醫(yī)學(xué)免疫透射比濁實(shí)驗(yàn)

醫(yī)學(xué)免疫透射比濁實(shí)驗(yàn)第二次試驗(yàn)logo【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解透射比濁法的基本原理。掌握半自動(dòng)或全自動(dòng)生化分析儀的使用。當(dāng)光線通過(guò)一個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí)，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測(cè)定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早于1959年Schultre和Schuick等報(bào)道應(yīng)用于血漿蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物，導(dǎo)致濁度的改變，再進(jìn)行透射比濁測(cè)定，一般采用抗體對(duì)抗原定量的透射比濁法，稱為免疫透射比濁法?？乖c特異性抗體在一定條件下才能形成復(fù)合物①對(duì)抗體的要求，作為體液或組織中蛋白質(zhì)種類很多，若要快速特異檢測(cè)，要求有單價(jià)特異抗體才能與抗原形成復(fù)合物。某一種蛋白質(zhì)，有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物進(jìn)行定量，若抗體不純混雜有另一種或兩種少量的抗體，這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜燴，結(jié)果偏高；②抗原抗體比例適當(dāng)，因免疫復(fù)合物形成有三個(gè)階段，第一階段是復(fù)合物形成抗原抗體復(fù)合物；第二階段是初步形成抗原抗體復(fù)合物，此階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)；第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀。只有在抗原與抗體等價(jià)時(shí)即無(wú)過(guò)?？贵w，此時(shí)，復(fù)合物的結(jié)合與解離處于平衡狀態(tài)，其混濁程度達(dá)高峰。在抗體過(guò)量時(shí)，隨抗原量的增加而復(fù)合物形成也增加，其測(cè)定只能在反應(yīng)曲線的左側(cè)進(jìn)行（見(jiàn)圖1）；③一般要求溶液中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成，如聚二乙醇6000等。溶液pH為6.5～8.0之間為宜。載脂蛋白有形成兩性螺旋片（amphipathichelix）的特性，對(duì)脂質(zhì)（特別是磷脂）有高度親和力，與脂質(zhì)結(jié)合后有時(shí)會(huì)掩蓋抗原位點(diǎn)或構(gòu)象改變，可以部分或完全喪失對(duì)抗血清的特異反應(yīng)。為此，載脂蛋白檢測(cè)過(guò)程中有必要先暴露抗原位點(diǎn)，所用試劑有表面活性劑，尿素，鹽酸胍和吐溫等解離蛋白劑，或用四甲基尿脫脂或有機(jī)溶劑脫脂等暴露抗原決定簇等方法，血清脂蛋白顆粒中的載脂蛋白，能在短時(shí)間內(nèi)形成抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行定量；④抗原不能過(guò)量，因?yàn)榭乖^(guò)量，抗原抗體復(fù)合物形成不但不增加，反而會(huì)減少，光散射或光吸收減少，檢測(cè)結(jié)果反而偏低。實(shí)驗(yàn)原理：

免疫比濁實(shí)驗(yàn)：在一定量的抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時(shí)間后形成可溶性免疫復(fù)合物，在PEG作用下可自液相析出，形成微粒，使檢樣濁度發(fā)生變化，用濁度計(jì)測(cè)量反應(yīng)液體的濁度，復(fù)合物形成越多濁度越高，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)濁度推算樣品的抗原含量?！緦?shí)驗(yàn)材料】羊抗人IgG、IgA、IgM抗血清及標(biāo)準(zhǔn)Ig參考血清抗原：待測(cè)人血清參考血清抗體：羊抗人IgG、IgA、IgM血清PEG-NaF稀釋液1ml刻度吸管、微量加液器、小試管、水浴箱、半或全自動(dòng)生化分析儀等管號(hào)測(cè)IgG抗體空白管1.PEG-NaF稀釋液（ml）1.01.02抗血清（ul）（效價(jià)1:100）12.5——3待測(cè)血清（ul）1.01.0混勻，37℃水浴30min，340mm波長(zhǎng)以抗體空白管調(diào)零，按終點(diǎn)法讀取各管光密度管號(hào)測(cè)IgM抗體空白管1.PEG-NaF稀釋液（ml）1.01.02.抗血清（ul）（效價(jià)1:100）12.5——3.待測(cè)血清（ul）10.010.04.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將標(biāo)準(zhǔn)Ig參考血清稀釋成5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)管，按上述操作步驟進(jìn)行，測(cè)定各管吸光度，以光密度對(duì)濃度進(jìn)行回歸處理，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由測(cè)定管A值再計(jì)算出待測(cè)血清中的免疫球蛋白的含量?！居?jì)算】血清補(bǔ)體lgG含量(g/L)=