生物制藥-細(xì)胞工程單克隆抗體課件

EmilvonBehring,1901,

antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,

productionofantibodyNobelPrizewinners生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體發(fā)明單克隆抗體技術(shù)NobelPrizein1984生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體發(fā)展的三個階段單克隆抗體基因工程抗體多克隆抗血清生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體細(xì)胞工程雜交瘤技術(shù)鼠單抗人單抗大鼠小鼠產(chǎn)量高、操作比小鼠麻煩少用易操作、多用HAMA反應(yīng)人人雜交瘤人B細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞融合人鼠雜交瘤人B細(xì)胞、鼠骨髓瘤細(xì)胞融合雜交瘤制備人單抗的問題：染色體易丟失、抗體分泌不穩(wěn)定生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體美國已上市16種單克隆抗體藥物

2002年銷售額29億美元

2005年90億美元我國的單克隆抗體藥物市場還處于起步階段。生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體2002年完全人源化單抗humira獲得批準(zhǔn)上市，這是單克隆抗體藥物發(fā)展具有里程碑意義大事，預(yù)示著單克隆抗體藥物一個迅猛發(fā)展的新時代的來臨。Humira是Abbott/CAT公司開發(fā)的一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的單克隆抗體藥物。生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體Avastin

是美國剛剛上市的治療結(jié)腸癌的抗體藥物，也是第一個從抗體庫中篩選出的Fab段抗體藥物。Avastin的上市使公司的股價上升了90億美元。生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗血小板凝集的原理圖生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體藥物銷售趨勢圖生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體

全球有超過200家上市或未上市公司正在研發(fā)用于臨床診斷和治療的單克隆抗體正在進(jìn)行臨床試驗的抗體公司（38家）：AbgenixAlexionPharmAltarexAppliedMolecularEvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT(CambridgeAbTech)CelltechCenteonCentocor(Johnson&Johnson)ElanElsaiEliLillyGenzymeTransgenicsGenentechGenmabHoffman-LaRocheICOSPharmIDECPharm/MitsubishiImCloneSysImmunotechKaneboKnollPharmLeukoSiteMedarexMedimmuneNorvartisOrthoBiotechPasteur-MerieuxProgenicsProteinDesignLabScheringSmithKlineBeechamTanoxBiosystemsTechnicloneXomaZenyaku生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體TypeProductMarketerApprovedChimericRituxanNon-Hodgkin'slymphoma

Genentech

November1997

ChimericSimulectOrganrejectionprophylaxis

NovartisMay1998ChimericRemicadeRheumatoidarthritis,Crohn'sdiseaseohnson&JohnsonAugust1998CDR-graftedZenapax

OrganrejectionprophylaxisRocheDecember1997CDR-graftedSynagis

RespiratorysyncytialvirusMedimmuneJune1998CDR-graftedHerceptin

MetastaticbreastcancerGenentechSeptember1998CDR-graftedHerceptin

MetastaticbreastcancerGenentechSeptember1998CDR-graftedMylotarg

AcutemyeloidleukemiaAmericanHomeProductsMay2000MonoclonalAntibodiesontheMarket

生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體TypeProductMarketerApprovedMurine

RadiolabeledZevalin

Non-Hodgkin'sLymphomaIDECPharmaceuticalsandScheringAGMarch2002PhageDisplayHumira

RheumatoidarthritisAbbottLaboratoriesDecember2002CDR-graftedXolair

ModeratetoseverepersistentasthmaGenentechandNovartisJune2003Murine

RadiolabeledBexxar

CD20positive,follicular,Non-Hodgkin'sLymphomaCorixaandGlaxoSmithKlineJune2003CDR-graftedRaptiva

Chronicmoderate-to-severepsoriasisGenentechandXomaOctober2003ChimericErbitux

ColorectalcancerImcloneandBristol-MyersSquibbFebruary2004CDR-grafted

Avastin（Bevacizumab）colonandrectumcancer

GenentechFebruary2004MonoclonalAntibodiesontheMarket

生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體是對其抗原有極強(qiáng)專一性的魔彈或巡弋飛彈研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測

特定抗原醫(yī)療 以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細(xì)胞檢驗 以ELISA偵測特定

病原體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體SDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床的體內(nèi)診斷用抗體

131I-抗人肝癌單克隆抗體(HAb18、Hepama-1）

99mTc-抗人小細(xì)胞肺癌單克隆抗體（2F7）生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體SDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床的治療用單抗抗T細(xì)胞免疫毒素抗C-ALL免疫毒素131I-抗肝癌單克隆抗體抗人CD25單克隆抗體抗乙腦單克隆抗體抗流行性出血熱抗體抗人CD3單克隆抗體抗人IL-8單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體治療疾病的機(jī)制抗原失活免疫效應(yīng)細(xì)胞吞噬抗原表面弱化易受補(bǔ)體破壞生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體單抗研發(fā)的演變歷程鼠單抗100%鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠/人嵌合單抗(66-75%人源)ReoPro,RituxanRemicadeSimulect人源化單抗(90-95%人源)Zenapax,Mylotarg,Herceptin,CampathSynagis100%人源生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體攻擊病毒生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體凝集細(xì)菌生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗SARS的單抗SARS-CoV生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體生成技術(shù)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基●

每個

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性

抗原決定基

含有六個以上氨基酸生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)

噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體1多克隆抗血清對健康人用疫苗進(jìn)行主動免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分別采血并對血清蛋白進(jìn)行凝膠電泳分析。免疫前血清中的g球蛋白條帶較寬，免疫之后則相對集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的

球蛋白條帶缺失（c）。a1

a2bg白蛋白球蛋白（c）（a）（b）生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體來源:

組織和細(xì)胞，其成分比較復(fù)雜。

1.組織和細(xì)胞成分混合抗原制備

2.蛋白質(zhì)抗原制備

3.核酸抗原制備

4.類脂多糖抗原制備

5.免疫球蛋白片段制備

6.純化抗原的鑒定

二、可溶性抗原制備及鑒定可溶性抗原:蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、脂多糖、細(xì)菌外毒素和核酸可溶性抗原制備及鑒定返回生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體

組織和細(xì)胞成分混合抗原制備程序上清液澄清所用材料必須是新鮮或低溫保存的去除包膜或結(jié)締組織臟器進(jìn)行灌洗洗去血跡及污物NS內(nèi)含0.5g／LNaN2冷浴中組織剪碎裝入搗碎機(jī)簡內(nèi)高速粉碎制成組織勻漿液3000r／min×10min取上清液去除細(xì)胞碎片及微小組織離心生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體

綿羊紅細(xì)胞的制備流程圖搖動15-20min

4℃可保存3周取適量NS洗滌3次2000r/min10minNS稀釋至

2～5%生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體

細(xì)菌細(xì)胞抗原的制備流程圖液體培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)

37℃24h100℃水浴

2～2.5h

殺菌無菌試驗NS稀釋成8～10億/mlO菌體抗原返回生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體雜交瘤技術(shù)過程生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體多克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體多克隆抗體（polyclonalantibody）指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。

實際意義：（1）預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清抗破傷風(fēng)，胎盤球蛋白抗病毒感染等副作用：

超敏反應(yīng)（2）臨床診斷，如：肥達(dá)氏反應(yīng)--傷寒、副傷寒缺點：特異性差。生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體多價抗原單克?。ㄖ旅舻腂細(xì)胞）單克隆抗體單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體

傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體可生產(chǎn)有用抗體的

淋巴細(xì)胞

若與

癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個Bcell只產(chǎn)生一種抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體

●

一個

B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一

抗原決定基?！?/p>

若有許多抗原決定基，則需許多株

B細(xì)胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體1234mmmm1234YYYYYYYYY生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細(xì)胞（Subcloning）

(確定只有一種細(xì)胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗專一性對抗原的反應(yīng)無法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體的結(jié)構(gòu)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體1小分子抗體3鼠單抗人源化基因工程改造的抗體2生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體(1)小分子抗體123生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體小分子抗體Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段SdAb：單區(qū)抗體

生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈表達(dá)載體L鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞PrVHCH1PrVLCL圖5Fab抗體分子的制備IFabantibodymolecule生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體分泌細(xì)胞VHVLCL-S-S-CH1圖5Fab抗體分子的制備生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體IIFvantibodymolecule生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體雙特異性抗體抗原A抗原B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVL許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價的抗原結(jié)合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體(2)抗體融合蛋白

抗原結(jié)合部位與生物活性蛋白結(jié)合

含F(xiàn)c段的抗體融合蛋白—免疫黏附素

Fc的作用：檢測、純化、 延長血清中半壽期 生物學(xué)效應(yīng)功能生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體G-CSFFcFusionProteinDNAligationexpressionFc的作用：延長血清中半壽期生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體(3)鼠單抗人源化將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體●恒定區(qū)人源化——人-鼠嵌合抗體●可變區(qū)人源化——人改型抗體●用抗體庫技術(shù)進(jìn)行人源化生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體鼠單抗人源化生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體意義：多種特異的鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療人改型抗體（CDR移植）

人源化抗體又稱CDR移植抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體圖4鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體庫技術(shù)抗體庫——在原核系統(tǒng)功能性表達(dá)多樣性抗體基因(repertoire)三基因工程方法研制新的單抗生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體庫技術(shù)產(chǎn)生的三項技術(shù)基礎(chǔ)

RT-PCR：能夠克隆全套抗體可變區(qū)基因抗體基因片段在大腸桿菌的功能性表達(dá)噬菌體展示技術(shù)（phagedisplay)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體接頭DNAVHVL圖2噬菌體表面呈現(xiàn)的小分子抗體基因III或基因VIII外殼蛋白VHVL生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體噬菌體抗體圖示生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性噬菌體抗體庫技術(shù)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體用PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性的抗體片段?？贵w庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機(jī)組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人（一）基本原理和程序生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體噬菌體抗體庫生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的Ig基因片段；構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有λ噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達(dá)的噬菌體抗體庫(surfacedisplayantibodylibrary)常用載體；表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。構(gòu)建噬菌體抗體庫生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達(dá)到或超過1011庫容,能包含B細(xì)胞全部克隆建庫的外源基因來自人體多克隆細(xì)胞的總mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)抗體庫的大容量抗體庫極高的篩選效率可獲得高親和力的人源化抗體VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程所用的抗體基因又來自人體（二）噬菌體抗體庫技術(shù)的特點生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體庫的構(gòu)建生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體庫的富集篩選生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體13%21.7%52.3%13%

生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體治療性抗體的研發(fā)階段靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)抗體制備抗體篩選、確認(rèn)和優(yōu)化中試工藝研究臨床前研究臨床研究生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體主要研究進(jìn)展靶抗原的發(fā)現(xiàn)抗體人源化改造及人源抗體制備提高抗體效應(yīng)功能提高抗體表達(dá)量其他生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體靶抗原的發(fā)現(xiàn)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體TRAIL:TNF-relatedapoptosis-inducedligandTRAILR:DR4、DR5、DcR1、DcR2、OPG生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體ProteinextractionanddigestionTreated/SickControl/HealthyMassSpectrometerProteinpeptidesidentificationMSspectraquantificationcharacterizationKKYAAELHLVPOPhosphorylationKAVQQPDGLAOxidation…posttranslationalmodifications(PTM)QFHFHWGSLDQPDGLAPeptidesandMS/MSspectraHPLCProteomics生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體20a5-6HeavyChainC5a新功能表位的確定20a5-6LightChain20a5-6Fab20a5-6Fab/C5a功能單抗識別表位可能是一個新的藥靶？生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體主要研究進(jìn)展靶抗原的發(fā)現(xiàn)抗體人源化改造及人源抗體制備提高抗體效應(yīng)功能提高抗體表達(dá)量其他生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體治療性抗體產(chǎn)生抗－抗體的比例生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體人源化的主要技術(shù)嵌合抗體CDR移植,FR移植,SDR移植表面氨基酸殘基人源化抗原表位定向選擇生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體嵌合抗體、CDR移植抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體SDR人源化方法生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體鼠抗體（紅）和人源化抗體（綠）Fv結(jié)構(gòu)的疊合圖表面氨基酸殘基人源化生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體鼠源抗體/抗原作用的復(fù)合物模型人源化抗體/抗原作用的復(fù)合物模型人源化抗體識別的抗原表位與親本抗體相同生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗原表位定向選擇HL人抗體重鏈文庫LHLLLLHLHLHHHH高親和力人抗體抗原親和篩選抗原親和篩選+人抗體輕鏈文庫人-鼠抗體庫+鼠抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體人源抗體制備技術(shù)

人х人雜交瘤技術(shù)

EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)人源抗體庫噬菌體抗體庫合成抗體庫核糖體展示抗體庫轉(zhuǎn)基因動物生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體人源抗體的生產(chǎn)過程生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體大容量抗體庫107~8108~9抗體親和力10-6~10-710-7~10-8109抗體庫容>10910-8~10-9生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體合成抗體庫生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體核糖體展示scFv文庫生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體各種抗體庫篩選方法生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體感染性篩選生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗原庫對抗體庫篩選方法生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體提高抗體特異性和親和力Chainshuffling計算機(jī)模建技術(shù)定點突變技術(shù)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體chainshuffling原理示意圖LHLLLLHLHLHHHHHL更高親和力抗體親和篩選建抗體庫親和篩選+重鏈文庫建抗體庫輕鏈文庫高親和力抗體+親本抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體計算機(jī)模建預(yù)測抗體親和力和識別表位HA2HA4HC4H22結(jié)合自由能分子間氫鍵識別區(qū)域表位是否漂移Z12-378.2-402.5-435.6-434.2-431.6182128383420-3223-30,70-8976-92136-147140-146是是是否生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體分子間氫鍵相互作用能（KJ）主要識別區(qū)域mCH2238-427.44136-149CH2236-425.37136-149抗體H22計算機(jī)分子設(shè)計與直接進(jìn)化生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體[S]-[B](10-11M)Ka~6x1010L/molB/F抗體CH22m親和常數(shù)測定ItemsZ12Ka=8×107M-11/750CH22Ka=9×109M-11/6.5mCH22Ka=6×1010M-11Remicade?Ka=1×1010M-11/6Antibodyaffinity生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體移植人免疫球蛋白的小鼠生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體結(jié)構(gòu)信息具有重要的研究價值生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體PDBView抗體結(jié)構(gòu)分析抗體序列分析抗體表達(dá)分析抗體分類管理BLAST系統(tǒng)日志管理用戶權(quán)限管理Kabat本地數(shù)據(jù)庫抗體分類系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置系統(tǒng)字典設(shè)置外部數(shù)據(jù)接口PDBGENEBANKSwiss-ProtTRRDKABAT本實驗室抗體數(shù)據(jù)庫抗體分析系統(tǒng)主界面抗體專家分析系統(tǒng)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體Her2靶點人源抗體（HF)的設(shè)計與驗證Her2晶體結(jié)構(gòu)D4SDS非還原電泳155KDaHF人源表達(dá)抗體的純化和功能鑒定HF人源抗體基因合成、構(gòu)建、表達(dá)人源化抗體設(shè)計、虛擬篩選抗體專家分析系統(tǒng)抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)信息分析HF人源抗體對Her2+

+細(xì)胞的ADCC殺傷效應(yīng)分析HFSKVO3–Her2+++MCF7-Her2+HerceptinSKVO3–Her2+++MCF7-Her2+HF人源抗體對Her2靶點的特異性識別生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體新抗體或抗體類似物的設(shè)計以抗原－抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計新抗體以人抗體Fc為支架設(shè)計類抗體以全人抗體為支架設(shè)計小抗體以非Ig的人蛋白為支架設(shè)計功能分子生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體PT4－Linker－FC融合蛋白的構(gòu)象

PT4-Linker-FC與TNF-α相互作用復(fù)合物的構(gòu)象拮抗肽－linker－Fc融合蛋白設(shè)計生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體可變區(qū)框架作為支架VH結(jié)構(gòu)域能夠保持一定的剛性；

VH在空間上能夠?qū)讉€短肽展示在一定的區(qū)域內(nèi)；

抗體可變區(qū)骨架展示的外源肽段長度可以改變。

CDR3CDR1CDR2FR1FR2FR3FR4生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體單域抗體（PTVH5）設(shè)計PTVH5與TNF形成的復(fù)合物模型生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體單域抗體單鏈抗體(scFv)單鏈抗體（TSA1、TSA2）設(shè)計生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體主要研究進(jìn)展靶抗原的發(fā)現(xiàn)抗體人源化改造及人源抗體制備提高抗體效應(yīng)功能提高抗體表達(dá)量其他生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體提高抗體效應(yīng)功能偶聯(lián)細(xì)胞毒物質(zhì)雙特異性抗體抗體Fc突變改變抗體糖基化細(xì)胞內(nèi)抗體抗體融合蛋白生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體藥物的作用機(jī)理直接效應(yīng)誘導(dǎo)凋亡抑制增殖阻斷生長因子或生長因子受體干擾血管生成間接效應(yīng)依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒（CDC）依賴抗體的細(xì)胞毒（ADCC)

作為毒素、放射性同位素和細(xì)胞毒藥物的載體形成抗獨特型抗體通過雙特異性抗體靶向效應(yīng)細(xì)胞生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體偶聯(lián)細(xì)胞毒物質(zhì)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體TUMORCELL-S-S-Fab免疫毒素(植物和細(xì)菌)同位素(I131,I125,In111)抗體導(dǎo)向化學(xué)療法（甲氨喋呤,長春新堿,阿霉素）裂解藥物的酶抗體偶聯(lián)細(xì)胞毒物質(zhì)

-S-S-生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體（鏈親和素）生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體免疫毒素（白喉毒素

蓖麻毒素

相思豆毒素）CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體融合蛋白生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體融合蛋白

抗人Her2/neu單抗-IL-2

CTLA-4-Ig

抗纖維蛋白-ProUK抗活化血小板-UK生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體雙功能抗體作用原理生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體BsAbBsAb效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞觸發(fā)受體膜表面分子NK細(xì)胞

CD16腫瘤細(xì)胞HER2/neu抗HER2/neu×抗CD16BsAbBsAb雙特異性抗體介導(dǎo)的殺傷作用機(jī)制（a),BsAb橋連效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞；(b),連接的觸發(fā)分子啟動細(xì)胞毒反應(yīng)；(c),效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞產(chǎn)生致死性殺傷反應(yīng)。

細(xì)胞毒反應(yīng)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體細(xì)胞內(nèi)抗體：在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體細(xì)胞核EGFREGFREGFR生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體目前細(xì)胞內(nèi)抗體的研究主要集中在單鏈抗體上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信號（targetingsignals），如分泌信號、核定位信號、線粒體定位信號和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號等，從而進(jìn)行檢測、識別、發(fā)揮特定功能。細(xì)胞內(nèi)抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體細(xì)胞內(nèi)抗體的作用機(jī)理阻斷靶蛋白的活性部位阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白－蛋白相互作用干擾細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的轉(zhuǎn)運促使靶蛋白降解生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體細(xì)胞內(nèi)抗體的應(yīng)用：由于細(xì)胞內(nèi)抗體具有高親和力及選擇結(jié)合特性，因而可通過多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞的生理過程及代謝。主要為：分子功能的研究下調(diào)生長因子受體的表達(dá)抑制細(xì)胞內(nèi)癌蛋白的活性抑制病毒復(fù)制，如

抗HIV外殼蛋白

gp120抑制艾滋病毒復(fù)制

生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體細(xì)胞內(nèi)抗體廣泛應(yīng)用前存在的問題：基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立，特別是體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移時基因的靶向傳遞的問題，使細(xì)胞內(nèi)抗體基因?qū)氤渥銛?shù)量的靶細(xì)胞中；細(xì)胞內(nèi)抗體基因的持久表達(dá)及使細(xì)胞內(nèi)抗體達(dá)到一定的濃度；細(xì)胞內(nèi)抗體應(yīng)無毒及不具免疫原性。鼠源性ScFv可引起人體發(fā)生細(xì)胞毒性T-細(xì)胞反應(yīng)。應(yīng)用人源性或人源化抗體可克服此問題。生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體的ADCC和CDC效應(yīng)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體提高ADCC和CDC的策略抗體Fc突變改變抗體糖基化生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體RituximabFc的三維結(jié)構(gòu)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體Rituximab突變體與C1q的結(jié)合生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體主要研究進(jìn)展靶抗原的發(fā)現(xiàn)抗體人源化改造及人源抗體制備提高抗體效應(yīng)功能提高抗體表達(dá)量其他生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體提高表達(dá)量的方法應(yīng)用擴(kuò)增系統(tǒng)GS/DHFR弱化選擇標(biāo)記基因應(yīng)用有利于基因表達(dá)的元件

強(qiáng)啟動子強(qiáng)增強(qiáng)子反式作用元件位置效應(yīng)（positioneffects)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體Cre-LoxP定點整合系統(tǒng)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體的糖基化生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體主要研究進(jìn)展靶抗原的發(fā)現(xiàn)抗體人源化改造及人源抗體制備提高抗體效應(yīng)功能提高抗體表達(dá)量其他生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體抗體可變區(qū)和框架區(qū)的影響抗體穩(wěn)定性可溶性折疊動力學(xué)表達(dá)生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體PEG化的抗體或抗體片段生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體重組多克隆抗體生物制藥_細(xì)胞工程單克隆抗體

重組多克隆抗體優(yōu)點：可大量生產(chǎn)，批間穩(wěn)定性好