似。都有α、β和γ亞基組成的雜三聚體。不同G蛋白有不同的α亞基，其具有特異性。但是都具有GTP和GDP結(jié)合位點(diǎn)。雜三聚體時沒有活性，當(dāng)α亞基與GTP結(jié)合時和其他兩個亞基分離，具有GTP酶活性，并具有調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白的活性。α亞基根據(jù)其功能和氨基酸序列不同，可分為Gs，Gi，Gq和G124類。β和γ亞基分別發(fā)現(xiàn)了8和12種，其主要功能是形成三聚體時抑制GTP酶活性。G蛋白跨膜傳遞信息的機(jī)制：含有7次跨膜的α螺旋，C端在胞內(nèi)，胞外近N端胞有糖基修飾。C端絲氨酸或蘇氨酸磷酸化可阻止受體于G蛋白的作用。未結(jié)合時G蛋白雜三聚體存在并結(jié)合GDP，當(dāng)激素與受體結(jié)合后，活化受體與α亞基結(jié)合，分離GDP并結(jié)合GTP。從而使三聚體解聚。α亞基-GTP作用于效應(yīng)器E（酶），或者βγ亞基作用于另一效應(yīng)器。α亞基可使GTP水解為GDP，在于GDP結(jié)合而失活后，在重新形成雜三聚體。G蛋白在信息傳遞中的作用：調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性。β腎上腺素激活受體后，受體激活Gs，再激活腺苷酸環(huán)化酶，使得cAMP上升；α腎上腺素激活受體后，激活Gi，結(jié)果相反。調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜cGMP磷酸二酯酶的活性。轉(zhuǎn)導(dǎo)素Gt于視紫紅質(zhì)偶聯(lián)激活。調(diào)節(jié)磷脂酶C的活性。G蛋白介導(dǎo)IP3和DG的生成。磷脂酶C可促進(jìn)1，4，5三磷酸肌醇和甘油二酯的生產(chǎn)。調(diào)節(jié)離子通道的功能。小G蛋白：一條肽鏈，與G蛋白α亞基高度同源，也能與GTP和GDP結(jié)合，同時具有GTP酶活性。小G蛋白家族和21kD的Ras蛋白同源。其中Ras亞族調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值，分化和凋亡。在胰腺癌，肺癌和結(jié)腸直腸癌腫的突變率為90，30，50.Ras蛋白基因突變或調(diào)節(jié)失常于人類腫瘤有關(guān)。G蛋白與疾病：腫瘤：ras癌基因產(chǎn)物P21于G蛋白有相同特性，能結(jié)合GTP。Ras可激活磷脂酶C，產(chǎn)生IP3和DG激活蛋白酶C，促進(jìn)細(xì)胞增值。突變后，ras結(jié)合GTP后無法水解，持續(xù)激活。內(nèi)分泌：典型假性甲狀旁腺功能減退癥對甲狀腺激素反應(yīng)降低，同時對多種能引起cAMP上升的反應(yīng)降低，推測可能是Gs缺乏。藥物成癮和耐受：嗎啡成癮后，Gs活性減小而造成腺苷酸環(huán)化酶活性降低，產(chǎn)生戒斷癥狀。霍亂毒素可屏蔽Gs的GTP活性，使得其持續(xù)激活，促使水分排出。可以用霍亂毒素使得戒斷癥狀消失。cAMP信號傳遞途徑：配體（多為激素：生在激素，促腎上腺皮質(zhì)激素，促甲狀腺激素等）與受體結(jié)合后激活受體→→G蛋白→→腺苷酸環(huán)化酶→→cAMP上升→→通過變構(gòu)效應(yīng)與蛋白激酶A的R亞基結(jié)合，激活C亞基→→磷酸化底物蛋白質(zhì)的絲氨酸和蘇氨酸(組蛋白H1，H2a，H2b，核糖體蛋白，膜蛋白，微觀蛋白肌鈣蛋白等）→→產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝（磷酸化磷酸化酶b激酶，使得磷酸化酶b變?yōu)橛谢钚缘牧姿峄竌，使肝糖原降解，血糖升高）和基因表達(dá)（CRE，CREB和CBP）。OIP3，DG信號傳遞途徑：也叫Ca2+-PLC依賴的蛋白激酶C信號途徑。配體于受體結(jié)合并激活受體→→激活G蛋白（Gq）→→激活磷脂酶C（PI-PLC）β→→是PIP2分解為IP3和DG→→IP3和受體結(jié)合，釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌質(zhì)網(wǎng)中的Ca到胞漿中，Ca和DG一同激活蛋白激酶C（PKC）→→磷酸化底物蛋白（細(xì)胞因子受體，EGF受體，胰島素受體）→→調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝（糖原合酶，磷酸化Ca泵，是Ca內(nèi)流）和基因表達(dá)（磷酸化c-fos，c-jun等原癌基因的反式作用因子，產(chǎn)生表達(dá)。這些立早基因的表達(dá)課激活晚期反應(yīng)基因，使得細(xì)胞增值）。染色質(zhì)與基因表達(dá)調(diào)控順式作用元件：具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的特異DNA片段。反式作用因子：與順式作用元件直接或間接相互作用，并能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)（或酶）。染色質(zhì)(chromatin)：是細(xì)胞間期遺傳物質(zhì)的存在形式，是細(xì)胞間期核內(nèi)伸展開的DNA蛋白質(zhì)纖維。染色體(chromosome)：是細(xì)胞分裂中期遺傳物質(zhì)的存在形式，是高度螺旋化的DNA蛋白質(zhì)纖維，是間期染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密盤繞折疊的結(jié)果。常染色質(zhì)(euchromatin):堿性染料著色淺而均一，DNA復(fù)制較早，對核酸酶敏感，富含基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白和乙酰組蛋白，核小體陣列不規(guī)則，壓縮程度低。異染色質(zhì)（heterochromatin):堿性染料著色深而不均一，DNA復(fù)制較晚而慢，對核酸酶不敏感，所含基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白少，富含高度重復(fù)序列、低乙酰組蛋白和異染色質(zhì)相關(guān)蛋白，核小體陣列規(guī)則，高度壓縮。遺傳印記：無論從染色體水平還是等位基因水平，遺傳物質(zhì)的表現(xiàn)取決于它的親代來源，父源和母源的遺傳物質(zhì)表達(dá)不同。這種由雙親性別決定的基因功能上的差異被稱之為遺傳印記(geneticimprinting)或親代印記(parentalimprinting,PI)表觀遺傳學(xué)：某些個體表型改變不涉及到原有基因組DNA序列的變異和/或不遵循孟德爾遺傳定律的遺傳，而淵源于染色體另外層次的變化如CpG序列甲基化/去甲基化修飾，致使某些基因不表達(dá)/異常表達(dá)。啟動子：位于基因編碼區(qū)上游并為RNA聚合酶識別、結(jié)合和啟動轉(zhuǎn)錄的DNA序列。TATA盒：啟動子序列在真核細(xì)胞中，普遍存在兩個保守序列或稱為一致序列。Prinbnow盒，在真核中在-25到-30區(qū)，稱為Goldberg-Hogness盒。核心啟動子：TATA盒與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)式維持RNAP基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平所需，具有獨(dú)立和協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄的功能。上游啟動元件（UAS）：在原核基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-35外保守序列，在真核中位于-70左右，很多基因有CAAT盒（GCCAAT）和CG盒（GGGGCGG），稱為UAS。增強(qiáng)子：能加強(qiáng)其上游或者上游基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。終止子：基因編碼區(qū)下游能促進(jìn)RNAP識別和終止RNA合成的DNA序列。沉默子：和增強(qiáng)子相反，能抑制上游或下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。隔離子：在真核基因組中建立獨(dú)立轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)元件。插入調(diào)節(jié)元件和啟動子間，是其作用僅限于適宜的靶啟動子，阻斷增強(qiáng)子/啟動子聯(lián)絡(luò)不當(dāng)，防止阻遏態(tài)染色質(zhì)擴(kuò)展。又分為抗增強(qiáng)子和抗沉默子。基序或motif：HTH、亮氨酸拉鏈、鋅指和ETS單順反子：一個基因編碼一條多肽鏈或RNA鏈，每個基因轉(zhuǎn)錄有各自的調(diào)節(jié)元件。重復(fù)序列：指多拷貝的相同或相似的DNA片段。可分為高度重復(fù)和中度重復(fù)。衛(wèi)星DNA：主要分布在染色體著絲點(diǎn)，一般不轉(zhuǎn)錄，可能與配對，重排和物種形成有關(guān)。衛(wèi)星DNA通常是串聯(lián)重復(fù)序列。衛(wèi)星DNAI家族由42bp的單元組成微衛(wèi)星：簡單串聯(lián)重復(fù)序列，一般重復(fù)單位為2~4個核苷酸。小衛(wèi)星DNA：可變串連重復(fù)序列右又叫小衛(wèi)星DNA，小衛(wèi)星DNA的核心序列長10-70bp，主要分布于基因組的非編碼區(qū)。基因組上存在著多位點(diǎn)的可變串連重復(fù)序列。不同個體基因組上同一可變串連重復(fù)序列的核心序列相同，但重復(fù)次數(shù)相差懸殊，因而長度變化較大，呈現(xiàn)多態(tài)性?？梢杂脕龛b別個體或確認(rèn)指正罪犯。端粒：人染色體端粒含有（TTAGGG）n的序列，短串聯(lián)重復(fù)或長串聯(lián)重復(fù)不等。反轉(zhuǎn)座子：在基因組中移動或易位的DNA片段為轉(zhuǎn)座元件。其中需要經(jīng)過RNA中間體的反轉(zhuǎn)錄復(fù)制和易位的散在重復(fù)元件為反轉(zhuǎn)座子。長散在重復(fù)元件（LINEs）每個單倍體基因組中至少105拷貝長度≧5kb的重復(fù)序列。短散在重復(fù)元件（SINEs）人基因組內(nèi)由500000~1000000個拷貝長度在100~500bp。分布在內(nèi)含子，非翻譯區(qū)和各個基因間的間隔區(qū)。核小體：低離子強(qiáng)度溶液，使得間期細(xì)胞核腫脹、破裂并釋放染色質(zhì)，在電子顯微鏡下呈串珠狀纖維，附著這的顆粒稱為核小體。核小體是真核染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位。組蛋白密碼：核小體核心組蛋白N-端尾區(qū)，具細(xì)胞信息潛在的存儲功能，是提供表型遺傳信息的豐富來源，此信息可傳遞至子代；尾區(qū)位點(diǎn)修飾及其組合，構(gòu)成一整套限定染色質(zhì)局部轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的密碼；這套由位點(diǎn)特異修飾酶所配置的密碼，需相應(yīng)（對位點(diǎn)修飾敏感并與此位點(diǎn)結(jié)合）的非組蛋白解讀，以實(shí)現(xiàn)去全部信息潛在效應(yīng)；這不僅需解讀修飾組合的組蛋白，還需要維持這些非組蛋白解讀位點(diǎn)適當(dāng)?shù)恼{(diào)控機(jī)制。重塑復(fù)合物：proteinmachinesthatusetheenergyofATPhydrolysistochangethestructureofnucleosomestemporarilysothatDNAbecomeslesstightlyboundtothehistonecore.多種蛋白質(zhì)的復(fù)合物，依賴ATP的供能課暫時性的改變核小體的結(jié)構(gòu)，是DNA鏈從核心組蛋白上松弛下來。產(chǎn)生三種效應(yīng)，滑動，轉(zhuǎn)移和重構(gòu)。染色質(zhì)的修飾于基因表達(dá)：一共6種修飾方式：DNA1種，組蛋白5種染色質(zhì)DNA的甲基化/去甲基化；染色質(zhì)組蛋白的甲基/去甲基化；染色質(zhì)組蛋白的乙?；?去乙酰化；組蛋白（以及轉(zhuǎn)錄因子）的磷酸化/去磷酸化；染色質(zhì)組蛋白的泛素化/去泛素化；組蛋白（尾部）ADP-核糖基化。(重點(diǎn)是甲基化/去甲基化和乙酰化/去乙酰化）。DNA的甲基化/去甲基化多發(fā)生在副很CpG的短序列上。異染色質(zhì)甲基化程度高。甲基化酶可使得基因組不穩(wěn)定，胚胎死亡；腫瘤中一般涉及到多種癌基因低甲基化和多種抑癌基因的高甲基化失活。DNA甲基化對轉(zhuǎn)錄的抑制取決去其位點(diǎn)和程度的分布。DNMT1維持甲基化，NDMT3重頭甲基化。胚胎血細(xì)胞中的球蛋白基因啟動子的甲基化使其激活。組蛋白甲基化/去甲基化多發(fā)生在H3.H4賴氨酸殘基的（K）ε氨基上；其次是精氨酸殘基的（R）亞氨基和氨基上。由組蛋白甲基化酶或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶催化，并通常具有位點(diǎn)特異性。組蛋白的甲基化通常變現(xiàn)為基因的沉默，而去甲基化為基因表達(dá)開啟。（精氨酸的甲基化可能涉及到基因激活）組蛋白乙酰化/去乙酰化發(fā)生在組蛋白賴氨酸的（K）ε氨基上，為組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶或稱乙酰化酶/組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶或稱去乙?；复呋目赡娣磻?yīng)。乙?；℉AT）是氨基被乙酰基取代，正電荷減少和八聚體/DNA親和力下降，加速核小體解聚；同時核小體間相互作用減弱，染色質(zhì)壓縮減小；DNA鏈松散后，多種轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶可進(jìn)入核小體與模板接觸，促進(jìn)基因的表達(dá)。去乙?；℉DAC）作用相反，使核小體聚集和阻遏態(tài)染色質(zhì)穩(wěn)定。磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸羥基上。組蛋白磷酸化與細(xì)胞凋亡有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和去磷酸化可產(chǎn)生激活和失活效應(yīng)，而轉(zhuǎn)錄因子不同而異。P53磷酸化后激活，促進(jìn)形成四聚體，促進(jìn)Mad2和其解離。維持P53的穩(wěn)定。泛素為小分子酸性蛋白。泛素化涉及到ATP-依賴性蛋白質(zhì)的解體。可參與基因正確有序表達(dá)，參與阻遏復(fù)合物和染色質(zhì)重塑復(fù)合物的裝配和調(diào)節(jié)，是信號調(diào)節(jié)途徑中的調(diào)節(jié)因素，還涉及到DNA修復(fù)（泛素化某些因子，如增值細(xì)胞核抗原PCNA可加速DNA修復(fù)）。ADP-核糖基化，端粒的核糖基化后有利于端粒末端重復(fù)的延長和維持。PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）也與DNA的修復(fù)，凋亡，染色質(zhì)激活和發(fā)育分化有關(guān)?；蛲蛔兓蛲蛔儯夯蚪MDNA分子中發(fā)生堿基的增添、缺失或改變而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而引起遺傳表型的改變。堿基改變突變分類：點(diǎn)突變：DNA被化學(xué)修飾或復(fù)制時發(fā)生錯配，使一個堿基變成另一個堿基。堿基插入突變：DNA鏈中插入1個或多個堿基（轉(zhuǎn)座子Tn），突變后可引起DNA序列閱讀框架改變。堿基缺失突變：DNA鏈中1個或多個堿基發(fā)生丟失，突變后可引起DNA序列閱讀框架改變。基因突變的密碼效應(yīng)：同義突變：堿基被替代后沒有密碼子改變，其產(chǎn)物AA序列也無變化。錯義突變：堿基序列的改變引起AA序列改變。無義突變：某個堿基改變使某個AA的密碼子成為蛋白質(zhì)合成的終止密碼子。復(fù)等位基因(multipleallele)：位于同一基因位點(diǎn)上的多種各個等位基因。突變誘因：自發(fā)性突變：DNA復(fù)制過程中偶然堿基配對出現(xiàn)錯誤(10-9~10-10)。誘變劑的作用誘變劑（mutagen）外源誘發(fā)突變的因素，種類繁多，突變頻率高。主要有以下幾種：（1）物理因素：紫外線、電離輻射等。（2）生物因素：病毒、真菌、細(xì)菌等（3）化學(xué)因素：①烷化劑②堿基類似物:如5-BrU③其他化學(xué)誘變劑:羥胺、亞硝酸鹽等。基因突變的一般特征：、突變的重演性和可逆性(二)、突變的多方向性與復(fù)等位基因(三)、隨機(jī)性—生物個體發(fā)育的任何時期；體細(xì)胞突變—不遺傳給后代；生殖細(xì)胞突變——遺傳給后代(四)廣泛性和有害性（多數(shù)）。定點(diǎn)突變：為了了解基因突變與其產(chǎn)物對個體表型的關(guān)系，有目的地在離體條件下制造位點(diǎn)特異突變。定點(diǎn)突變技術(shù)廣泛應(yīng)用與基因表達(dá)調(diào)控，遺傳和蛋白質(zhì)工程研究。定點(diǎn)突變技術(shù)包括各種核酸酶和突變劑制造突變技術(shù)；寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變；PCR定點(diǎn)突變。（掌握其中一種）。寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變：利用人工合成的寡核苷酸課制造任何部位的定點(diǎn)突變包括電突變、插入和缺失突變。原理：利用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段為引物，啟動單鏈（環(huán)狀）DNA分子進(jìn)行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成為新合成的DNA子鏈的一部分，而新鏈具有突變。為了達(dá)到這個目的，所設(shè)計的引物序列除了突變堿基外，其余序列要和吧基因編碼鏈的特定區(qū)域完全互補(bǔ)。程序：1，含有待突變基因的M13單鏈DNA合成（正鏈），待突變基因克隆到M13噬菌體上。2，突變寡核苷酸引物合成，應(yīng)用化學(xué)方法。3，異源雙鏈DNA分子的制備，突變引物的5'末端磷酸化后，于M13單鏈退火合成含有突變的異源dsDNA，在Klenow大片段酶作用下，引物以M13為模板合成，最后用T4DNA連接酶封閉缺口，合成閉環(huán)M13異源dsDNA。4，異源dsDNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌（后用Kunkel法和硫代磷核酸法不用純化）。5，突變體篩選，用32P標(biāo)記探針對噬菌斑雜交。6，突變基因鑒定與回收。提高效率的方法：硫代磷核苷酸誘變法：原理：限制性核酸內(nèi)切酶AvaⅠ，AvaⅡ，BanⅢ，HindⅡ，NciⅠ，PstⅠ，PvⅠ等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的DNA。用硫代磷核苷酸如dCTPαS及dNTPs,在DNA聚合酶催化和DNA連接酶作用下，形成異源dsDNA分子，再用NciⅠ消化該異源dsDNA分子，可獲的高效率的定點(diǎn)突變分子。特點(diǎn)：可獲得很高的突變率（點(diǎn)突變，缺失和插入突變）。Kunkel定點(diǎn)誘變法：在誘變前，先將復(fù)制型的M13噬菌體轉(zhuǎn)染到脫氧鳥苷三磷酸酶和尿嘧啶脫糖苷酶缺陷的大腸桿菌中（dut-，ung-）。Dut突變導(dǎo)致dUTP上升，而ung突變時尿嘧啶取代胸腺嘧啶。這種M13模板含有很多U，當(dāng)合成異源雙鏈時，新鏈含T，在轉(zhuǎn)染到ung正常的菌中，使得含U模板鏈在ung下發(fā)生斷裂而破壞，野生型噬菌體生成受抑制，突變型中不帶U被大量復(fù)制。使得后代噬菌體中多帶有突變目標(biāo)。突變的檢測：限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）等位基因特異性PCR（allelespecificPCR）毛細(xì)管電泳法（capillaryelectrophoresis）測序（sequencing）DNA芯片（chip）腫瘤相關(guān)基因癌基因(oncogene，onc.)是指細(xì)胞內(nèi)或病毒內(nèi)存在的，能控制細(xì)胞生長和分化的基因,它的結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常,可引起細(xì)胞癌變。原癌基因(proto-oncogene，pro-onc)正常細(xì)胞基因組中的細(xì)胞癌基因以非激活狀態(tài)存在。病毒癌基因：存在于病毒基因組的癌基因稱為病毒癌基因（v-onc）。它不編碼病毒的結(jié)構(gòu)成分，對病毒的復(fù)制也沒有作用，但其異常表達(dá)或表達(dá)產(chǎn)物的異?？梢允辜?xì)胞持續(xù)增殖。細(xì)胞癌基因：存在于正常細(xì)胞基因組的癌基因稱為細(xì)胞癌基因（c-onc）。在正常細(xì)胞內(nèi)可以表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化的功能。只有在一定的條件下發(fā)生改變而有過度表達(dá)時，才可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。細(xì)胞癌基因的特點(diǎn)：廣泛存在于生物界中；基因序列高度保守；作用通過其產(chǎn)物蛋白質(zhì)來體現(xiàn)；被激活后形成癌性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因，導(dǎo)致正常細(xì)胞癌變。細(xì)胞癌基因的分類：根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的功能和定位將癌基因分為1.生長因子類;2.生長因子受體類;3.非受體酪氨酸蛋白激酶類；4.絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類；5.GTP結(jié)合蛋白類;6.核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子類。原癌基因的激活因素包括，病毒，化學(xué)因素，輻射等。癌基因的激活機(jī)理：1.點(diǎn)突變：點(diǎn)突變改變了表達(dá)蛋白的氨基酸組成，造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常。點(diǎn)突變常見于ras癌基因。ras基因的表達(dá)產(chǎn)物Ras是一種小分子G蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，ras基因的點(diǎn)突變主要發(fā)生在第12、13和61位，正常Ras的作用因其自身的GTP酶活性而受到嚴(yán)格控制，而突變了的Ras其GTP酶活性下降或喪失，失去了原有控制，致使增殖信號持續(xù)作用，細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。啟動子插入：插入具有高活性的啟動子或增強(qiáng)子，使原癌基因持久、過量地表達(dá)。插入的啟動子或增強(qiáng)子來自細(xì)胞內(nèi)（內(nèi)源性）如：內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR。插入的啟動子或增強(qiáng)子來自細(xì)胞外（外源性）如：雞B淋巴細(xì)胞瘤由于ALV的LTR插入c-myc的旁側(cè)（5’或3’端），使c-myc過量表達(dá)?；驍U(kuò)增：基因拷貝數(shù)的增加稱為基因擴(kuò)增。原癌基因擴(kuò)增使轉(zhuǎn)錄模板增加，mRNA的水平增高，表達(dá)活性增加，產(chǎn)生過量的表達(dá)蛋白而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在某些造血系統(tǒng)惡性腫瘤中，癌基因擴(kuò)增是一個極常見的特征，如前髓細(xì)胞性白血病病人的白血病細(xì)胞中，c-myc擴(kuò)增8-32倍。4.染色體易位：原癌基因在腫瘤細(xì)胞中從染色體正常位置轉(zhuǎn)移到其他某個位置上稱為染色體易位。易位導(dǎo)致原來無活性的原癌基因移至啟動子或增強(qiáng)子附近而激活。易位后失去原旁側(cè)的抑制性調(diào)節(jié)作用，使其表達(dá)增強(qiáng)。抑癌基因：是正常細(xì)胞中所存在的能抑制腫瘤發(fā)生和生長的基因。也稱為腫瘤抑制基因或隱性癌基因。Rb基因：結(jié)構(gòu)：Rb是第一個被分離到的抑癌基因。人類Rb基因位于人13號染色體q14,全部序列約200kb,含27個外顯子,可轉(zhuǎn)錄出4.7kb的mRNA,該mRNA編碼分子量為105kD,故被稱之為p105蛋白，能與DNA結(jié)合。pRb上有9個Ser和Thr位點(diǎn)，其中只有5個位點(diǎn)的磷酸化與其功能變化有關(guān)。pRb至少有4個蛋白結(jié)合域，N-端結(jié)構(gòu)域與抑制細(xì)胞生長有關(guān)。pRb中間A、B兩個結(jié)構(gòu)域形成袋裝結(jié)構(gòu)，可特異與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。功能：調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。pRB具有兩種形式:磷酸化與非磷酸化。非磷酸化的P105為非活性型,可抑制細(xì)胞增殖。磷酸化的P105為活性型可促進(jìn)細(xì)胞增殖。pRB的磷酸化由周期素依賴性激酶(cyclindependentkinase,CDK)催化。周期素依賴性蛋白激酶(CDK)通過使特異底物磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)行，其活性依賴與周期素(cyclin)結(jié)合形成復(fù)合物。細(xì)胞周期的不同時相表達(dá)不同cyc-CDK，這些cyc-CDK復(fù)合物在各不同的細(xì)胞周期過渡點(diǎn)起作用。Rb基因?qū)δ[瘤的抑制作用與轉(zhuǎn)錄因子E-2F有關(guān)。E-2F是一類激活轉(zhuǎn)錄作用的活性蛋白，在G0、G1期，低磷酸化型的Rb蛋白與E－2F結(jié)合成復(fù)合物，使E－2F處于非活化狀態(tài)；在S期，Rb蛋白被磷酸化而與E－2F解離，結(jié)合狀態(tài)的E-2F變成游離狀態(tài)，細(xì)胞立即進(jìn)入增殖階段。當(dāng)Rb基因發(fā)生缺失或突變，喪失結(jié)合、抑制E-2F的能力，于是細(xì)胞增殖活躍，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Rb基因與腫瘤：Rb基因的失活主要與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生相關(guān)。此外，乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、食管癌、骨肉瘤、膀胱癌等均表現(xiàn)出Rb基因的缺失或失活。P53基因：結(jié)構(gòu)：p53基因定位17p13.1，長20kb，有11個外顯子，10個內(nèi)含子。p53基因轉(zhuǎn)錄生成2.5KbmRNA，編碼生成393個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為53KD。P53蛋白的一級結(jié)構(gòu)可分為三個結(jié)構(gòu)域：第一個結(jié)構(gòu)域：N-端17-80肽段富含酸性氨基酸，為酸性區(qū)（水解和磷酸化位點(diǎn)）。第二個結(jié)構(gòu)域：75-150肽段為核心疏水區(qū)，是高度保守和突變區(qū)。（DNA結(jié)合位點(diǎn)，激活P21基因產(chǎn)生抑制因子P21。）第三個結(jié)構(gòu)域：C-端319-393肽段富含堿性氨基酸，為堿性區(qū)。（四聚體和DNA非特異結(jié)合位）三個結(jié)構(gòu)域的主要功能：N-端1-43肽段：具有轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。中間102-292肽段：DNA結(jié)合區(qū)，能與DNA特異序列結(jié)合，結(jié)合時需要Zn2+參與。C-端300-393肽段為p53四聚體結(jié)合部位，該部位除與p53四聚體結(jié)合外，與DNA非特異結(jié)合也有關(guān)。功能：1)抑制細(xì)胞增殖：P53基因時刻監(jiān)控著基因的完整性，一旦細(xì)胞DNA遭到損害，P53蛋白與基因的DNA相應(yīng)部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子作用，活化P21基因轉(zhuǎn)錄，p21蛋白與cyclinE/CDK2結(jié)合抑制該激酶的活性和其對pRb的磷酸化，使細(xì)胞停滯于G1/S期；與cyclinA/CDK2結(jié)合使細(xì)胞停滯于G2/M期。當(dāng)DNA遭到損時P53基因與復(fù)制因子A相互作用參與DNA的損傷修復(fù)；如果修復(fù)失敗，p53蛋白即啟動程序性死亡過程誘導(dǎo)細(xì)胞自殺，阻止有癌變傾向突變細(xì)胞的生成，從而防止細(xì)胞惡變。2)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)：當(dāng)DNA因各種物理、化學(xué)因素引起DNA損傷時，P53蛋白與受損DNA部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子的作用，活化GADD45基因轉(zhuǎn)錄修復(fù)DNA。GADD45蛋白與CDK3和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合形成復(fù)合體（CDK3/GADD45/PCNA），促進(jìn)DNA修復(fù)。GADD45也可以P21/CDKS/GADD45/PCNA四聚體形式，促使DNA修復(fù)。3)P53蛋白還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：當(dāng)DNA損傷不能修復(fù)時，P53可誘導(dǎo)Bax基因表達(dá)，形成Bax/Bax復(fù)合體，因Bax基因具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外，當(dāng)DNA損傷時，細(xì)胞表達(dá)p53mRNA而導(dǎo)致GADD45基因表達(dá)水平升高，使細(xì)胞的生長停止或凋亡。p53的失活機(jī)理：P53蛋白與其它蛋白的相互作用,p53基因突變,都可導(dǎo)致p53的正常功能喪失。1）P53蛋白與其它蛋白的相互作用：DNA腫瘤病毒如HBV（HBX蛋白）、HPV16、18（E6蛋白），SV40和腺病毒編碼蛋白，這些癌蛋白能與P53蛋白結(jié)合，引起宿主細(xì)胞的惡性病變。P53還可與細(xì)胞癌基因產(chǎn)物相互作用而失活。如MDM2癌蛋白與P53相互作用后，促進(jìn)P53降解，故MDM2過度表達(dá)可致癌。2）p53的突變主要是雜合缺失和錯義突變，錯義突變常常發(fā)生在特定編碼區(qū)，如：175,245,248,249,273和282，也就是常說的突變熱點(diǎn)區(qū)，正對應(yīng)與p53基因高度保守區(qū)段。這些位點(diǎn)對p53蛋白的腫瘤抑制功能非常重要。因此，這些位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致p53的DNA結(jié)合區(qū)域單鏈殘基改變，而失去轉(zhuǎn)錄下游因子發(fā)揮腫瘤抑制功能，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。P53基因突變與腫瘤：人類50%腫瘤與P53基因突變有關(guān)：肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、食道癌、肺癌、造血器官腫瘤等以點(diǎn)突變（錯義）為常見。不同腫瘤突變的位點(diǎn)不同。肝癌p53基因突變以249位點(diǎn)突變最為常見。肺癌p53基因以157位顛換突變最為常見?；蛟\斷：利用分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，從DNA/RNA水平檢測分析致病基因的存在、變異和表達(dá)狀態(tài)，從而對疾病作出診斷的方法。基因診斷的特點(diǎn)：針對性強(qiáng)：以探測疾病基因?yàn)槟繕?biāo)，屬于“病因診斷”。特異性高：以分子雜交技術(shù)為基本原理靈敏度高：基因探針帶有十分敏感的檢測標(biāo)記，可從人類長達(dá)3×109kb的基因組中檢測出某一基因的單堿基改變。而且待測標(biāo)本微量。適應(yīng)性強(qiáng)：基因探針可為任何來源，任何種類，探針序列可為已知亦可未知，檢測目標(biāo)可為內(nèi)源基因亦可外源基因，診斷范圍廣。早期診斷：基因診斷不僅可對有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷，它還可在產(chǎn)前早期診斷遺傳性疾病；可檢出感染疾病潛伏期的病原微生物、還可預(yù)測和早期發(fā)現(xiàn)某些惡性腫瘤?；蛟\斷的基本技術(shù)：核酸分子雜交；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)；單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP，PCR-SSCP）；限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)；DNA序列測定；DNA芯片技術(shù)。基因治療：狹義概念：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。廣義概念：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委煹幕境绦颍褐委熁虻倪x擇→→基因載體的選擇（病毒載體，非病毒載體）→→靶細(xì)胞的選擇（體細(xì)胞，生殖細(xì)胞）→→將目的基因?qū)氚屑?xì)胞（基因轉(zhuǎn)移）→→轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定→→外源基因表達(dá)的檢測治療基因的選擇：在了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制基礎(chǔ)上，選擇對疾病有治療作用的特定基因。如對單基因缺陷遺傳病，可用野生型（非突變）基因即可用于治療；對于腫瘤，最好選擇某些與該類腫瘤密切相關(guān)的癌基因或抑癌基因用于基因治療。治療性基因獲得的方法很多：用酶切或探針雜交法從基因組DNA文庫、cDNA文庫獲得，或基因的克隆化，PCR擴(kuò)增，人工合成等方法?；蜉d體的選擇：基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達(dá)。常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等。非病毒載體：脂質(zhì)體、裸DNA等。靶細(xì)胞的選擇：基因治療的受體細(xì)胞有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞兩大類。對生殖細(xì)胞進(jìn)行基因治療，可使該生殖細(xì)胞分化發(fā)育成長的個體及其后代均具有正?；颍碚撋现v是根治遺傳病的理想方法。但由于涉及安全性和倫理學(xué)問題，目前基因治療中禁止使用生殖細(xì)胞作為靶細(xì)胞，只限于使用體細(xì)胞?；蛑委熤畜w細(xì)胞的選擇：發(fā)病的組織和器官的細(xì)胞；可以選擇患病器官周圍器官的細(xì)胞；容易取出或移植；容易在體外培養(yǎng)；容易轉(zhuǎn)導(dǎo)；具有較長的壽命。使用干細(xì)胞成為一個選擇的首要考慮?；蜣D(zhuǎn)移：非生物學(xué)方法(非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移)非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法包括物理的和化學(xué)的方法等。物理方法有顯微注射、電穿孔和基因槍技術(shù)等?；瘜W(xué)方法有磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等。生物學(xué)方法(病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移)：是以病毒為載體，將外源基因通過重組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細(xì)胞。包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體，單純皰疹病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）：目前應(yīng)用最多、最成功.病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA形成前病毒，插入宿主染色體，前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈即是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒并出芽釋放，成為感染性病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)：①高效感染宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率可達(dá)100%。②病毒基因和所載的外源基因都可能表達(dá)。③宿主范圍廣，可同時感染大量細(xì)胞并長期存留。缺點(diǎn)：①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒隨機(jī)插入靶細(xì)胞基因組中，因病毒具有強(qiáng)大的啟動子和增強(qiáng)子，能使插入點(diǎn)附近的基因過度表達(dá)或失活，插入的外源基因可能有不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；③逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用，可能使受體細(xì)胞癌變。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點(diǎn)，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點(diǎn)，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包裝信號。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定：標(biāo)記基因技術(shù)：在載體上引入一個標(biāo)記基因，或同時導(dǎo)入標(biāo)記基因，在轉(zhuǎn)染后的適當(dāng)時間選用合適劑量的選擇培養(yǎng)基，篩選標(biāo)記基因表型，那些已導(dǎo)入外源基因的細(xì)胞將存活下來，而未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則死于選擇性細(xì)胞培養(yǎng)基。如在較多的載體中都有neor標(biāo)記基因存在，若向培養(yǎng)基中加入G418進(jìn)行選擇，最后只有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞存活下來?；蛉毕菪褪荏w細(xì)胞技術(shù)：以基因缺陷型細(xì)胞作為靶細(xì)胞，將正?；?qū)牖蛉毕菪桶屑?xì)胞后，使用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。例如將TK基因?qū)隩K-的靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可在HAT培養(yǎng)基中生長，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則不能在HAT培養(yǎng)基中生長?；蚬厕D(zhuǎn)染技術(shù)：將目的基因表達(dá)載體DNA和標(biāo)記基因表達(dá)載體DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，分別使用標(biāo)記基因和目的基因?qū)?yīng)的選擇劑進(jìn)行兩次篩選，最后得到復(fù)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。分子雜交技術(shù)：常用的方法有原位雜效，Southern雜交。若靶細(xì)胞內(nèi)原來不存在所導(dǎo)入的目的基因，可選用目的基因作為探針；靶細(xì)胞內(nèi)一般無標(biāo)記基因存在，故標(biāo)記基因是良好的探針。探針大小可以是較大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA單鏈探針分子。外源基因的表達(dá)鑒定：在篩選出轉(zhuǎn)化分子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)狀況。其中包括對目的基因和標(biāo)記基因表達(dá)的鑒定。常用方法有：原位雜交&Northrn雜交檢測外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA；免疫組織化學(xué)染色：檢測外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。流式細(xì)胞儀：可定量分析外源基因的表達(dá)狀況。基因敲除：通過同源基因重組的過程定向的在活細(xì)胞中從基因組上移出特定基因的過程.從而建立基因細(xì)胞和基因生物。基因敲除的基本過程：構(gòu)建打靶載體→→將打靶載體導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)→→用陽性和陰性篩選標(biāo)志對轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞進(jìn)行篩選→→將同源重組的ES細(xì)胞導(dǎo)入小鼠胚泡中,再將胚泡植入假孕小鼠子宮中,培育出嵌合體小鼠→→篩選嵌合體小鼠→→雜交育種,獲得基因敲除的純合子小鼠?；蛑委煹呐R床應(yīng)用：1.導(dǎo)入抑癌基因:在多種腫瘤中抑癌基因的缺失或突變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，向這些腫瘤中導(dǎo)入抑癌基因可以抑制腫瘤的生長或誘導(dǎo)其死亡，如將野生型P53導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞可起到抑制腫瘤生長的作用?；虺聊夹g(shù):封閉癌基因的過度表達(dá)①反義RNA技術(shù):用一段與靶核酸序列互補(bǔ)的序列,互補(bǔ)結(jié)合后形成二聚體,從而阻止靶核酸的表達(dá)。②RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，它是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，通過一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)引發(fā)細(xì)胞中mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。機(jī)制：外源dsRNA

進(jìn)入細(xì)胞后可激活Dicer(RNAaseⅢ家族中的一員，主要切割dsRNA或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA前體成為小RNAs分子）,可以切割雙鏈RNA，產(chǎn)生小分子雙鏈RNA（siRNAs），siRNAs再與Dicer形成沉默復(fù)合物(RISC：是RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物），RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干涉的過程。RNA干擾：RNA干擾(RNAinterference，RNAi)，當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(dsRNA)時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致該基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象.發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。RNAi作用機(jī)制：1):在細(xì)胞內(nèi),雙鏈RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)Dicer在ATP的參與下被處理為21個～23個堿基的小RNA，即小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA是由19個～21個堿基配對形成的雙鏈,并在其3′末端有兩個游離未配對的核苷酸。siRNA是RNAi作用發(fā)生的重要中間分子。雙鏈的兩端各有2個～3個突出的非配對的3′堿基,兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基,這些是細(xì)胞賴以區(qū)分真正的siRNA和其他雙鏈RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ):siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)。RISC與基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端切割mRNA。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。分子生物學(xué)常用技術(shù)電泳:是指帶電粒子在電場中向與其自身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術(shù):利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。電泳的影響因素：自身因素：遷移率與分子的形狀，介質(zhì)粘度，顆粒所帶電荷有關(guān)。遷移率與顆表面電荷成正比，與介質(zhì)粘度及顆粒半徑成反比。顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動速度快，反之則泳動速度慢。外界因素：1.電場強(qiáng)度。強(qiáng)度越大，遷移速率越快pH：溶液pH覺得帶電顆粒解離程度和其所帶凈電荷的性質(zhì)和多少溶液離子強(qiáng)度。電泳液中的離子增加會使電泳遷移率降低電滲現(xiàn)象。液體在電場中對于一個固體支持物的相對移動，稱為電滲現(xiàn)象溫度。上升一度，遷移率上升2.4%。為降低熱效應(yīng)對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。通電產(chǎn)生焦耳熱。支持物的影響。對支持物的要求一般是均勻和吸附力小，否則電場強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及掃描圖譜無法重復(fù)。不連續(xù)PAGE電泳有三種物理效應(yīng)：電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定速度泳動分子篩效應(yīng)：區(qū)別不同大小分子種類的能力是凝膠所具有的一種篩分大小的能力即分子篩效應(yīng)。這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)：不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。原理：（1）緩沖液離子成分、PH的不連續(xù)性：電極緩沖液的pH=8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之間。電泳開始后，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度（電位與電導(dǎo)率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，當(dāng)二者速度相等時，形成一個不斷向正極移動的界面，蛋白質(zhì)夾在中間而被壓縮（2）凝膠孔徑的不連續(xù)性：在電場作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中阻力小，速度快，進(jìn)小孔膠時，阻力大，速度慢，在兩膠交界處，因遷移受阻而被壓縮。雜交：指兩個以上的分子因具有相近的化學(xué)性質(zhì)(或結(jié)構(gòu)互補(bǔ))而在適宜的條件下形成雜交體（hybrid）分子雜交的原理：是在DNA變性和復(fù)性的基礎(chǔ)上建立起來的一種分子生物學(xué)技術(shù).其原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則可以形成雙鏈(堿基對之間非共價健形成穩(wěn)定的雙鏈).核酸探針：核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記而便于檢測的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。包括基因組DNA，cDNA探針，寡核苷酸探針和RNA探針等。DNA探針的優(yōu)點(diǎn)：①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇。人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點(diǎn)：①短的探針比長探針雜交速度快。②可以在短時間內(nèi)大量制備。③在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。④可合成單鏈探針，避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。⑤寡核苷酸探針可以檢測小DNA片段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測在序列中單堿基對的錯配。Southern雜交(Southernbloting)的主要步驟：1.待測DNA樣品的制備、酶切2.待測DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳3.凝膠中DNA的變性：堿變性4.Southern轉(zhuǎn)膜：(硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜;毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法)5.探針的制備6.Southern雜交7.雜交結(jié)果的檢測Southern雜交的用途：用DNA探針。1)基因定性定量2)DNA物理圖譜3)基因變異重排4)基因限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性分析（RFLP）5)疾病診斷Northern雜交：DNA+RNA雜交。步驟與Southern相似。采用DNA探針和RNA探針。用途：1):基因表達(dá)(mRNA)定性定量2):transcripts(mRNA)splicingPCR基本原理：類似于DNA的天然復(fù)制過程，PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1):模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右后，雙鏈DNA變性解離為單鏈DNA；2):模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；3):引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。PCR反應(yīng)五要素：（引物，酶及其濃度，dNTP質(zhì)量和濃度，模板核酸，Mg2+濃度）1.引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)。設(shè)計引物的原則：1)引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。2)PCR產(chǎn)物：200-500bp，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。3)引物堿基：G+C含量以40-60%，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免4個單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)。4)避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3‘端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體。5)引物3’端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。6)引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性.7)引物5’端加上合適的酶切位點(diǎn)，這對被擴(kuò)增的靶序列的酶切分析或分子克隆很有好處。在算Tm值時不算,但在檢測互補(bǔ)和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們8)使用兼并引物時,要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)9)最好學(xué)會使用一種designsoftware.2.酶及其濃度：兩種TaqDNA聚合酶1)一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶2)基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量:2.5U(總反應(yīng)體積為100ul)濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。3.dNTP質(zhì)量與濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，4種dNTP的濃度要相等，如其中任何一種濃度偏高或偏低，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。4.模板核酸：DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板5.Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使得產(chǎn)物減少。PCR反應(yīng)條件：1:變性溫度與時間：94℃30-60sec。變性溫度低，解鏈不完全。溫度過高，高溫環(huán)境對酶的活性有影響。不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。2:退火(復(fù)性)溫度與時間：40℃～60℃30～60sec。退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。3:延伸溫度與時間：常用溫度為72℃。過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。4:循環(huán)次數(shù):25～40次循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。模板DNA少,酶質(zhì)量活性差,適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù).一般的循環(huán)次數(shù)選在25～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析：PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定。1.凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致。2.酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，還能進(jìn)行變異性研究。3.分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。4.核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。Sanger雙脫氧鏈終止法原理：通常DNA的復(fù)制需要：DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指導(dǎo)，不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補(bǔ)DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因?yàn)樗c普通dNTP不同，在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP（其中一種為α-32P標(biāo)記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5'-引物端和以ddC殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜,將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息，從而將全部C的位置確定下來。采用類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3'端結(jié)尾的三組長短不一的片段。將制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列；DNA芯片：是指通過微加工技術(shù)將大量的DNA以預(yù)先設(shè)計的排列方式有序地固定在載體表面，形成儲存有大量信息的DNA陣列。該陣列與標(biāo)記的核酸雜交后，能在短時間快速，準(zhǔn)確地獲取大量信息。DNA芯片分為兩類：1)