植物生理學實驗報告葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)和葉綠素含量的測定

實驗報告課程名稱： 植物生理學及實驗 實驗類型：探索、綜合或驗證實驗項目名稱：葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)和葉綠素含量的測定實驗目的和要求掌握植物中葉綠體色素的提取分離和性質(zhì)鑒定、定量分析的原理和方法實驗內(nèi)容和原理以青菜為材料，提取和分離葉綠體色素并進行理化性質(zhì)測定和葉綠素含量分析。原理如下：葉綠素和類胡蘿卜素均不溶于水而溶于有機溶劑.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。皂化反應。葉綠素是二羧酸酯，與強堿反應，形成綠色的可溶性葉綠素鹽，就可與有機溶劑中的類胡蘿卜素分開。取代反應。在酸性或加溫條件下，葉綠素卟啉環(huán)中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去鎂葉綠素和綠色的銅代葉綠素。

H+取代Mg2+,Cu2+(Zn2+)取代H+。葉綠素受光激發(fā)，可發(fā)出紅色熒光，反射光下可見紅色熒光。透射光下呈綠色，反射光下呈紅色。光譜分析。葉綠素吸收紅光和蘭紫光，紅光區(qū)可用于定量分析，其中645和663用于定量葉綠素a,b及總量，而652可直接用于總量分析。三、主要儀器設備天平（萬分之一）、可掃描分光光度計（UV-1240）、離心機研具、各種容（量）器、酒精燈等四、操作方法與實驗步驟定性分析稱取鮮葉3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成勻漿取勻漿過濾，并倒入三角瓶中，同時觀察熒光現(xiàn)象。取三角瓶中約1ml溶液于小試管。加KOH數(shù)片劇烈搖均，加石油醚1ml和H2O1ml分層后觀察。取代反應：加醋酸約1ml，取1/2加醋酸銅粉加熱。觀察顏色變化。葉綠素和類胡蘿卜素的吸收光譜測定：取皂化反應的上層黃色石油醚溶液→稀釋（470nmOD0.5-1）取下層綠色溶液（留1/3），反復用石油醚粹取,直到無類胡蘿卜素,離心得葉綠素(鹽)→稀釋（663nmOD0.5-1）兩者在400-700nm處掃描光譜，分別測定類胡蘿卜素和葉綠素的吸收峰葉綠素定量分析：鮮葉0.1g，加1.9mlH2O，磨成勻漿，取2份0.2ml加95%酒精4.8ml,搖勻，8000轉(zhuǎn)離心5min,上清液在645，652，663測定OD，計算Chla,Chlb和Chl總量的值。五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理1、定性分析：觀察熒光現(xiàn)象，透射光為綠色，反射光為紅褐色光。皂化反應(3ml)：上層呈黃色，為類胡蘿卜素，吸收藍紫光。下層呈綠色，為葉綠素，吸收紅光和藍紫光。圖表SEQ圖表\*ARABIC1圖表SEQ圖表\*ARABIC2圖表SEQ圖表\*ARABIC3圖表SEQ圖表\*ARABIC1圖表SEQ圖表\*ARABIC2圖表SEQ圖表\*ARABIC3圖表SEQ圖表\*ARABIC4圖一在411nm以及432nm波長處吸收光譜出現(xiàn)峰值，都位于藍紫光的波長范圍內(nèi)，根據(jù)類胡蘿卜素吸收藍紫光的特性，可以推測圖二是類胡蘿卜素的吸收光譜。圖二在424nm左右及644nm左右波長處吸收光譜出現(xiàn)峰值，兩者分別位于藍紫光和紅光的波長范圍內(nèi)，根據(jù)葉綠素吸收藍紫光和紅光的特性，可以推測圖一是葉綠素的吸收光譜。3、葉綠素定量分析：將數(shù)值代入式子，計算得：波長/nm645652663OD第一組0.0870.1160.205第二組0.0810.1150.206第三組0.0880.1210.207平均0.0850.1170.206Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69OD645=12.7*0.206-2.69*0.087=2.38mg/LCb(mg/L)=22.9OD645-4.68OD663=22.9*0.085-4.68*0.206=0.982mg/LCT(mg/L)=Ca+Cb=3.36mg/LChla含量(mg/g.FW)=（Ca(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=1.19mg/g.FWChlb含量(mg/g.FW)=（Cb(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=0.491mg/g.FWChl總含量(mg/g.FW)=（CT(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=1.68mg/g.FW六、實驗結(jié)果與分析1、定性實驗中，各組實驗觀測是顏色變化基本相同，區(qū)別只是顏色的深淺，與研磨時加入的葉片量、研磨的程度等因素有關。2、從定量實驗所得數(shù)據(jù)的計算結(jié)果來看，實驗所用的葉片，葉綠素a的含量大約是葉綠素b的三倍左右。根據(jù)觀察比較其他小組的數(shù)據(jù)，“三倍”大致相同。3、鄰組所得實驗數(shù)據(jù)與我們的數(shù)據(jù)有一定差距，分析可能是因為研磨的充分程度不同和所取葉片位置不同，導致葉綠素含量有所區(qū)別。七、討論、心得1、為什么葉綠素吸收紅光和蘭紫光？葉綠素有基態(tài)（G），第一單線激發(fā)態(tài)（E1）和第二單線激發(fā)態(tài)（E2）及第三線態(tài)（E3），光子吸收必須遵守普朗克定律。被吸收光子能量必須等于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的能量差。藍紫光能量大，可使葉綠素分子中的電子躍遷到E2，而紅光能量小，只能使其躍遷到E1，故葉綠素只能吸收藍紫光和紅光。2、為什么可用皂化后的葉綠素鹽來測定葉綠素的吸收光譜？因為由于葉綠素皂化反應后的葉綠素鹽并不影響葉綠素分子的骨架結(jié)構(gòu)，葉綠素對光的吸收規(guī)律與葉綠素鹽對光的吸收規(guī)律幾乎是相同的，而且皂化反應可以從葉綠體色素中只篩選出葉綠素，排除了其他色素的干擾，所以可用皂化后的葉綠素鹽來測定葉綠素的吸收光譜。3、如要區(qū)分葉綠素a和b的吸收光譜，可用什么方法。 原理：葉綠素a在645nm和663nm處均有吸收，在645nm處吸光系數(shù)較小，，在663nm處較大；葉綠素b在645nm和663nm處亦都有吸收，但在645nm處吸光系數(shù)較大，在663nm