SARS動物感染模型-(1)課件

SARS動物感染模型組員：陳彤彤、胡珣、李玉瑤點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本SARS？重癥急性呼吸綜合征（SARS）為一種由SARS冠狀病毒（SARS-CoV）引起的急性呼吸道傳染病。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱,咳嗽,呼吸窘迫。該疾病傳染性強，

病死率高，大量病人死于呼吸衰竭，且出現(xiàn)肺纖維化及股骨頭壞死并發(fā)癥。主要傳播方式為近距離飛沫傳播或接觸患者呼吸道分泌物。點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本SARS動物感染模型的建立篩選動物種類，確定敏感動物。標化一定劑量感染性病原。經(jīng)適當途徑感染指定的動物。記錄臨床表現(xiàn)，確定和檢測特征性指標。評價模型點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本篩選動物種類，確定敏感動物恒河猴，別名獼猴、黃猴、廣西猴。是我國常見的一種猴類,分布地域范圍十分廣泛。適應性強，容易馴養(yǎng)繁殖，生理上與人類較接近，因此是生物學、心理學、醫(yī)學等多種學科研究工作中比較理想的試驗動物。恒河猴標化病原點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本病原體選取原則模型制備使用的病原體應處于活化狀態(tài)的最好病原（實驗室研究在培養(yǎng)48小時以后，到達頂峰，此時活性最好）導致相同感染性疾病的病原在不同地區(qū)存在差異，致病性也會不同，因此，應選擇生物學特性明確，經(jīng)過鑒定的標準株進行模型研究。SARSCoVNS—I株選擇感染途徑點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本SARS主要傳播方式為近距離飛沫傳播或接觸患者呼吸道分泌物選擇經(jīng)鼻吸入感染SARS病毒方法制作SARS感染的模型特征性指標的確定和檢測點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本臨床表現(xiàn)病原學指標病理生理性指標免疫學指標1.體溫:檢測體溫是否升高，正常猴體溫38℃。2.病毒分離培養(yǎng)：觀察細胞是否病變。3.病理檢查：取處死后的恒河猴組織，常規(guī)病理固定，HE染色，光鏡下觀察。4.病毒核酸檢測：在特定區(qū)域處出現(xiàn)特異性核酸擴增帶者為陽性，反之陰性。5.間接免疫熒光檢測:加FITC羊抗人IgG熒光抗體，在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，胞漿或胞膜上出現(xiàn)翠綠色熒光者為陽性，桔紅色者為陰性。點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本恒河猴感染SARS病毒致病模型的建立點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本實驗材料的準備1.SARSCoVNS—I株，為國家認可的SARSCoY標準株，由北京華特森基因科技有限公司提供。2.Vero細胞(163代)由武漢大學典型物保存中心提供，培養(yǎng)用MEM培養(yǎng)基+10％小牛血清，常規(guī)加入青、鏈霉素(自配)。3.普通恒河猴(MacacaRhesus)12只，2～3歲，約5kg左右，雌雄各半。健康良好，SARSCoVIgG檢測陰性，購自云南省動物繁殖中心。點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本動物分組和病毒感染1.設病毒感染組和非病毒感染組各6只恒河猴。2.猴籠保持空氣新鮮，維持相對濕度60％，溫度(2O±5)℃。3.感染部位常規(guī)消毒后，將病毒用注射器經(jīng)氣管軟骨氣管內(nèi)滴注，病毒滴度為10PFU／mL，感染劑量為0.5mL／只。點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本

病毒分離1.恒河猴感染病毒后，第2、5d分別靜脈采血2—3mL(不抗凝)；第3、5、7、9d采集鼻咽拭子和肛拭子，并置于1mL生理鹽水中；第1d后隔日采集尿液；上述標本存4℃。2.第10d各處死3只恒河猴及第14d各處死另3只恒河猴，并取肺組織存一3O℃。3.病毒感染前分別留血液、鼻咽拭子、肛拭子和尿液作為對照。4.病毒分離程序為：將組織制成10％勻漿或分泌物離心上清，取0．2mL／孔，接種到已長成單層的24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每份標本接種4孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)，觀察細胞病變，未病變標本盲傳3代并作間接免疫熒光檢測。點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本

病理檢查取處死后恒河猴的肺、肝、腎、脾、心臟和腦組織，常規(guī)病理固定、HE染色，光鏡下觀察。點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本

病毒核酸檢測1.提取RNA的過程：上述病毒分離材料(包括SARSCoVNS-I株)用TRIzolRNA抽提試劑(Invitrogen生命公司)抽提RNA，所提RNA溶于20uL無RNA酶的水中備用。2.逆轉(zhuǎn)錄過程為：組織RNA或SARSCoVNS一1株RNA4uL,加Oligo(dT)(0.5ug／uL)2uL補水至10.5uL，65℃變性10min，后立即至冰浴，依次加入5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4uL、0.1mol／LDTT2uL、0.01mol／LdNTP2uL、RNasin(40U／uL)0．5uL及AMV(5U／pL)1uL，43℃水浴1h，后立即至冰浴。點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本

病毒核酸檢測3.PCR擴增的過程：取cDNA5uL、10xTaq酶緩沖液5uL、dNTPs(0.01mol/L)2uL、引物1，2各1(序列見下)、Taq酶(2U／uL)1uL，補水至總體積50uL進行PCR擴增，反應參數(shù)為：94℃2min;94℃10s/55℃30s／68℃3min，共10個循環(huán)；94℃10s／55℃30s／68℃3min，共25個循環(huán)，后68℃7min延伸。引物序列為：5’CAGAGT-FGTGG1TCAAGTG3’(21431-21450)5’CACAGAGTAATCAGCAACAC3’(22538-22519)4.凝膠電泳的過程：反應產(chǎn)物經(jīng)含EB的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1．1kb處出現(xiàn)特異性核酸擴增帶者為陽性，反之陰性。正常組織、病毒標準株分別作陰陽性對照。點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本間接熒光免疫檢測1.感染細胞滴片晾干，冷丙酮固定30min。2.將己滅活的傳染性非典型性肺炎的恢復期病人血清標本適當稀釋后分別滴加到細胞抗原片上，置37℃濕盒中孵育30min，沖洗，PBS液中振蕩洗3次，晾干。3.然后加FITC羊抗人IgG熒光抗體，同前常規(guī)孵育、沖洗、晾干并封片，在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。4.胞漿或胞膜上出現(xiàn)翠綠色熒光者為陽性，桔紅色者為陰性。恒河猴SARS感染模型完成點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本恒河猴