JJF(皖) 161-2023 熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)規(guī)范

(皖)安徽省地方計(jì)量技術(shù)規(guī)范熒光法葉綠素aCalibrationSpecificationforFluorescenceInstrumentsofChlorophylla2023-07-21發(fā)布 2023-09-01實(shí)施安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布JJF（皖）161—2023JJF（皖）161—2023JJF（皖）161—2023a校準(zhǔn)規(guī)范JJF（皖）161—2023CalibrationSpecificationforFluorescenceInstrumentsofChlorophylla主要起草單位：安徽省計(jì)量科學(xué)研究院參加起草單位：安徽省合肥生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心安徽省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心廈門斯坦道科學(xué)儀器股份有限公司本規(guī)范委托安徽省計(jì)量科學(xué)研究院負(fù)責(zé)解釋本規(guī)范主要起草人：郝瑋（安徽省計(jì)量科學(xué)研究院）徐?。ò不帐∮?jì)量科學(xué)研究院）李連（安徽省計(jì)量科學(xué)研究院）何淑蓮（安徽省計(jì)量科學(xué)研究院）參加起草人：何前鋒（安徽省合肥生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心）張勁松（安徽省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心）柯慧賢（廈門斯坦道科學(xué)儀器股份有限公司）JJF（皖）161—2023JJF（皖）161—2023目 錄引言 II范圍 1引用文件 1概述 1計(jì)量特性 1校準(zhǔn)條件 2環(huán)境條件 2測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備 2校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法 2線性誤差 2重復(fù)性 3穩(wěn)定性 3示值誤差 4校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá) 4復(fù)校時(shí)間間隔 4附錄A標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法 5附錄B葉綠素a參考測(cè)定方法（分光光度法） 6附錄C熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)記錄參考格式 10附錄D熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)證書內(nèi)頁(yè)參考格式 10附錄E熒光法葉綠素a測(cè)定儀線性誤差測(cè)量不確定度評(píng)定示例 12I引 言JJF1001-2011JJF1071-2010JJF1059.1-2012GB/T6682-2008HJaIIJJF（皖）161—2023JJF（皖）161—2023PAGEPAGE10范圍

熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)規(guī)范本規(guī)范適用于測(cè)量范圍（0.2～200）μg/La準(zhǔn)。引用文件本規(guī)范引用了下列文件：GB/T14581-1993水質(zhì)湖泊和水庫(kù)采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ494-2009水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ897-2017 aHJ/T91-2002地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。概述a（以下簡(jiǎn)稱儀器）aaaa1光源檢測(cè)器指示器光源檢測(cè)器指示器圖1儀器原理示意圖計(jì)量特性儀器的計(jì)量特性要求見表1。表1計(jì)量特性要求校準(zhǔn)項(xiàng)目計(jì)量特性要求線性誤差±10%重復(fù)性≤5%穩(wěn)定性≤5%/h示值誤差±20%以上計(jì)量特性要求僅供參考，不作為判定依據(jù)。校準(zhǔn)條件環(huán)境溫度：5℃～40℃。電源電壓及頻率：AC(220±22)V，(50±0.5)Hz。B3%（k=2）A。A《HJ897-2017a45校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法線性誤差5綠素aB0.2～200μg/L0.2μg/L50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L3Ba到儀器的線性方程，見公式（1）。

yabx

（1）式中：y——儀器測(cè)得的葉綠素a濃度值，μg/L；a——截距；b——斜率；——B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L。按公式（2）計(jì)算各測(cè)量點(diǎn)線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值，按照公式（3）計(jì)算線性誤差（不包含最低濃度點(diǎn)），取結(jié)果絕對(duì)值最大值為儀器的線性誤差校準(zhǔn)結(jié)果。xyiai b

（2）xi

xixsi100%xsi

（3）式中：yi——ia——iB濃度值，μg/L；xsi——iB標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L；xi——第i點(diǎn)的線性誤差，%。重復(fù)性7選用對(duì)應(yīng)葉綠素a20μg/L的羅丹明B7（5）（6）7ic=i1 7

（4）7(7(cc)2ii1 71s=s100%

（5）（6）r c式中：ci——儀器第i次測(cè)得值，μg/L；c——7次測(cè)量值的平均值，μg/L；s——單次測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，μg/L，sr——儀器重復(fù)性，%。穩(wěn)定性a20μg/LB值10min11h，記錄儀器測(cè)量值，按公式（7）S=cic0max100%c0

（7）式中：S——儀器穩(wěn)定性，%；ci——每10min測(cè)得值，μg/L；c0——初始測(cè)量值，μg/L。示值誤差a2份，作為儀器的校1Ba濃133按公式（8）計(jì)算儀器示值誤差cr。c=ccs100%

（8）rcsr式中：cr——示值誤差，%；c——儀器3次測(cè)量值的平均值，μg/L；cs——分光光度法測(cè)得的葉綠素a濃度值，μg/L。校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)JJF1071-20105.12C，校準(zhǔn)證書（內(nèi)頁(yè)）D。復(fù)校時(shí)間間隔由于復(fù)校時(shí)間間隔是由儀器的使用者、使用情況以及儀器本身質(zhì)量等諸因素所決定的，因此，送校單位可根據(jù)實(shí)際使用情況自主決定復(fù)校時(shí)間間隔。建議復(fù)校時(shí)間間隔一般不超過1年。如果儀器更換重要部件、維修或?qū)x器性能有懷疑時(shí)，應(yīng)隨時(shí)校準(zhǔn)。附錄A標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法B被列入可能致癌/套。B有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對(duì)擴(kuò)展不確定度不大于3%（k=2）。B標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（20℃下），BB標(biāo)準(zhǔn)溶液。例如，根據(jù)2020μg/LaB290μg/L。10mL1mg/mLB1000mL單標(biāo)1000mL10mg/LB儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液。再用分度吸量管移取29mLB儲(chǔ)備溶液置于1000mL290μg/LB稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液。B標(biāo)準(zhǔn)溶液的保存與使用B儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液需在（0～4）℃下避光保存，防止分B24h內(nèi)使用。廢液處理實(shí)驗(yàn)室過程中產(chǎn)生的廢液，應(yīng)集中收集，并做好相應(yīng)的標(biāo)識(shí)，委托有資質(zhì)的單位處理。附錄B

葉綠素a參考測(cè)定方法（分光光度法）將一定量樣品用濾膜過濾截留藻類，研磨破碎藻類細(xì)胞，用丙酮溶液提取葉綠750nm664nm647nm和630nma的濃度。試劑和材料除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水為新制備的去離子水或蒸餾水。丙酮（CCC。碳酸鎂（MC3。丙酮溶液：9+1900mL丙酮（4.1）100mL實(shí)驗(yàn)用水。1.0g4.2100mL液（使用前充分搖勻。47mm0.45μm～0.7μm。儀器和設(shè)備采樣瓶：1L500mL具磨口塞的棕色玻璃瓶。過濾裝置：配真空泵和玻璃砂芯過濾裝置。研磨裝置：玻璃研缽或其他組織研磨器。1000g（3000/min～4000/mi。玻璃刻度離心管：15mL，旋蓋材質(zhì)不與丙酮反應(yīng)。10mm石英比色皿。針式濾器：0.45μm聚四氟乙烯有機(jī)相針式濾器。樣品樣品采集GB/T14581、HJ/T91HJ494中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行樣品的采集。樣品的采0.5m1L或500mL（如泥沙等2L30min5m（5.11mL（4.40.5m1/2處采集樣品，但不得樣品保存0℃～4h（24h內(nèi)不能送達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)過濾，濾膜避光冷凍運(yùn)輸，樣品濾膜于-20℃避光保存，14d內(nèi)分析完畢。注：樣品采集后，如條件允許，宜盡快分析完畢。試樣的制備過濾在過濾裝置（5.2）上裝好玻璃纖維濾膜（4.5。根據(jù)水體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)確定取樣50kPa，在樣品剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷子注：僅當(dāng)富營(yíng)養(yǎng)化水體的樣品無(wú)法通過玻璃纖維濾膜時(shí)，可采用離心法濃縮樣品，但轉(zhuǎn)移過程中應(yīng)保證提取效率，避免葉綠素a的損失及水分對(duì)丙酮溶液濃度的影響。B.1參考過濾樣品體積營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)富營(yíng)養(yǎng)中營(yíng)養(yǎng)貧營(yíng)養(yǎng)過濾體積（mL）100～200500～1000研磨（5.33m～4mL（4.33mL～4mL丙酮溶液（4.31～2次，保證充分5min以上。將完全破碎后的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管（5.5）中，用（4.3）10mL。注：葉綠素對(duì)光及酸性物質(zhì)敏感，實(shí)驗(yàn)室光線應(yīng)盡量微弱，能進(jìn)行分析操作即可，所有器皿不能用酸浸泡或洗滌。浸泡提取將離心管中的研磨提取液充分振蕩混勻后，用鋁箔包好，放置于4℃避光浸泡提取2h以上，不超過24h。在浸泡過程中要顛倒搖勻2～3次。離心（5.41000（3000/min～400010min過濾上清液得到葉綠素a（試樣空白試樣的制備用實(shí)驗(yàn)用水按照與試樣的制備（6.3）相同的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白試樣的制備。分析步驟試樣測(cè)定750nm664nm647nm、630nm處測(cè)量吸光度。750nm0.005，否則需重新（5.7）空白試驗(yàn)按照與試樣測(cè)定（7.1）相同的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白試樣（6.4）的測(cè)定。結(jié)果計(jì)算試樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度（m/L，按照公式（.1）進(jìn)行計(jì)算：1=11.851.540.08——試樣中葉綠素a——試樣在664nm——試樣在647nm——試樣在630nm——試樣在750nma的質(zhì)量濃度（μ/L，按照公式（.2）=1V1V

（B.1）（B.2）式中：——樣品中葉綠素a的質(zhì)量濃度，μg/L；1——試樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L；V1——試樣的定容體積，mL；V——取樣體積，L。附錄C熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)記錄參考格式儀器名稱證書編號(hào)單位名稱制造廠家規(guī)格型號(hào)出廠編號(hào)測(cè)量范圍校準(zhǔn)依據(jù)校準(zhǔn)日期校準(zhǔn)地點(diǎn)環(huán)境溫度相對(duì)濕度校準(zhǔn)人員核驗(yàn)人員線性誤差葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)濃度值（μg/L）羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)濃度值（μg/L）儀器測(cè)量值（μg/L）線性方程計(jì)算羅丹明B濃度值（μg/L）線性誤差（%）擴(kuò)展不確定度U（k=2）（%）123平均值//截距斜率重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)值（μg/L）測(cè)量值（μg/L）重復(fù)性（%）1234567平均值20穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)值（μg/L）20穩(wěn)定性（%）測(cè)量時(shí)間（min）0102030405060測(cè)量值（μg/L）示值誤差不同波長(zhǎng)下的吸光度值分光光度法測(cè)量值（μg/L）儀器測(cè)量值（μg/L）示值誤差（%）A6641A6472A6303A750平均值附錄D熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)證書內(nèi)頁(yè)參考格式測(cè)量范圍： （2：示值誤差：分光光度法測(cè)量值（μg/L）儀器測(cè)量值（μg/L）示值誤差（%）附錄E熒光法葉綠素a測(cè)定儀線性誤差測(cè)量不確定度評(píng)定示例概述a測(cè)定儀。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和校準(zhǔn)設(shè)備B有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。校準(zhǔn)設(shè)備：溫度計(jì)、吸量管、容量瓶。校準(zhǔn)方法：在儀器常用測(cè)量范圍（0.2～200）μg/L內(nèi)，按照均勻取點(diǎn)的原則0.2μg/L50μg/L100μg/L150μg/L200μg/L5a標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，B3Ba濃度示值平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到儀器的線性方程，按照方程計(jì)算出的羅丹明BB標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值進(jìn)行比較（不包含最低濃度值），得到線性誤差。校準(zhǔn)環(huán)境條件：環(huán)境溫度：5℃～40℃。電源電壓及頻率：AC(220±22)V，(50±0.5)Hz。測(cè)量模型

xixsi100%xsi式中：——iB濃度值，μg/L；xsi——第i點(diǎn)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L；xi——第i點(diǎn)的線性誤差，%。不確定度傳播率各不確定度分量彼此獨(dú)立且不相關(guān)，[u(xc2(x)u2(x)c2(x)u2(x)c i i i si si式中：

c

1xsi

，c

=-x2six2標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量評(píng)定B濃度值引入的不確定度分量u(xi)5B3次（n315次aE.1。表E.1羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性測(cè)量結(jié)果葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)濃度值（μg/L）羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)濃度值（μg/L）儀器測(cè)量值（μg/L）線性方程計(jì)算B（μg/L）線性誤差（%）123平均值0.230.220.210.170.20//5071552.0252.0351.9852.01717.09+0.291001430103.43103.49103.43103.451427.59-0.171502140155.65155.73155.63155.672148.860.412002860206.94206.90207.04206.962857.29-0.09截距0.0925斜率0.0724得到擬合直線的線性方程為：yabx=0.0925+0.0724x擬合直線的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為：NyabxisiNyabxisii1 N2羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)濃度值的平均值為：xsi1429.60μg/L以50μg/L的葉綠素a濃度點(diǎn)為例，線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值為：xi717.09μg/L，線性誤差為：xi=0.29%。1111 i sixx2n NxN si xsi2i177 1 1 9020.0724 3 15 15289659.6uxy/x

μg/L=3.0472μg/Li b由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度分量u(cs)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引入的不確定度分量urelB3k2u(c)=Urel3%1.5%rel s1 k 2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋過程引入的不確定度分量urel)2稀釋過程引入的不確定度來(lái)源主要考慮吸量管和單標(biāo)線容量瓶體積校準(zhǔn)的不確定度和溫度對(duì)體積的影響。a50μg/L的羅丹明B10mL1000mL50mL分度吸量管（36mL）500mL單標(biāo)線容量瓶。玻璃量器體積校準(zhǔn)引入的不確定度分量10mL單標(biāo)線吸量管的最大允許誤差為±0.020mL，1000mL單標(biāo)線容量瓶的最大允許誤差為±0.40mL，50mL分度吸量管（36mL）的最大允許誤差為500mL單標(biāo)線容量瓶的最大允許誤差為±0.25mL?？梢哉J(rèn)為均勻分布，則由吸量管0.4010000.401000

100%=0.12%0.020100.0201030.10360.103630.2550030.255003

100%=0.029%稀釋過程中溫度變化引入的不確定度分量在移液及定容過程中由于實(shí)驗(yàn)室溫度在（20±2）℃之間變動(dòng)，引入的不確定度2.1×10-4生的體積變化率為±（22.1×10，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為l.%。因此，葉綠素a濃度