生化實驗報告(數(shù)據(jù)處理)

生化實習報告班級：生物技術08指導教師：敖新宇、賈璐學號：姓名：日期：2009-12-19生物化學綜合實驗摘要：本次實驗包括苯丙氨酸解氨酶的純化及其活性測定和大玉米粉中營養(yǎng)成分的測定兩個實驗。關鍵詞：苯丙氨酸解氨酶、SephadexG—25層析、DEAE纖維素層析、活力、比活力、大玉米粉、凱式定氮法、索式提取法、3，5—二硝基水楊酸比色法。實驗一苯丙氨酸解氨酶的純化及其活性測定一實驗目的1.學習掌握分離純化生物大分子的方法；2.學習掌握酶活性的測定方法；3.了解在分離純化過程中酶活性的變化；4.了解高速冷凍離心機的操作步驟二實驗原理苯丙氨酸解氨酶（L—phenylalanine:ammonialyase,簡稱PAL；EC4.3.1.5）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關鍵酶，與一些重要的次生物質如木質素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切相關，在植物生長發(fā)育和抵制病菌侵害過程中起重要作用。PAL催化L—苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值。規(guī)定1h內(nèi)增加0.01為PAL的一個活力單位。酶的比活力是指樣品中每毫克蛋白質所含的酶活力單位數(shù)。在實驗中將會看到隨著PAL的逐步被純化，其比活力也在逐步增加。在蛋白質溶液中加入一定量的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）使蛋白質沉淀析出稱為鹽析。溶液的鹽濃度通常以鹽溶液的飽和度表示，飽和溶液稱100%飽和度。沉淀一種酶所需的具體濃度需要經(jīng)實驗確定。Sephadex(交聯(lián)葡萄糖凝膠)是有細菌葡聚糖長連，用交聯(lián)劑1—氯2—，3—環(huán)氯丙烷交聯(lián)而成。凝膠商品名后面的G值表示每克干膠吸水量（毫升數(shù)）的10倍。交聯(lián)度大，網(wǎng)孔??；交聯(lián)度小，網(wǎng)孔大。交聯(lián)度的大小還與凝膠顆粒的機械強度有關，交聯(lián)度大，機械強度也大（硬膠），在柱層析中流速快。根據(jù)需要，選用一定型號的的凝膠柱做柱層析介質（蛋白脫鹽一般用G—25或G—50，G—100~G—200分離不同分子質量的蛋白組分）。由于被分離物質的分子大小和形狀不同，分子質量大的進入凝膠網(wǎng)孔中被阻滯，從而后流出層析住，達到分離的目的。DEAE纖維素是以天然纖維素為母體聯(lián)結了二乙基氨基制備而成的。DEAE纖維素柱層析屬于陰離子交換層析的一種，DEAE纖維素經(jīng)過處理上柱后，由于靜電吸力等可吸引在固定相和流動相中的一些陰離子（如ＯＨˉ、Clˉ等）。蛋白質粉在水溶液中可以作為兩性解離，控制溶液PH，可使蛋白質分子或成為陰離子，或成為陽離子。對于DEAE纖維素而言，應使酶溶液PH大于酶蛋白分子的PH，使其成為陰離子。在實驗中還要測定蛋白質的含量，用考馬斯亮藍法?？捡R斯亮藍法是染料結合法的一種。考馬斯亮藍在游離狀態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌罢叩淖畲蠊馕赵?56nm。在一定的蛋白質濃度范圍內(nèi)（0—100微克/毫升），蛋白質-色素結合物在波長595nm處的光吸收與蛋白質的含量成正比，故可以用蛋白質的定量測定。而且該反應非常靈敏，可用于測微克級蛋白含量。三、實驗器材1.材料：土豆2.儀器：高速冷凍離心機、研缽、恒溫水浴鍋、電子天平、試管、燒杯、剪刀、量杯、層析柱、移液槍、膠頭滴管、蛋白質核酸自動分析儀、紫外分光光度儀、可見分光光度儀。3.試劑：0.1mol/L硼酸—硼砂緩沖液（PH8.7）、酶提取液：硼酸—硼砂緩沖液（含0.1mol/LEDTA、20mol/Lβ-巰基乙醇）、0.6mol/LL-苯丙氨酸溶液、6mol/LHCL、固體硫酸銨、0.02mol/L磷酸鹽緩沖液、sephadexG-25、DEAE纖維素52、標準蛋白質溶液（100μg/mlmL）、考馬斯亮藍G-250蛋白質染色液。四、實驗步驟1.酶液體?。?）用電子天平稱去土豆5g，剪成小段，加入體積酶提取液，于冰浴上同時加半勺左右的石英砂，用研缽研成漿。（2）用膠頭滴管將已經(jīng)勻漿的酶液轉入離心管，再用少量的提取液沖洗研缽及研棒，將沖洗液轉移到同一個離心管中，在1000轉離心10分鐘。（3）取離心后的上清液（即粗酶提取液），倒入量筒量出其體積（14.0ml），放置冰箱中備用。（4）從酶粗體取液中吸出1mL于eppendorf管中保留，作為后面活力測定用（貼好標簽，置于冰箱中）。2.硫酸銨分級沉淀酶蛋白（1）余下的酶液根據(jù)實際體積、溫度和硫酸銨飽和的用量表，算出達到38%飽和度應加入的酶液中的硫酸銨量（38%飽和100ml加硫酸銨21.32g），并稱硫酸銨（3.6904g）。（2）將酶液倒入燒杯內(nèi)，邊緩慢攪拌加入稱好的硫酸銨，待全部加完后，在緩慢攪拌10min，靜置10min；然后在1000r/pm下冷凍離心10min，保留上清液于燒杯中（上清液體積為3.5ml）。（3）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表，算出從38%到75%飽和度所需硫酸銨量（75%飽和100ml加硫酸銨26.3g），算出后加入3.6904g硫酸銨。（4）按上述方法處理，離心后，棄去上清液，保留沉淀。（5）將沉淀溶于2mL酶提取液中，取1mL也eppendorf管中保留，作為后面活力測定用（貼好標簽，置于冰箱中）。3.SephadexG—255g，加入適量的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，在室溫下溶脹。待溶脹平衡后，虹吸去上清液的細小顆粒，這樣處理2～3次。(2)裝柱：固定好層析柱，柱保持垂直，將20mL蒸餾水裝入柱內(nèi)，打開止水夾趕出去口內(nèi)氣泡，當柱內(nèi)保留1mL左右水層時，把處理好的SephadexG—25用玻璃棒攪勻，盡量一次加入柱內(nèi)，將膠床表面僅有1～2cm液層時，旋緊止水夾。裝好的膠柱應無氣泡、無節(jié)痕、床面平整，床面鋪一張圓形濾紙。（3）上樣：讓膠床表面幾乎不留液層，將1mL酶液小心注入膠床中央，注意不要沖壞床面，吸取1mL磷酸鹽緩沖溶液，把吸附在玻璃壁上的沉淀洗入住內(nèi)，在床面僅有1mL左右液層時，再小心的用膠頭滴管加入5～6cm高的磷酸鹽緩沖洗脫。（4）洗脫收集：用自動收集儀收集洗脫液，取刻度試管5支,編號，床柱面上不斷加磷酸鹽緩沖液洗脫（控制滴速），每管收集3mL。（5）打開檢測儀以及記錄儀。（6）將出現(xiàn)峰值的試管收集在一起，吸取1mL于eppendorf管中保留，作為后面活力測定用（總體積為3.9ml，然后貼上標簽，置于冰箱中）。4.EDAE纖維素朱梯度洗脫（1）稱取DEAE纖維素52干粉1～1.5g，加20mL的0.02ml/L磷酸鹽緩沖液浸泡4小時以上（或浸泡過夜）。（2）裝柱:把預處理的DEAE纖維素52裝柱（方法及要求同凝膠層析柱）。裝柱完成后，用2～3個床體積的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡該柱。（3）上樣：把所得酶洗脫液小心注入柱床面中央，所有注意點和方法也與凝膠層析中上樣相似。上樣結束后，在床面以上加入2～3cn液層，注意上樣就開始收集流出液。（4）洗柱：約用2倍體積的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液洗柱，收集洗柱液。按洗脫管編號，每隔3管取洗脫液0.1mL，測各管中PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脫液，吸取1mL于eppendorf管中保留，作為后面活力測定用（體積為7.0ml，然后貼好標簽，置于冰箱）。5酶活力測定取試管10支，按表中加入各溶液試管編號測定調零對照調零測定1對照1測定2對照2測定3對照3測定4對照40.1mol/L硼酸緩沖液（ml）4.004.003.904.903.904.903.904.903.904.90酶液（ml）——0.100.100.100.100.100.100.100.100.6mol/L苯丙氨酸溶液（ml）1.001.001.00—1.00—1.00—1.00—（2）將各管混勻，放入40℃恒溫水浴保溫1h，到時加入0.2ml2mol/LHCl終止反應。（3）紫外分光光度計預熱10min,于波長290nm處測定各管的A2906.蛋白質測定（考馬斯亮藍染色法）（1）取酶液0.1ml,用蒸餾水稀釋至5ml。（2）取12支試管分為兩組，按下表加入各溶液：試管編號123456標準蛋白溶液（ml）00.20.40.60.81.0蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.0考馬斯亮藍（ml）2.02.02.02.02.02.0（3）將上述各管混勻，靜置2min，測定各管的A595（4）取8支試管分為兩組，按下表加入各溶液：試管編號78910稀釋酶液（ml）1.01.01.01.0蒸餾水（ml）1.01.01.01.0考馬斯亮藍（ml）2.02.02.02.0注：粗酶提取液取0.1ml，加入4.9ml蒸餾水，稀釋50倍；硫酸銨沉淀0.1ml，加入9.9ml蒸餾水，稀釋100倍；凝膠層析稀釋0.1ml，加入4.9ml蒸餾水，50倍。（5）將上述各管混勻，靜置2min，測定各管的A595五實驗結果處理1.酶活力測定試管編號測定調零對照調零測定1對照1測定2對照2測定3對照3測定4對照4A5950.00000.00000.0826(0.1263)0.1006(0.1294)0.04310.4190.02260.00130.02150.0188注：(括號內(nèi)的數(shù)值為將加熱時間縮短為5min后的重復實驗的數(shù)值，計算時不取括號內(nèi)數(shù)值)試管編號∣測定1－對照1∣∣測定2－對照2∣∣測定3－對照3∣∣測定4－對照4∣A0.01800.00120.02130.0027總活力90.012.0106.52.7注：總活力計算公式：總活力=稀釋倍數(shù)*A／0.01粗酶提取液稀釋50倍硫酸銨沉淀稀釋100倍凝膠層析稀釋50倍離子交換層析沒有稀釋。;2.標準蛋白測定試管編號0123456789實驗組10.0000.1260.2210.3990.4810.5530.4690.3890.2580.413實驗組20.0000.1960.4090.4840.6610.6770.5210.2790.2220.528平均值0.00000.16100.31500.44150.57100.61500.49400.33400.48000.4705蛋白質微克數(shù)020406080100注：6—粗酶；7—硫酸銨沉淀；8—凝膠層析；9—離子交換層析由蛋白質標準曲線可得：試管編號6789蛋白質含量（ug）72.147.470.068.55.PAL總活力、比活力、蛋白質含量計算步驟體積（ml）蛋白質含量(mg)總活力（m）比活力(m/mg)粗提1.03.60590.020硫酸銨沉淀1.04.74012.02.5凝膠層析1.03.500106.530離子交換層析1.00.0682.739.7注：PAL比活力計算酶的比活力=酶液中PAL總活力單位數(shù)／酶液中蛋白質mg數(shù)實驗討論:為保證酶活性，整個實驗盡量在低溫下進行；層析主要與地面垂直，加樣時要小心，避免沖壞柱床表面；蛋白質與考馬斯亮藍G—250結合的反應十分迅速，在2min左右反應達到平衡；其結合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。因此測定時，不可放置太長時間，否則將使測定結果偏低；加樣和洗脫凝膠床平衡后，在床頂部留下數(shù)毫升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于總床體積的5%~10%。樣品濃度與分配系數(shù)無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘稠度將隨濃度的增大而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘稠度不得超過1.5—2。樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當樣品液面恰與凝膠床表面相切時，再加入數(shù)毫升洗脫液沖洗管壁，當其全部進入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設定好流速，然后分布收集洗脫液，并對每一份餾分做定性、定量測定；由于我們在收集離子交換層析時流速測定過快，記錄儀靈敏度偏高，導致峰不明顯。實驗二各種谷物中營養(yǎng)成分的測定實驗目的：掌握樣品中蛋白質含量的測定方法—凱氏定氮法掌握測定食物中的灰分、水分、油脂及碳水化合物的方法試驗原理：（一）大玉米粉中粗蛋白的測定（凱氏定氮法）谷物是人類特別是發(fā)展中國家人民的主要蛋白質的來源，谷物中蛋白質的含量是衡量其食品和營養(yǎng)價值的最重要的指標。對現(xiàn)有的谷物的進行評價、利用，對大批原始材料（種質資源）及育成品系篩選，都需要測定種子蛋白質的含量。測定蛋白質含量的方法很多，一般可分為直接法和間接法兩大類。本次試驗采用凱氏定氮法來測定蛋白質。含氮化合物（如：蛋白質）與濃硫酸共熱，含氮化合物既分解產(chǎn)化，氨氣與濃硫酸作用，生成硫酸銨。經(jīng)強堿（如：生氨氣（消化），氨氣又與濃硫酸作用，生成硫酸銨。經(jīng)強堿（如：30%—40%的氫氧化鈉）堿化使之分解放出氨氣，使蒸汽將氨氣蒸至酸液中（一般為硼酸），氨與酸液中的氫離子結合生成銨根離子，使溶液中的氫離子濃度下降。用標準鹽酸滴定，根據(jù)此酸被中和的程度，可計算樣品的含氮量。主要有以下反應：消化：Protein+H2SO4(濃)→（NH4）2SO4+CO2↑+SO2↑+H2O蒸餾：（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3↑+Na2SO4+2H2O吸收：2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O滴定：（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO4η粗蛋白=（C鹽酸ΧV滴定體積Χ14Χ含氮系數(shù)）∕M樣品總質量Χ100%試驗器材及材料儀器：電子天平、定氮儀、消化爐、消化管5支、排污管、不銹鋼架、消化架、干燥器、三角錐瓶250mlΧ5、微量滴定管、移液管（10ml1個、2mlΧ2、1mlΧ1、0.5mlΧ1）、水桶硫酸銅、硫酸鉀、葡萄糖、50%氫氧化鈉、4%硼酸、0.1mol/L鹽酸材料：玉米粉試驗步驟：消化消化樣品前，要將實驗儀器洗干凈并烘干。同時將樣品研磨成粉末狀。用電子天平準確稱取原料大玉米粉0.5000ɡ左右（兩份），用硫酸紙橋加入消化管底部。（注意：稱量樣品的時候，要用硫酸紙；加樣品時避免將樣品粘到消化管壁）。同樣用電子天平準確稱取0.5000g硫酸銅（催化劑，兩份）和3.000g硫酸鉀（提高硫酸的沸點，兩份），也用硫酸紙橋加入消化管底部。用移液管取10ml濃硫酸加入消化管（注意：濃硫酸具有強烈的腐蝕性，避免占到皮膚、衣服上以及地面上；如有濺出應立即清除）。另作兩空白對照，消化管中加入0.5000g葡萄糖，其他與上管相同。架好消化管，將消化管的管口與排污管的衡梁用密封圈封好，兩端用皮管接好通入盛滿水的水桶中。接通電源，初始消化時電壓調至90V，半小時后調至180V。待消化管變至澄清的綠色繼續(xù)加熱半小時。關閉電源前，要先將皮管從水桶里拿出，再關閉電源。靜置至消化管變冷，備用蒸餾。蒸餾定氮前，要按說明接好水管，檢查儀器是否正常。用一只消化管接在蒸汽入口處，要密封，在放250ml的三角瓶在氨氣出口管，打開冷凝管，開啟儀器，蒸汽清洗定氮儀半個小時。（將NaOH管通入50%的NaOH溶液中，打開NaOH開關，抽提溶液進入消化管中，關閉NaOH開關，為了讓整個NaOH管路中的水被NaOH替換）。清洗完畢后，關閉電源。用盛有樣品的消化管換下空消化管，用盛有50ml的4%硼酸的三角瓶替換空三角瓶，加1～2滴指示劑到硼酸三角瓶中，升高三角瓶直至出氨的玻璃管完全浸到硼酸液面下。將NaOH管通入50%NaOH中，打開NaOH開關，進50ml溶液進入消化管中，關閉NaOH。打開進水開關，儀器啟動完畢。當三角瓶溶液中的顏色變?yōu)樗{色繼續(xù)蒸餾10min，調低三角瓶，用洗瓶沖洗氨出口管，關閉定氮儀。用空消化管替換蒸餾完畢的消化管，同時用空三角瓶替換溶液顏色變?yōu)樗{色的三角瓶。啟動儀器，并且將NaOH管通入蒸餾水中，打開NaOH開關，吸取三次蒸餾水，沖洗管道中的濃堿。清洗半小時，關閉儀器。用0.1mol/LHCL滴定變色溶液，直至溶液顏色變?yōu)闆]有通入氨前的顏色。記錄體積。計算樣品中的含氮量。樣品中含氮量的計算η粗蛋白=（0.1mol/L×V滴定體積×14×含氮系數(shù)）/M樣品總質量×100%（含氮系數(shù)隨種子的不同而不同）二粗脂肪含量的測定（一）實驗原理高級脂肪酸與丙三醇或高級一元醇能生成單脂，單脂在與磷酸、含氮堿基或糖類結合可構成。單脂和復合脂參與細胞、細胞器等結構的形成，具有多方面的生物學功能。高級脂肪酸中的亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等是人和動物的必須脂肪，完全依賴從食物中獲得。因此，生物材料或農(nóng)產(chǎn)品中的高級脂肪酸組分的分析在生物科研和食品營養(yǎng)評價中具有重要的意義。油脂易容于乙醚、石油醚或乙烷中，利用脂類物質溶于有機溶劑的特性，可用有機溶劑提取。在索氏提取器中用有機溶劑（本實驗用乙醚，沸程30—60度，因采用沸點低于60℃的有機溶劑，不能提取出樣品中結合狀態(tài)的脂類，故此法又稱游離脂類定量法）對樣品的脂類進行提取。索氏提取器是有提取瓶、提取管、冷凝器三部分組成，提取管兩側分別有虹吸管和連接管。各部分連接處要嚴密不能漏氣。提取時，將待測樣品包在脫脂濾紙包內(nèi)，放入提取瓶內(nèi)。提取瓶內(nèi)加入乙醚。加熱提取瓶，乙醚氣化，由連接管上升進入冷凝器，凝成的液體滴入提取管內(nèi)，浸提樣品中的脂類物質。待提取管內(nèi)乙醚液面達到一定高度，溶有粗脂肪的乙醚虹吸管流入提取瓶。流入提取瓶的乙醚被加熱氣化、上升、冷凝、滴入提取瓶內(nèi)，如此循環(huán)往復知道抽提完為止。本法為重量法，將由樣品提取的粗脂肪，蒸去溶劑，干燥，稱重，渴求出粗脂肪的百分含量。（二）實驗器材和材料1．儀器：抽提瓶2個、虹吸管、冷凝管、蝴蝶夾、水浴鍋2．材料：玉米粉、乙醚（三）試驗步驟1、將抽提瓶洗干凈后放入幾粒沸石，然后放入烤箱中恒溫至恒重備用。2、將水浴鍋加入純凈水備用。3、稱取試驗材料5.000g，用濾紙包裹后放入抽提瓶中，慢慢加乙醚于抽提筒內(nèi)至溶劑稍高于虹吸管，使乙醚流入燒瓶中，然后再加入乙醚至虹吸管的1/3處（注：乙醚不能超過50ml），裝上冷凝管回流提取，調節(jié)水浴鍋溫度，使乙醚冷凝后下滴速度為2滴/秒。4、提取1.5小時后，當乙醚從提取器中全部流回燒瓶中便可以停止加熱，提高冷凝管，用鑷子取出濾紙筒，再放下冷凝管，繼續(xù)蒸餾。當乙醚快要達到虹吸管的高度時停止加熱，待冷凝管中不滴下乙醚后移走冷凝管，取出提取筒，將乙醚由虹吸管中倒入回收瓶中，重新安裝好儀器，繼續(xù)蒸餾，至冷凝管中不再滴下乙醚時即可停止加熱。5、拆下儀器，取出平底燒瓶放到烤箱中恒溫至恒重，用差量法稱出油脂的質量，計算含油率：η=【M油脂質量×100%】/M樣品總質量三、還原糖及總糖的測定（3，5-二硝基水楊酸比色法）（一）試驗原理測定還原糖和總糖的含量以往都是采用3，5-二硝基水楊酸比色法，各種單糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用溶解度不同，可將植物樣品中的單糖和多糖分別提取出來，再用酸水解法使沒有還原性的雙糖和單糖徹底水解成有還原性的單糖。此法運用廣泛，操作簡單，準確度高，沒有什么對材料的限制，因此，本次試驗還原糖和總糖的測定亦采用此方法。在堿性條件下，還原糖與3，5-二硝基水楊酸共熱，3，5-二硝基水楊酸被還原成3―氨基―5―硝基水楊酸（棕紅色物質），還原糖則被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質顏色深淺的程度成一定的比例關系，在540nm波長下測定棕紅色物質的消光值，查對標準曲線并計算，便可分別求出樣品中還原糖和總糖的含量。（二）試驗器材和材料1、儀器：電子天平、分光光度計、試管25ml×12、離心管、三角瓶100ml、燒杯100ml、容量瓶100ml×3、移液管（1ml×1、2ml×4、10ml×1）、恒溫水浴、沸水浴、離心機2、材料：玉米粉、1mg/ml葡萄糖標準溶液、3，5-二硝基水楊酸、碘―碘化鉀溶液、酚酞指示劑、6mol/L鹽酸、6mol/L氫氧化鈉（三）試驗步驟1、制作葡萄糖標準曲線取7支25ml刻度試管，編號，按下表操作：試劑管號123456葡萄糖標準溶液（ml）00.10.20.30.40.5蒸餾水（ml）1.00.90.80.70.60.53，5-二硝基水楊酸（ml）0.750.750.750.750.750.75將個試管搖勻，在沸水中加熱5min，取出后立即冷卻至室溫，再加10ml蒸餾水，混勻。在540nm波長下，以1號管調零，分別測定其余試管的吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，繪制標準曲線。樣品中還原糖和總糖含量的測定樣品中還原糖的提?。簻蚀_稱量3g樣品，放入100ml的三角瓶中，先以少量蒸餾水調成糊狀，然后加50ml蒸餾水，搖勻置于50度恒溫水浴中保溫20分鐘，使還原糖浸出。將浸出液（含沉淀）轉移到50ml離心管中，于4000r/min下離心5min，沉淀可用20ml蒸餾水洗一次，再離心，將二次離心的上清液收集在100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液?？偺堑乃夂吞崛。簻蚀_稱量1.00g樣品，放在100ml的三角瓶中，加入15ml蒸餾水及10ml6mol/L鹽酸，置于沸水浴中加熱水解30min（水解是否完全可用碘―碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1滴酚酞指示劑，用6mol/L氫氧化鈉中和至微紅色，用蒸餾水定容在100ml的容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過濾，取濾液10ml，移至另一100ml容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測液。顯色與比色取4支25ml刻度的試管，編號，按下表所示操作管號還原糖測定試管總糖測定試管abcd還原糖待測液（ml）0.50.5――總糖待測液（ml）――0.10.1蒸餾水（ml）0.50.50.90.93，5-二硝基水楊酸（ml）0.750.750.750.75其余操作均與制作葡萄糖標準曲線時相同。提示：標準曲線的制作與樣品含糖量的測定應該同時進行，一起顯色和比色。以管a、b的吸光度的平均值和管c、d的吸光度的平均值，分別在標準曲線上查出相應的還原糖毫克數(shù)。按下式計算樣品中還原糖和總糖的百分含量。還原糖%=【查曲線所得還原糖質量（mg）×提取液總體積/測定時取用體積×100%】/樣品質量（mg）總糖%=【查曲線所得水解后還原糖質量（mg）×稀釋倍數(shù)×100】/樣品質量（mg）四、樣品中灰分及水分的測定（恒重法）（一）樣品中灰分的測定1、試驗器材及材料馬沸爐、瓷坩堝2個、干燥器、玉米粉2、試驗步驟（1）洗兩個瓷坩堝放到烤箱干燥后，有鉛筆在瓷坩堝上標記，放到馬沸爐中恒重2小時；（馬沸爐的溫度為600度）。（2）待溫度降到200度左右時，將瓷坩堝取出放到干燥器中至室溫，用電子天平準確稱量其質量；記錄數(shù)據(jù)。（3）繼續(xù)講瓷坩堝放到馬沸爐中冷卻后稱出其質量，記下數(shù)據(jù)，兩次數(shù)據(jù)的相對誤差不超過萬分之五就可以用了。（4）在電子天平上稱取樣品材料1.000g放入其中，然后再電爐上炭化至無青煙飄出后，將瓷坩堝放到馬沸爐中（馬沸爐的溫度為600度），四小時后關閉馬沸爐電源，待溫度降到200度左右時，取出瓷坩堝冷卻后稱出質量。（5）再將瓷坩堝放回馬沸爐中恒溫1小時，待溫度降到200攝氏度左右時，取出瓷坩堝待冷卻后稱出其質量；兩次數(shù)據(jù)的相對誤差不超過萬分之五即可；（6）計算灰分含量η=【M灰分質量×100%】/M樣品總質量（二）樣品中水分的測定1.實驗器材和材料：稱量瓶2個，干燥器，玉米粉，面粉，玉玉米粉2.實驗步驟：將兩個洗凈的稱量瓶放到烤箱中恒溫干燥至恒重備用；分別稱取種子材料2g于稱量瓶中，然后放到烤箱中恒溫干燥至恒重；用減量法稱出稱量瓶的質量，計算水分含量η=【M水分質量×100%】/M樣品總質量玉米粉中營養(yǎng)成分的測定結果玉玉米粉中蛋白含量的計算（凱氏定氮法）蛋白質含量（%）=［（所用鹽酸的平均體積－空白實驗所用鹽酸平均體積）×鹽酸的摩爾質量×0.014×蛋白質系數(shù)×100］÷玉米粉質量（蛋白質系數(shù)：玉米粉為6.24，滴定所用的鹽酸摩爾質量為0.1mol/L）編號項目1組2組3組4組葡萄糖（g）0.00000.00000.00000.5013玉米粉（g）0.50050.50150.50090.0000硫酸銅（g）0.50350.50840.50590.5003硫酸鉀（g）2.99872.99933.00603.00000.1mol/LHCL滴定用量（ml）3.604.104.120.10（注：第一個數(shù)據(jù)是在沒有開冷凝管的時候測得的，不準確，應該舍去。）η玉米粉=［0.1mol/L×（4.11ml－0.10ml）×14×6.24］÷0.5012×100%=6.98%2.玉米粉中脂肪的測定項目編號玉米粉質量（g）空平底燒瓶質量（g）含油燒瓶質量（g）油脂質量（g）15.000583.312283.42250.11