薄層色譜板的制備和使用

西林街提供各種文檔、視頻資料、電子書和軟件下載PAGEPAGE1實(shí)驗(yàn)一薄層色譜板的制備和使用目的要求：通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步理解薄層色譜技術(shù)理論，熟悉掌握薄層色譜板的制備和使用方法。一、薄層層析的基本原理把吸附劑（固定相）均勻地鋪在一塊玻璃板上，將待分離的樣品溶液點(diǎn)加在一薄層板的一端，在密閉的容器中用適當(dāng)?shù)娜軇鲃酉啵┱归_，由于吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力大小不同及溶劑對不同物質(zhì)溶解分配系數(shù)不同，當(dāng)溶劑流過時(shí)，各物質(zhì)在吸附劑和溶劑之間發(fā)生連續(xù)不斷地吸附，解吸附，再吸附，再解吸附。不易被吸附或易被溶劑溶解的物質(zhì)相對移動得快一些。經(jīng)過一段時(shí)間的展開，不同的物質(zhì)被彼此分開，最后形成相互分離的斑點(diǎn)。將展開完畢的薄層板從密閉容器中取出后，應(yīng)用特定的試藥或方法將斑點(diǎn)顯色，從而達(dá)到定性和定量的目的。二、薄層板的制備1．玻璃板用一塊玻璃板涂上很薄的吸附劑，如硅膠或氧化鋁等，玻璃板要求薄厚一致，大小相同，表面光滑平整，一般玻璃只要合乎這些要求就可。如果找不到平整均一的，將舊光學(xué)照像底片截成同樣大小也可以。用前先將玻璃用肥皂和水洗干凈，必要時(shí)浸泡在清洗液中，然后水洗烤干，用紗布擦光。玻璃板大小有各種規(guī)格，一般有20×20、20×10、20×5厘米，也有更小的，可根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)。寬度要求至少能點(diǎn)開兩三個樣品，每兩點(diǎn)之間相隔至少1.5厘米，玻板長度一般要滿足展開10厘米的距離。點(diǎn)樣的起點(diǎn)應(yīng)距底邊至少1.5厘米的距離。2．吸附劑應(yīng)用最廣泛的為硅膠和氧化鋁，市場上有專供薄層色譜用的吸附劑，規(guī)格分不含粘合劑的硅膠H，氧化鋁H和含有粘合劑熟石膏的硅膠G，氧化鋁G，如市售硅膠G含13％熟石膏，氧化鋁分中性、酸性、堿性三種。吸附劑的粒度范圍最好在180－200目之間，太小了流速慢，太大則影響分離效果。如不合要求，應(yīng)過篩。3．薄層板的涂布最簡單的涂布方法是用兩條比玻璃板厚0．25毫米的玻璃條或有機(jī)玻璃條（或在同樣厚度的玻璃條下粘一層膠布），將玻璃板夾住，把調(diào)好的吸附劑漿液平鋪在薄層板上，然后用一有機(jī)玻璃條或直尺，迅速均勻地向前推進(jìn)，就象推血片一樣，只要推進(jìn)的速度均勻一致，即可得到薄厚均勻的薄層板，如在一塊玻璃板末端再接一塊相同的玻璃板，把剩余的裝液接過去，可使涂層邊緣整齊，厚度一致，吸附劑漿液的加水量和攪拌時(shí)間是涂布成敗的關(guān)鍵，像12×8平方厘米的玻璃板需要2~3克硅膠G，加4~6毫升水即可，只要技術(shù)熟練即能涂成厚薄一致，光滑平整的一塊薄層板。不同性質(zhì)不同批號的吸附劑，加水量和攪拌時(shí)間有時(shí)可有差異，應(yīng)根據(jù)情況摸出規(guī)律。為了達(dá)到涂布的各板厚度均勻一致，最好采用涂布器進(jìn)行薄層的涂布。為了增加薄層的牢固性及易于保存，可在涂布過程中加入某些粘合劑以增加薄層的硬度。一般采用添加劑羧甲基纖維素鈉（CMC—Na），應(yīng)用方法是取CMC-Na1克溶于100毫升水中，加熱煮沸溶解，按比例與硅膠攪勻，鋪板。涂成之后先把玻板放在平面上，室內(nèi)干固，再對光檢查，看是不是均勻，有無氣泡，平整光潔度如何，合格的上烤箱110℃在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)盡量可能采用同批號涂布活化的薄層板，以減少因活化不一致引起的Rf值發(fā)生差異，目前國內(nèi)市場已有成品供應(yīng)，如黃巖化學(xué)分析材料廠即有各種類型的薄層板出售。三、薄層板的使用1．點(diǎn)樣將樣品溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲校☉?yīng)盡量避免有水），取微量注射器或玻璃毛細(xì)管截齊后，吸取一定量的檢樣，輕輕接觸到薄層上，使樣品自動吸到薄層上，點(diǎn)的直徑不要超過0.3厘米，一次不能點(diǎn)完，待干后再點(diǎn)，稍有過分就會損傷板面，影響展開后的斑點(diǎn)形狀。每兩個樣點(diǎn)之間相距至少1.5厘米。點(diǎn)樣的起點(diǎn)距薄板底邊至少1.5厘米，以免樣點(diǎn)浸入展開溶劑中，同塊薄板上各樣點(diǎn)應(yīng)保持在與底邊平行的一條直線上，為控制好點(diǎn)樣距離，應(yīng)用薄層點(diǎn)樣尺架。2．展開根據(jù)薄層板大小，自行選用適當(dāng)玻璃標(biāo)本缸，長方形，如17×10×6厘米的標(biāo)本缸可容納下15×9厘米的玻璃板。采用較大的玻璃缸和玻璃板時(shí)，在缸內(nèi)沿周圍缸壁襯一層預(yù)先浸有溶劑的濾紙，以便缸內(nèi)展開溶劑易達(dá)到飽和，防止邊緣效應(yīng)（即兩邊緣的點(diǎn)走得快）和同一物質(zhì)Rf值不一致現(xiàn)象。一般將薄層板斜置展開容器內(nèi)，密閉。先不使溶劑浸濕薄層板，飽和10~15分鐘后再進(jìn)行展開，展開溶劑沿著薄層板向上移動。對加粘合劑的涂板可以近于垂直的狀態(tài)進(jìn)行展開，而對未加粘合劑的薄層板則必須以傾斜狀態(tài)（15度角）進(jìn)行展開。為了防止產(chǎn)生“邊緣效應(yīng)”和展開溶劑不飽和現(xiàn)象。還可采用夾心式展開容器，其方法是將薄層板的左右兩側(cè)各刮去5~10毫米，墊上條狀玻璃或塑料，蓋一塊與薄層板同樣大小的玻璃，用夾子將兩邊夾好，插入展開溶劑中進(jìn)行展開，并能取得良好效果。3．顯色薄層展開后，涼干。如含粘合劑，即可直接噴顯色劑，使之顯色，有的還需經(jīng)紫外線（254nm）照射后方能顯色；對不含粘合劑的薄板，在噴顯色劑時(shí)應(yīng)盡量遠(yuǎn)離薄層板，否則會連吸附劑一起吹掉，應(yīng)予以注意。四、檢樣的定性定量分析1．比移值（Rf）的測定當(dāng)樣品的薄板一端被展開，經(jīng)過毛細(xì)管作用流向另一端，樣品是按一定的比例分配在固定相與流動相之間。并沿著溶劑流動的方向移動，由于樣品中各組分在兩相中分配系數(shù)不同，各組分的移動速度也不同，經(jīng)一定距離后使各組分彼此分離。樣品各組分移動的速率，亦即分離后在薄層板上的位置與溶劑展開前沿的距離的比值為比移植。2．定性分析相同的物質(zhì)Rf值應(yīng)當(dāng)是相同的，但因能影響Rf值的因素很多，要想得到與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相同的Rf值，最好在鑒定時(shí)，將樣品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)點(diǎn)在同一張薄層板上一同展開，根據(jù)檢樣斑點(diǎn)的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)樣品的Rf值比較，即可確定二者是否相同，但要做到準(zhǔn)確的定性，需要兩種以上展開溶劑系統(tǒng)所得的Rf值比較判斷。3．定量分析（1）目測比較法①用吸附劑（如硅膠G）涂布成厚0.25~0.5毫米，大小20×20厘米的薄層板，110℃②用微量注射器（10微升）在距板底1.5厘米處，將標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液按1、3、5、7微克自左向右點(diǎn)在起始線上，然后再吸取不同量的檢材提取溶液（相同于1、3、5克檢材的提取溶液）按次序點(diǎn)在同一板的右側(cè)。③選擇比移值適中的展開劑（Rf在0.45~0.75之間者）用夾心式展開法或連續(xù)薄層展開法。展開距離為10厘米，顯色劑要求能使顯色后的斑點(diǎn)明顯清晰。這樣得到的色斑比較集中，重現(xiàn)性好，便于比較。④顯色后，觀察其色斑大小，深淺與已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品系列色斑相比較，粗略定出含量，然后算出檢液總體中含量，根據(jù)所取檢材量，求出百分含量。（2）洗脫測定法①在制備好的薄層板左端，先點(diǎn)一標(biāo)準(zhǔn)樣品點(diǎn)，作為對照定位用，然后根據(jù)檢材提取溶液的多少，在同一板的右端點(diǎn)成點(diǎn)狀或線狀。②置玻璃缸中展開（如有連續(xù)薄層展開儀更好），展開后晾干，再用玻璃板遮住右側(cè)檢材部分，僅使對照定位點(diǎn)顯色。③顯色后，根據(jù)斑點(diǎn)位置將未顯色部分（相當(dāng)于色斑所在部分）的吸附劑用刮刀刮下或用抽吸法收集起來。④將收集的吸附劑置于小層析柱管中，用極性大的溶劑甲醇或乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并加以濃縮。⑤用適當(dāng)溶劑調(diào)整到一定體積，可用紫外分光光度計(jì)，在被檢物最大吸收波長處進(jìn)行測定。同時(shí)用薄層吸附劑洗脫液作空白吸收值測定。如有靈敏度高專屬性好的比色反應(yīng)，還可用比色計(jì)測定化合物的含量。上述洗脫液亦可作為氣相色譜儀、液相色譜儀分析前的處理液。（3）薄層色譜掃描儀測量法以洗脫法處理層析色斑，不僅操作麻煩，而且有些待測成分不能定量地洗脫下來?；蛘咴谙疵撨^程中發(fā)生分解，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好是采用雙波長薄層色譜掃描儀直接定量檢測，經(jīng)電子積分器積分推算出檢樣中待測物質(zhì)的含量。其測定方法包括為：①斑點(diǎn)面積測量法；②斑點(diǎn)光密度測量法；③斑點(diǎn)熒光測量法。附：實(shí)驗(yàn)儀器1．薄層涂布器2．微量注射器3．薄層點(diǎn)樣尺架4．薄層板展開缸5．吸引器6．噴瓶7．烘烤箱實(shí)驗(yàn)二氫氰酸及氰化物的檢測目的要求：了解氰化物中毒的條件和毒性反應(yīng)，掌握氰化物的化學(xué)性質(zhì)，檢材的采取及處理方法和常見的鑒定方法。一、檢材采取和毒物的分離1．檢材采取：最好的檢材為中毒者剩余的食物、飲料、嘔吐物及尸體胃和胃內(nèi)容物，其次為血液，肺、肝、腦等。吸入中毒的應(yīng)采取血液為宜。檢材應(yīng)盛于密閉容器內(nèi)，并盡量少留空間，盡快進(jìn)行檢驗(yàn)，不能及時(shí)檢驗(yàn)者應(yīng)將檢材低溫冰凍保存。2．毒物分離：含氰化物中毒檢材的分離采用水蒸氣蒸餾法（1）分離原理：氰化物遇酸可形成易揮發(fā)的氫氰酸，氫氰酸具有較高的蒸氣壓，檢材在酸性條件下當(dāng)和水同時(shí)加熱或通入熱水蒸氣時(shí)，能隨水蒸汽在較低的溫度沸騰蒸餾出來，在堿性環(huán)境下被冷卻收集，達(dá)到分離的目的。（2）操作方法：取適當(dāng)量檢材（10～50克），剪碎或搗碎，放入250毫升圓底燒瓶中，加水2倍，再加10％的酒石酸酸化（PH5）。取1000毫升燒瓶作為水蒸氣發(fā)生瓶，倒入熱水，投入數(shù)小塊沸石，上插安全管（長度60厘米的玻璃管）。按圖所示：用連接管將兩瓶相連，將檢材瓶浸入水浴鍋中接上冷凝管，收集液瓶中加入5毫升0.01N氫氧化鈉溶液使接收管直接通到受液瓶中稀堿液液面下，以防餾出氰化物逸失，檢查所有瓶塞及各接頭處緊密不漏氣后，將水蒸氣發(fā)生瓶和水浴鍋同時(shí)加熱，收集餾液10分鐘備檢?！沧⒁馐马?xiàng)〕（1）檢材處理的愈碎愈好，檢材溶液必須呈酸性。（2）蒸餾裝置的各接頭處必須嚴(yán)密不漏氣。（3）蒸餾完畢后，應(yīng)先將受液瓶取下，再將水蒸氣發(fā)生瓶的瓶塞放松，或?qū)⑺魵獍l(fā)生瓶與檢材瓶之間的連接處拆開，然后再停止加熱以防各瓶之間相互倒流。（4）對血液、面糊、稀粥等檢材，可加入2～3毫升液體石蠟或適量的三氯醋酸溶液，以避免蒸餾時(shí)發(fā)生大量的泡沫溢入冷凝管。（5）蒸餾瓶中的內(nèi)容物，不能超過瓶容積的1/3。二、氫氰酸及氰化物的鑒定方法（一）普魯士藍(lán)反應(yīng)：1．原理：蒸餾出來的氫氰酸吸收在稀堿溶液中生成氰化鉀，加硫酸亞鐵后生成亞鐵氰化鉀（黃血鹽），后者與溶液內(nèi)亞鐵氧化成高鐵，在酸性條件下，化合為亞鐵氰化鐵，即普魯士蘭或柏林藍(lán)。該反應(yīng)是氰化物的專屬反應(yīng)，陽性結(jié)果可確證氰化物的存在，反應(yīng)靈敏度為1：5000。2．操作方法：取蒸餾液3～5毫升，加新配的20％硫酸亞鐵2滴，加熱至恰沸，加稀硫酸使成酸性，如有氰根視含量多少，溶液有藍(lán)綠色至深藍(lán)色。量多即析出藍(lán)色沉淀，量少時(shí)顏色和沉淀可能要隔24－48小時(shí)后才顯出。（二）氰化物的快速檢驗(yàn)法檢材不經(jīng)水蒸氣蒸餾，可直接做普魯士蘭試驗(yàn)。1．原理：氫氰酸與硫酸亞鐵－氫氧化鈉試紙作用生成亞鐵氰化物，在酸性條件下，再與由空氣氧化產(chǎn)生的三價(jià)鐵離子作用生成普魯士蘭。6HCN+Fe2++6OH-=Fe（CN）64-+6H2O4Fe3++3Fe（CN）4-6＝Fe4[Fe（CN）6]3（普魯士蘭）2．操作方法：取檢材5～10克，置錐形瓶中，加適量水調(diào)成稀糊狀，加10％的硫酸使之變成酸性，取濾紙一小方，滴加新配制的20％硫酸亞鐵2滴及10％氫氧化鈉2滴，將此濾紙覆蓋于錐形瓶口，瓶底緩緩加熱，待有蒸氣上冒，取下濾紙，浸入6N鹽酸內(nèi)，如有氰根，濾紙即藍(lán)色斑點(diǎn)，水洗，色斑更鮮艷。實(shí)驗(yàn)三血中一氧化碳的檢測目的要求：熟悉一氧化碳中毒的特征和檢材的采取要點(diǎn)，掌握碳氧血紅蛋白分析鑒定方法及飽和碳氧血紅蛋白的制備技術(shù)。一、檢材的采取一氧化碳中毒檢材以取血液為最好，對于尸體通常是采取心腔內(nèi)血液進(jìn)行檢測?；铙w通常靜脈采血并要加抗凝劑，密封。盛裝檢血的容器應(yīng)將檢血裝滿不要留有空間，以避免一氧化碳損失而影響檢驗(yàn)結(jié)果。二、碳氧血紅蛋白的鑒別試驗(yàn)1．煮沸法取血2－3毫升，置試管內(nèi)，放水浴鍋中加熱，使發(fā)生凝固。如系一氧化碳血，呈磚紅色凝固體，而正常血則呈褐色或黑褐色凝塊。此法最簡便，不需任何試劑，在勘驗(yàn)現(xiàn)場即可進(jìn)行，但含量在40％才可測出。2．硫化銨法取水10毫升，加血5滴，加硫化銨5滴，較混合之，再加少量10％醋酸使微呈酸性，如系一氧化碳血，呈玫瑰色；而正常血為綠褐色。此法靈敏，含量在10％即可檢出。3．堿液稀釋法取血1－2滴，加水稀釋至15毫升，再加5滴10％氫氧化鈉，同時(shí)取一正常血樣作對照，與堿液混合后立即記下時(shí)間，正常血由于堿性正鐵血紅素的形成，立即變?yōu)椴菥G色或綠褐色而含10％以上一氧化碳血液需要15秒鐘后才變?yōu)椴菥G色或綠褐色；含50％者需要50秒鐘后。4．鈀鏡試驗(yàn)（1）原理：碳氧血紅蛋白與硫酸作用釋放出一氧化碳，一氧化碳可使氯化鈀還原成鈀鏡。(2)操作方法：取擴(kuò)散皿(孔威氏盒)一個，內(nèi)槽內(nèi)放入0.5毫升0.1％氯化鈀溶液，外槽內(nèi)一側(cè)放入0.5毫升檢血，另一側(cè)放入0.5毫升10％硫酸溶液（封蓋前不要讓它們接觸)，然后蓋上盒蓋，輕輕搖晃使血液與硫酸充分接觸。20分鐘至2小時(shí)內(nèi)觀察試驗(yàn)結(jié)果，如有一氧化碳釋出，可見內(nèi)圈形成發(fā)亮的鈀鏡。以上各鑒別試驗(yàn)，一定要取正常血同時(shí)做對照試驗(yàn)，以作對比。三、碳氧血紅蛋白的定量檢驗(yàn)1．實(shí)驗(yàn)室中飽和碳氧血紅蛋白的制備：實(shí)驗(yàn)裝置圖見下：1.硫酸2.甲酸3.血液4.20％NaOH一氧化碳發(fā)生裝置先將濃硫酸加熱，而后扭開分液漏斗活塞，讓甲酸（H－COOH）一滴一滴與濃硫酸接觸，即有一氧化碳?xì)怏w冒出，經(jīng)過洗氣瓶，通入盛有正常血的瓶中，10毫升血（用0.05克枸椽酸鈉作抗凝劑）通一氧化碳約15分鐘，即可使血紅蛋白的一氧化碳飽和度達(dá)l00％，避免通氣過猛，以免血液內(nèi)產(chǎn)生大量泡沫外溢。因每人Hb含量不同，最好取死者血通以一氧化碳使達(dá)飽和，可省去換算。2．吸收光譜法測定血中HbCO飽和度在各類測定方法中，研究和應(yīng)用最多的是利用可見光吸收光譜的分光光度法來測定血中HbCO飽和度。（1）原理：雙波長吸光度比值法：CO中毒的檢血中同時(shí)含有HbO2、HbCO、MetHb和Hb的血，用連二亞硫酸鈉使之還原后，血樣中只含有HbCO和Hb兩個組分，其吸收光譜是HbCO和Hb兩者吸收光譜的加和。因555nm是Hb的最大吸收波長，538nm是HbCO的最大吸收波長之一，所以，隨著血中HbCO飽和度的增高，555nm處的吸光度減小，而538nm處的吸光度增大，538nm處的吸光度與555nm處的吸光度之比值A(chǔ)538／A555也隨著HbCO飽和度增高而增大，且其間也有近似直線的關(guān)系。故可用下式計(jì)算血中HbCO飽和度。用下式表示。(A(A538/A555)X－(A538/A555)0(A538/A555)100－(A538/A555)0HbCO(％)＝×100％上式中括號外的下角標(biāo)，X表示未知HbCO飽和度的血樣，0與100分別表示HbCO飽和度為0％和100％的血樣。（2）操作方法：先將非吸煙者的血樣用0.1％碳酸鈉溶液稀釋約200倍，加入少許連二亞硫酸鈉（約0.1％）后，放置15min。使HbO2還原，在538nm和555nm處測定吸光度，計(jì)算得HbCO飽和度為0％的比值。再將此溶液通入一氧化碳?xì)怏w使Hb全部轉(zhuǎn)變?yōu)镠bCO，在相同兩波長處測定吸光度，并計(jì)算出HbCO飽和度為100％的比值。檢血也按上述方法稀釋并加入還原劑，同樣波長處測定吸光度，得出比值。將所得三個比值代入上式即可求出未知血樣的HbCO飽和度。此方法對HbCO飽和度較高的檢血有較好的重現(xiàn)性，但不適合測定HbCO飽和度低的檢血。方法對檢血的稀釋不要求很精確；HbCO飽和度為0％和100％的比值一次測定后，只要條件不改變，不必每次都測。通常(A538／A555)0的值為0.775，(A538／A555)100的值為1.233。實(shí)驗(yàn)四酒精的檢測目的要求：熟悉對含酒精檢材的采取保存方法，掌握酒精的常用鑒別試驗(yàn)。了解氣相色譜理論和設(shè)備；初步熟悉應(yīng)用氣相色譜進(jìn)行定性、定量分析的方法。一、檢材的采取保存和分離1．乙醇中毒可取血、尿、唾液、胃內(nèi)容物及呼出氣為檢材，其中血液為首選檢材，此外還可采腦、肺、肝、腎等臟器為檢材。采取血液以周圍靜脈血（股靜脈）為宜。2．含酒精的檢材應(yīng)及時(shí)檢測，如不能及時(shí)檢測，應(yīng)放置冰箱內(nèi)保存。盛裝檢材的容器在保存檢材時(shí)應(yīng)裝滿不要留有空間，并進(jìn)行密封以避免酒精揮發(fā)損失。3．對所有生物檢材中含有的酒精可采用蒸餾法進(jìn)行分離，對血、尿等液體性質(zhì)檢材亦可直接取樣進(jìn)行微量擴(kuò)散和氣相色譜分析，胃內(nèi)容物可將其離心后取上清液直接做分析測定。二、酒精的顏色反應(yīng)1．碘仿反應(yīng)（1）原理：碘與堿作用生成次碘酸鹽，能將乙醇氧化成乙醛，乙醛與碘作用生成三碘乙醛，再與堿作用，生成黃色碘仿。（2）操作方法：取溜液2—5毫升，放入試管內(nèi)，加10％氫氧化鈉溶液數(shù)滴混合。滴加碘化碘鉀試劑至溶液呈淺黃色。在60℃【注】本反應(yīng)并非乙醇所特有，乙醛、丙酮、甲基酮及能被次碘酸鹽氧化為乙醛，或甲基酮的醇均能產(chǎn)生同樣反應(yīng)。2．微量擴(kuò)散法――預(yù)試驗(yàn)（1）原理：重鉻酸鉀與乙醇或其他還原性物質(zhì)（醛類和其它低級分子）作用時(shí)，被還原成Cr3＋，顏色由橙黃色轉(zhuǎn)為蘭綠色。（2）操作方法：在擴(kuò)散皿的內(nèi)槽中放置重鉻酸鉀－硫酸試劑1毫升，外槽一側(cè)加飽和碳酸鈉1毫升，另一側(cè)加入檢血1毫升，蓋上盒蓋后，傾斜旋轉(zhuǎn)使檢血和碳酸鈉溶液接觸混合，放置一小時(shí)，觀察結(jié)果，如檢材內(nèi)含有乙醇，以其含量大小呈現(xiàn)黃綠至藍(lán)色變化，見下表1血中乙醇不同含量的顏色變化；表2血液中乙醇濃度與酩酊度。表1血中乙醇不同含量的顏色變化含乙醇克數(shù)％重鉻酸鉀硫酸識別顏色結(jié)果0.00鮮黃色00.08黃－黃綠＋0.15黃綠－綠＋＋0.23綠－深綠＋＋＋0.30深綠－藍(lán)色＋＋＋表2血液中乙醇濃度與酩酊度血中乙醇含量％0－0.050.05－0.150.15－0.300.25－0.400.35－0.500.50酩酊度初出現(xiàn)異常狀態(tài)行動尚較正常，但已欣快多話正常行動較難，思考力減退行動已困難但意識仍較清楚昏睡致死三、氣相色譜分析【色譜條件】色譜柱：4mm×2m不銹鋼柱，內(nèi)裝10％PEG20M，ChromosorbW(60～80目)4mm×2m不銹鋼柱，內(nèi)裝GDX－201W(60～80目)FID檢測器和氣化室溫度：150℃；柱溫：lOO℃。載氣(N2)流速：45ml／min；H2【操作】在10ml左右的玻璃瓶(頂空瓶)中加入0.5ml檢材(血或尿)，0.5ml內(nèi)標(biāo)液，約1g硫酸銨，加蓋聚四氟乙烯薄膜和膠塞，用鋁蓋封好，搖勻，置于60℃水浴中加熱15～20分鐘，用事先預(yù)熱好的注射器抽取200μ再取0．5m1正常血(或尿)加入頂空瓶中，加入0．5ml標(biāo)準(zhǔn)液(含乙醇和正丙醇各為0．5mg／m1)和約1g的硫酸銨，加蓋聚四氟乙烯薄膜和膠塞，加鋁蓋密封，其余操作和檢材相同，求出乙醇和正丙醇的峰面積比(K)，重復(fù)操作三次取平均值，檢材中乙醇的含量按下式計(jì)算：檢材中乙醇的含量(mg／m1)＝A乙醇/A正丙醇×1/K×C乙醇其中A乙醇：檢材中乙醇所產(chǎn)生的色譜峰面積。A正丙醇：檢材中正丙醇內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生的色譜面積。附：試劑1．碘化碘鉀試劑：2克碘化鉀與1克碘溶于50毫升水中。2．重鉻酸鉀一硫酸試劑：重鉻酸鉀0.37克，溶于15毫升水中，然后緩慢加入2毫升濃硫酸，邊滴加，邊攪動，放冷后備用。實(shí)驗(yàn)五合成藥物的檢測巴比妥類藥物的檢測目的要求：熟悉巴比妥類藥物的理化性質(zhì)，掌握由檢材中提取的分離原理和常規(guī)的分析方法，通過實(shí)驗(yàn)熟悉薄層色譜在毒物分析工作中的使用技術(shù)。一、檢材的采取巴比妥類藥物中毒以胃內(nèi)容物、腸內(nèi)容物、胃液以及血、尿或肝、腦等臟器為檢材。二、檢材的分離提取1．原理：巴比妥類安眠藥屬于弱酸性有機(jī)化合物，在酸性條件下形成巴比妥類衍生物能溶于大部分有機(jī)溶劑。在堿性條件下形成巴比妥鹽類物質(zhì)溶于水而不溶于有機(jī)溶劑。根據(jù)這一化學(xué)性質(zhì)，在對檢材的分離提取過程中，應(yīng)首先酸化檢材使形成鹽的巴比妥類藥物轉(zhuǎn)化成巴比妥酸類衍生物，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。2．分離提取取尿液50毫升，加10％硫酸酸化至PH5－6后，置分液漏斗內(nèi)，用氯仿溶劑50毫升，30毫升，20毫升分別提取三次，合并提液，用10克3．尸體內(nèi)臟的快速提取法：取尸體臟器及干性胃內(nèi)容物50--100克三、顏色反應(yīng)1．硝酸鈷－氨液反應(yīng)：原理：巴比妥類安眠藥的分子結(jié)構(gòu)中有環(huán)脲酰－C＝NH基團(tuán)，在堿性條件下，可與鈷鹽發(fā)生顯色反應(yīng)，生產(chǎn)紫紅色絡(luò)合物。操作方法：將檢材提得的殘?jiān)尤肷倭恳颐讶芙夂蟮渭釉跒V紙上，再加1％硝酸鈷無水酒精液數(shù)滴，置于濃氨水瓶口熏以氨氣，如呈現(xiàn)紫紅色表示有巴比妥酸的存在。若濾紙于1－2分鐘內(nèi)呈黃色，邊緣有時(shí)呈青綠色，則為陰性。本反應(yīng)必須在無水條件下進(jìn)行，所用一切容器要干燥，應(yīng)同時(shí)作陰性及陽性對照。2．硫酸銅一吡啶反應(yīng)OO(1)原理：巴比妥分子中含有一C—NH—C—NH基團(tuán)，可與銅鹽作用，發(fā)生類似縮二脲的反應(yīng)，生成有色絡(luò)合物，含氧巴比妥呈紅色，含硫巴比妥呈綠色。(2)操作方法：將檢材提取殘?jiān)尤肷倭窟拎ぢ确乱喝芙猓偌恿蛩徙~吡啶液2滴，如含巴比妥類安眠藥即顯紅紫色，硫噴妥呈顯綠色。注意：此反應(yīng)也可于濾紙上進(jìn)行，顯色劑硫酸銅吡啶勿用過量，否則試劑本身顏色會掩蓋反應(yīng)結(jié)果。靈敏度100一200微克。，四、薄層色譜法1．薄層板硅膠G板或硅膠CMC板2．展開(1)苯：丙酮(8：2)展開劑(2)苯：二氧六環(huán)：二乙胺(7：2：1)展開劑(3)氯仿：丙酮(9：1)展開劑3．顯色(1)硫酸汞－二苯卡巴腙試劑(2)硝酸銀－二苯卡巴腙顯色劑操作方法：當(dāng)層析后取出薄層板晾干，噴硫酸汞液或硝酸銀丙酮液，此時(shí)巴比妥類藥物顯白色斑點(diǎn)。再噴以0.2％二苯卡巴腙氯仿液薄層背景即呈藍(lán)紫色并慢慢褪去，雜質(zhì)是不規(guī)則的藍(lán)色斑點(diǎn)，而巴比妥類藥物則呈現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。4．測量計(jì)算判斷結(jié)果五、紫外分光光度法的定量檢測(一)原理：一定濃度范圍內(nèi)(每毫升含藥物2—30微克)的巴比妥類藥物在PHl4和PHl0溶液中于紫外波長260nm處相互吸收差值成正比。根據(jù)檢液在260nm處的吸收差值，同已知藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，得知檢液濃度，從而計(jì)算出藥物含量。(二)操作方法1．標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及紫外吸收測定取每毫升含1毫克速可眠等巴比妥類藥物的甲醇液1.5毫升于50毫升燒杯中，置60℃另取十二個10毫升的試管，分成兩組，依次分別加入上面配制的每毫升標(biāo)準(zhǔn)藥物10、20、30、40、50、60微克的PHl4堿液各2.0毫升。再于第一組試管中各加0.45N氫氧化鈉液2.0毫升，即配成每毫升含速可眠等巴比妥類藥物5、10、15、20、25、30微克的PHl4堿液；再于第二組試管中各加入0.6N硼酸－氯化鉀緩沖液2.0毫升，即配成每毫升含速可眠等巴比妥藥物5、10、15、20、25、30微克的PHl0堿液。取已配好的速可眠等巴妥類一系列不同濃度的PHl4和PHI0堿液，以相同PH值的堿液為參比，在紫外分光光度計(jì)上于190—270nm間測吸收圖譜，算出260nm處的吸收差值。(2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以PHl4和PHI0堿液于260nm處的吸收差值或PHl4和PH2于305nm處的吸收差值△E為縱坐標(biāo)，濃度(微克／毫升)為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出直線，即得巴比妥類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。巴比妥、戊巴比妥和速可眠的濃度在0--30微克／毫升之間成線性關(guān)系。(3)檢材中藥物含量的測定取0.45N氫氧化鈉反提液，按下法分別配成PHl4和PHl0的溶液；取2毫升反提液，加2毫升0.45N氫氧化鈉溶液，混勻后即為PHl4檢液。取2毫升反提液，加2毫升0.6N的硼酸－氯化鉀緩沖液，混勻后即為PHI0檢液。PHl4檢液，以0.45N氫氧化鈉作參比。PHl0檢液，以0.45N氫氧化鈉和0.6硼酸－氯化鉀緩沖液的混合液為參比。分別在紫外分光光度計(jì)上從190到270nm間吸收，算出在260nm處的吸收差值。再從該藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得所含藥物的濃度，計(jì)算出檢材中藥物的含量。VVc×CmM檢材含藥量W＝W＝檢材中的含藥量（微克/克·毫升）Vc檢材用0.45N氫氧化鈉反提毫升數(shù)Cm=從標(biāo)準(zhǔn)曲線上檢得的檢液濃度（微克/毫升）M＝所取檢材克數(shù)六、氣相色譜法1．應(yīng)用填充柱技術(shù)，衍生化法2．操作條件檢測器：FID色譜柱：6英尺（或2米）2～4mmID玻璃柱固定液：3％SE－30，80－100mm載氣：N2，45～50ml/min柱溫：190－200進(jìn)樣/檢測器溫度：220內(nèi)標(biāo)物：正烷烴衍生化試劑：0.2M三甲基羥苯胺甲醇溶液[方法]內(nèi)標(biāo)溶液的配制：用乙酸乙酯溶解一定量的正烷烴，配成1mg/ml的巴比妥酸類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液。[標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制]準(zhǔn)確稱取一定量的巴比妥類藥物（游離酸），用內(nèi)標(biāo)溶液來配制成1mg/ml的巴比妥酸類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液。[樣品溶液的配制]稱取一定量備用內(nèi)標(biāo)溶液來配制。內(nèi)標(biāo)和樣品中巴比妥酸類藥物的濃度都應(yīng)大致在1mg/ml的范圍內(nèi)。取1μl的標(biāo)準(zhǔn)溶液和1μl的衍生化試劑一并注入色譜柱中，利用在線的衍生化技術(shù)進(jìn)行柱頭衍生化，然后一起注入樣品溶液和生化試劑，計(jì)算樣品中巴比妥酸鹽的濃度可利用下列式：Cr.std.CsamAx/Aint.std.in.sam.chrom.Cr.std.CsamAx/Aint.std.in.sam.chrom.Ar.std./Aint.std.in.chromCX%=××100其中：Cx％：樣品中組分x的濃度(W／W％)Cr.std：標(biāo)準(zhǔn)溶液中組分x的濃度(W／V％)Csam：樣品濃度(W／V％)Ax：在樣品峰中組分x的峰面積Arstd：標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰組分x的峰面積Aint．std．insam．chrom：樣品峰中內(nèi)標(biāo)物的峰面積附：試劑配制1．配制磷酸鈉溶液：5克磷酸二氫鈉溶于100毫升水中。2．1％硝酸鈷乙醇液：l克無水硝酸鈷溶于100毫升無水乙醇中。3．吡啶氯仿液：1毫升吡啶加入9毫升氯仿混勻。4．硫酸銅吡啶法：1份1％硫酸銅溶液和等量吡啶氯仿液混和。5．硫酸汞試劑：5克氧化汞溶于20毫升濃硫酸中；然后將此緩慢加到水中，稀釋至100毫升。6．硝酸銀丙酮液：l克硝酸銀，用加有l(wèi)％水的丙酮溶解，取其上清液使用，避光保存。7．0.2％二苯卡巴腙試劑：0.2克二苯卡巴腙溶于100毫升氯仿。8．0.45N氫氧化鈉液：溶解18g氫氧化鈉于水，并稀釋達(dá)l升，貯在聚乙烯瓶中。9．硼酸－氯化鉀緩沖液：硼酸18.55克，氯化鉀22.36克，加水溶解(需加熱)至500毫升，過濾后使用。10．PHl0緩沖液：等量的硼酸－氯化鉀緩沖液和0.45N氫氧化鈉液混合，即得。臨用時(shí)配制。吩噻嗪類藥物的檢測目的要求：熟悉吩噻嗪類藥理化性質(zhì)，掌握分離提取原理和常規(guī)定性定量分析方法。一、檢材的采取應(yīng)以剩余藥物、胃內(nèi)容物或洗胃液及尿、血等作檢材較好，因吩噻嗪類藥物易分解，應(yīng)避光保存。二、檢材的分離提取1．分離原理：吩噻嗪類藥物屬堿性有機(jī)化合物，在堿性條件下可溶于有機(jī)溶劑中，而在酸性條件下形成鹽類易溶于水。在毒物分析工作中，對含有吩噻嗪類藥物的檢材應(yīng)在堿性條件下用有機(jī)溶劑提取，由于吩噻嗪類藥物進(jìn)入體內(nèi)，部分與蛋白質(zhì)或葡萄糖醛酸結(jié)合，以結(jié)合形式存在，一般的堿化檢材，難以完全被有機(jī)溶劑分離提取，各有機(jī)溶劑對吩噻嗪類藥物的溶解度各不相同，特別是氯丙嗪不易被氯仿提取，而多采用乙醚或庚烷作溶劑提取。2．快速提取法取尿或胃內(nèi)容物50毫升，加10％氫氧化鈉堿化至PH11－12，取乙醚50、30、20毫升分別提取三次，合并提取液，用無水硫酸鈉脫水，活性碳脫色后置水浴上揮干，剩殘?jiān)z測用。3．鹽酸水解法血、肝、腦、腎等內(nèi)臟組織，取20－40克剪碎加入等量濃鹽酸，置沸水浴中加熱1小時(shí)，再經(jīng)60％氫氧化鈉堿化后用乙醚或庚烷50－100毫升分三次浸提，合并提取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水，活性碳脫色后，水浴上揮干溶劑，殘?jiān)z測用。4．乙醇冷浸提取法：對高度腐敗或肉泥狀，含吩噻嗪又極少的檢材可用堿性乙醇冷浸提取，即取檢材20—40克，加氫氧化鈉溶液呈堿性，加無水乙醇浸泡檢材，充分搖勻，放置過夜，濾出無水乙醇。檢材再用無水乙醇浸洗兩次，過濾。合并醇液于水浴上蒸發(fā)至干。加0.1N鹽酸30毫升溶解殘留物，酸液置冰箱中冷凍，將油脂凍成塊狀后立即過濾，濾液用氫氧化鈉液調(diào)至PH為12，再用乙醚提取，濃縮乙醚至0.5毫升，供檢驗(yàn)用。三、顏色反應(yīng)1．三氯化鐵－硫酸反應(yīng)直接取尿液1毫升，加入5％三氯化鐵溶液0.5毫升，產(chǎn)生桃紅色到紫紅色。再加0.5毫升50％硫酸，顏色不消退，表示含有吩噻嗪類藥物。2．FPN試劑試驗(yàn)(1)原理：吩噻嗪類分子結(jié)構(gòu)中的苯駢嗪環(huán)，易被氧化劑氧化為紅色的醌式衍生物。(2)操作方法：取提取殘?jiān)僭S，放在白瓷反應(yīng)板中（或試管內(nèi)）滴加FPN試劑1－2滴，如有氯丙嗪，異丙嗪及奮乃靜則呈現(xiàn)洋紅色，如有太爾登，三氟拉嗪出現(xiàn)橙紅色。四、薄層色譜法1．薄層板硅膠G或硅膠CMC薄層板2．展開劑（1）苯：醋酸乙酯：二乙胺（9：3：1）（2）苯：環(huán)己烷：二乙胺（1.5：7.5：2）3．顯色（1）50％硫酸－乙醇顯色劑，顯橙色至粉紅色。（2）FPN試劑：呈粉紅色50％硫酸－乙醇液作為顯色劑，只有吩噻嗪類化合物與試劑產(chǎn)生反應(yīng)，其還可以區(qū)別某種吩噻嗪類化舍物。如氯丙嗪與異丙嗪在此展開溶劑系統(tǒng)層析后色斑的Rf值較為接近，但它們的色斑與硫酸－乙醇液作用顯色不同，可區(qū)別開來。吩噻嗪類不穩(wěn)定，易分解，除出現(xiàn)原藥斑點(diǎn)外，其代謝產(chǎn)物斑點(diǎn)也同時(shí)出現(xiàn)，故有時(shí)可同時(shí)出現(xiàn)兩三個斑點(diǎn)，此時(shí)，可先將原點(diǎn)處的斑點(diǎn)加1：1硝酸1滴，以能蓋住原點(diǎn)為度，使檢品及標(biāo)準(zhǔn)樣品全部氧化為亞砜。但一般亞砜顯色較慢，可在紫外線下照射2－3分鐘后即可顯色，待紅色斑點(diǎn)退色后，吹干水分，再用上述溶劑展開，顯色。4．測量計(jì)算判斷結(jié)果試劑配制1．0.1N鹽酸溶液：8.33毫升濃鹽酸用水稀釋至100毫升。2．FPN試劑：5％三氯化鐵1毫升，20％過氯酸9毫升，50％硝酸10毫升，混合即可。3．50％硫酸－乙醇液：50％硫酸40毫升，無水乙醇10毫升混合配制。苯駢二氮雜卓類藥物的檢測目的要求：了解苯二氮卓類藥物的理化性質(zhì)，掌握其分離提取原理和常規(guī)的檢測方法。一、檢材采取應(yīng)以中毒者的剩余食物、飲料，初次洗胃液、血、尿?yàn)槔硐霗z材。二、檢材的分離提取1．分離原理：苯二氮卓類藥物包括安定、舒樂安定、三唑侖、阿普唑侖等，在酸性條件下成鹽溶于水，一般在弱堿性環(huán)境下易被提取，由于安定、三唑侖、阿普唑侖等在乙醚中的溶解度極小，因此在提取時(shí)常選用氯仿等溶劑。2．快速提?。喝∧蚧蛭竷?nèi)容物50毫升，加濃氨水堿化至PH8－9，用氯仿50、30、20毫升分別提取三次，合并提取液于蒸發(fā)皿中，用無水硫酸鈉脫水，活性炭脫色后置水浴上揮干，剩殘?jiān)z測用；對尸體臟器檢材，先將其搗碎，加氨水調(diào)PH8－9，加無水硫酸鈉將檢材研磨至粉渣狀，再以如上方法提取凈化。三、顏色反應(yīng)1．原理：本類藥物與碘化鉍鉀試劑反應(yīng)產(chǎn)生橙紅色沉淀，但許多物質(zhì)都有此反應(yīng)，因此專屬性不強(qiáng)，只能作為預(yù)試驗(yàn)用。2．操作方法：用1毫升氯仿溶解上述殘?jiān)?，用毛?xì)點(diǎn)樣管吸收少部分，滴加在薄層板上，干后，滴加一滴碘化鉍鉀試劑，此時(shí)含苯二氮卓類藥物的斑點(diǎn)顯桔黃色。四、薄層色譜法1．薄層板硅膠G或CMC薄層板2．點(diǎn)樣將提取殘?jiān)c標(biāo)準(zhǔn)品分別用毛細(xì)點(diǎn)樣管點(diǎn)在薄層板上，然后放入層析缸展開劑中進(jìn)行展開。3．展開劑(1)氧仿：丙酮(9：1)(2)甲苯：丙酮：無水乙醇：氨水(9：9：1.6：0.4)4．顯色碘化鉍鉀——顯桔黃色操作方法：當(dāng)層析后取出薄層板晾干，用噴瓶均勻地噴上碘化鉍鉀試劑，此時(shí)苯二氮卓類藥物顯桔黃色斑點(diǎn)。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)進(jìn)行對照，量出Rf值，判斷結(jié)果。五、安定的含量測定一紫外分光光度法1．原理：安定在2—20微克／毫升濃度范圍內(nèi)，其242nm和263nm處的光密度差值與濃度成正比。2．試劑：3M磷酸鹽溶液：41.4克NaH2PO4·H2O加水溶解至100毫升。氯仿(或乙醚)0．45N氫氧化鈉溶液正已烷2N鹽酸溶液安定標(biāo)準(zhǔn)溶液3．操作(1)取檢材5克或5毫升，搗碎后，加3M磷酸鹽溶液0.25毫升，用氯仿30－50毫升振搖提取，分出氯仿液。檢材再用10－20毫升氯仿提取一次，合并氯仿液。(2)氯仿液用10毫升0.45N氫氧化鈉溶液洗滌一次，棄去堿液，再用水洗一次。(3)氯仿液通過干燥的濾紙，濾入蒸發(fā)皿中，揮干（如用乙醚提取，需用無水硫酸鈉脫水后揮干）；4)殘留物用10毫升正已烷溶解，用4.0－10.0毫升（精確）2N鹽酸反提，鹽酸液于220nm－400nm范圍內(nèi)測其吸收光譜，記錄其在242nm和263nm處的光密度。另取一份相應(yīng)的空白檢材，加100微克安定作標(biāo)準(zhǔn)對照，與檢材同樣操作，記錄其在242nm和263nm處的光密度。E檢E檢E標(biāo)mV標(biāo)V檢W安定％(mg／g或m1)=××××0.1E檢一檢材的光密度差值(242nm－263nm)E標(biāo)－標(biāo)準(zhǔn)對照的光密度差值(242nm－263nm)M－標(biāo)準(zhǔn)對照用的安定微克數(shù)V標(biāo)－標(biāo)準(zhǔn)對照2N鹽酸反提液的毫升數(shù)V檢－檢材2N鹽酸反提液的毫升數(shù)W－檢材的克數(shù)或毫升數(shù)六、高效液相色譜分析由于苯二氮卓類的結(jié)構(gòu)各不相同，所以無法用單一的高效液相色譜方法來完全分離它們，但是下面所推薦的方法則可達(dá)到對所有國際控制的苯拿?拳它們，但是下面所推薦的方法則可達(dá)到對所有國際控制的苯二氮卓類化合物定性及定量。常規(guī)分析所采用的色譜柱及流動相系統(tǒng)可根據(jù)所在國家經(jīng)常出現(xiàn)的藥物來選擇。[反相色譜分析]色譜柱：250mm×5tumID填料：5um直徑的HPLC級碳十八硅烷（ODS…Hypar或與之等價(jià)的填料）流動相：甲醇：水：磷酸緩沖液（O.1M）（55：25：20，v／v／v），pH7.25甲醇：水：磷酸緩沖液（O.1M）（70：lO：20，v／v／v），pH7.67磷酸緩沖液（0.1M）可通過溶解二水磷酸二氫鈉(14.35g，0.092mol)和磷酸氫二鈉（1.14g，0.008mol）于1000ml水中制成。流速：1.5ml/min檢測：紫外240nm樣品溶液：用含50％（V／V）水的甲醇液一定的量溶解前述提取殘?jiān)鼧?biāo)準(zhǔn)溶液：均用含50％（V／V）水的甲醇配成濃度為lmg／mvl。進(jìn)樣體積：20ul定量方法：用峰值面積外標(biāo)法定量實(shí)驗(yàn)六農(nóng)藥的檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測目的要求：了解有機(jī)磷農(nóng)藥的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性，掌握分離提取方法，及常見有機(jī)磷農(nóng)藥的鑒別試驗(yàn)。一、檢材的采取有機(jī)磷類農(nóng)藥中毒應(yīng)取中毒者吃剩的飯菜、調(diào)料、飲料、喝剩的農(nóng)藥瓶、嘔吐物、洗胃液、血、尿及肝、腎、肺等檢材。二、有機(jī)磷農(nóng)藥的分離提取方法1．原理：有機(jī)磷品種很多，有的極性較弱，有的極性較強(qiáng)，在提取中要注意根據(jù)有機(jī)磷極性的強(qiáng)弱和檢材中脂肪、蛋白、色素等雜質(zhì)含量的高低，選擇合適的溶劑。原則上，極性強(qiáng)的有機(jī)磷應(yīng)用極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑，極性弱的有機(jī)磷用極性弱的有機(jī)溶劑。敵百蟲、敵敵畏、樂果、磷胺、久效磷等屬強(qiáng)極性有機(jī)磷；3911、1240等屬弱極性有機(jī)磷；1605、4049、1059等屬中極性有機(jī)磷。但總的來說，有機(jī)磷農(nóng)藥的極性都比較強(qiáng)。中等極性和強(qiáng)極性的有機(jī)溶劑，如苯、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲醇等均能將各種有機(jī)磷從檢材中提取出來。2．分離提?。焊鶕?jù)有機(jī)磷易揮發(fā)和在堿性溶液中易水解的特點(diǎn)，一般均在中性或酸性條件下用沸點(diǎn)較低的有機(jī)溶劑提取。在揮發(fā)濃縮時(shí)，溫度不易過高，一般在60根據(jù)檢材的種類、性狀不同，具體提取方法也不同。（1）固體檢材：糧食、面粉等。取檢材50～100克左右，加苯或氯仿適量，振搖提取半小時(shí)，過濾，濾液自然揮干或在60℃（2）半固體：嘔吐物、胃內(nèi)容物、剩余飯菜根據(jù)檢材含水量多少，加適量無水硫酸鈉脫水，再用苯或氯仿提取，如含水較多，可先用丙酮、甲醇等親水性溶媒提取，過濾，濾液再用無水硫酸鈉脫水，同時(shí)也降低了有機(jī)磷農(nóng)藥在水中的溶解度，然后再用石油醚等溶劑振搖提取一些極性較弱的有機(jī)磷；用氯仿提取一些極性較強(qiáng)的有機(jī)磷。（3）液體檢材：飲料、水、尿等?？捎玫热莸谋交蚵确绿崛∪危喜⑻崛∫?，用無水硫酸鈉脫水，過濾，濾液揮去有機(jī)溶媒，濃縮近干，供試。（4）內(nèi)臟組織：先將檢材搗碎，然后移入研缽中，少量多次地加入無水硫酸鈉，研磨，直至呈干沙狀，再轉(zhuǎn)移入燒瓶中，用苯或氯仿提取，過濾，濾液在低于60℃（5）含脂肪較多的檢材：食油、油脂食品①水蒸氣蒸餾法：將檢材用10％酒石酸酸化，收集最初10分鐘內(nèi)餾出的餾液，可直接作試驗(yàn)，或收集餾液50～100毫升，用氯仿振搖提取，提取液置蒸發(fā)皿中，低溫?fù)]發(fā)至1毫升，留作試驗(yàn)。本法對分離提取對硫磷、敵百蟲、樂果效果不好，對其它有機(jī)磷毒物采取減壓蒸餾可提高提取回收率。②乙腈――正已烷提取法：檢材先用60～80％乙腈提取液后，分出乙腈提取液，用6倍體積的20％硫酸溶液稀釋，再用正已烷、石油醚、氯仿提取三次，合并提取液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水濾液自然揮去溶劑，殘?jiān)┰?。乙腈毒性較大，可用丙酮或二甲基甲酰胺代替，正已烷可用石油醚代替。（6）純化：如果尸體腐敗，檢材條件差，或檢材內(nèi)毒物的量極微，提取液內(nèi)的雜質(zhì)可妨礙鑒別試驗(yàn)的結(jié)果，需將提取液濃縮后，經(jīng)層析柱凈化去除雜質(zhì)。1）層析柱凈化法：取30×1．5厘米下端帶活塞的玻璃管1支，在管底放一團(tuán)脫脂棉，管內(nèi)加入2厘米厚的無水硫酸鈉，然后填入氧化鋁混合吸附劑（活性碳1克、硅藻土5克，中性氧化鋁15克混合面成），最上層再加2厘米厚的無水硫酸鈉，使用前層析柱管內(nèi)先加滿氯仿，打開下面活塞，待氯仿流至下端無水硫酸鈉水平時(shí)，將濃縮的提取液加入，然后用100毫升氯仿洗脫，洗脫出的氯仿在室溫下?lián)]發(fā)濃縮后留作試驗(yàn)?；旌衔絼┦孪刃杞?jīng)過如下處理：①中性氧化鋁置400②硅藻土5克加濃硫酸1毫升，發(fā)煙硝酸1毫升，在研缽內(nèi)研至無白煙為止。③酸洗活性碳：30克活性碳加150毫升濃鹽酸，煮沸30分鐘，過濾，用蒸餾水洗至PH為6.5～7.0，經(jīng)120℃2）薄層層析純化薄層純化多用二次展開法。將點(diǎn)有有機(jī)磷檢材的薄板先用單一的正乙烷、庚烷或石油醚等溶媒展開一次，這時(shí)有機(jī)磷基本上留在原點(diǎn)不動，而油脂類雜質(zhì)遠(yuǎn)離原點(diǎn)?？筛娜苊皆僬归_一次，這樣就可使油脂與有機(jī)磷分開。刮下含有機(jī)磷部位的吸附劑，用苯或氯仿等洗脫，然后揮去溶媒，供試。三、常見有機(jī)磷農(nóng)藥的顏色鑒別反應(yīng)1.BTB試紙快速篩選法原理：膽堿酯酶可使乙酰膽堿分解，產(chǎn)生膽堿和乙酸，會使溴麝香草酚藍(lán)試紙由藍(lán)變黃。但有機(jī)磷農(nóng)藥存在時(shí)，便抑制了膽堿酯酶的活，則乙酰膽堿積存不再被分解，使之少產(chǎn)生或不產(chǎn)生乙酸，其降低程度由BTB試紙的顏色變化程度來表示。將試紙與標(biāo)準(zhǔn)色斑比較，便可測知酶的活力，以此來判斷是否含有機(jī)磷農(nóng)藥。試劑：BTB試紙稱取溴麝香草酚藍(lán)0.14克，溴化乙酰膽堿0.23克，加20毫升無水乙醇溶解，以0.4N氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH7.4～7.6(呈灰褐色)。將濾紙浸入該液中，取出晾干(應(yīng)變桔黃色)，貯于棕色瓶中?；蚣舫?×1.2厘米的紙片，用錫紙包好，再用塑料薄膜密封。操作：取BTB試紙兩片分置于玻片兩端，一端紙片中央加中毒者末梢血一滴，另一端加正常人末梢血一滴，標(biāo)記后，立即加蓋另一玻片，用橡皮筋扎緊，迅速放恒溫箱中37[注解]（1）檢液的酸堿度以近中性或弱堿性為好。應(yīng)注意防止周圍酸蒸氣的干擾。（2）玻片要潔凈而又干燥，防止酸堿污染，影響測定效果。（3）血液要滴在紙片中央，血滴不可過大或過小。血斑直徑以0.6～0.8厘米為宜。（4）應(yīng)作對照試驗(yàn)，以正常人血(空白)和已知有機(jī)磷農(nóng)藥分別作空白試驗(yàn)與已知對照試驗(yàn)。要注意試紙如變質(zhì)失效就不可用了。酶活力判定表BTB試紙顏色酶活力中毒程度紅色80～100％正常紫紅色60％輕度中毒深紫色40％中度中毒藍(lán)色20％嚴(yán)重中毒2．含硫代磷酸酯類有機(jī)磷的顏色鑒別反應(yīng)（1）亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)：1059、3911、1240、4049、樂果等有機(jī)磷農(nóng)藥被堿水解后所生成的硫醇化合物，與亞硝酰鐵氰化鈉作用，在酸性溶液中，能產(chǎn)生紅色，檢出限度約0.1毫克／毫升。取經(jīng)精制的乙醇試液，于低溫下蒸去溶劑，酌情加少量蒸餾水（約1～2毫升），加2滴5％亞硝酰鐵氰化鈉（新鮮配制），5滴10％氫氧化鈉，充分振蕩，置30℃此反應(yīng)欠靈敏，條件較為嚴(yán)格。水解時(shí)加堿不可過濃，時(shí)間不可過長，溫度不可過高，根據(jù)實(shí)驗(yàn)證明，30℃（2）亞硝酸反應(yīng)：1059、3911、1240、4049、樂果等有機(jī)磷農(nóng)藥被堿水解后所生成的硫醇化合物能與亞硝酸作用生成亞硝基化合物，該化合物在汞離子（Hg＋＋）存在下水解，又能釋出亞硝酸，與Griess試劑作用，生成紫紅色偶氮化合物。取經(jīng)精制的乙醇試液1～2毫升，加0.4N氫氧化鈉5毫升，在35～40℃水浴中放置10分鐘進(jìn)行水解，加亞硝酸溶液（臨用前將1N硫酸和0.01N亞硝酸鈉溶液按9：1混合）5毫升，加時(shí)應(yīng)由管的中央直接加到溶液中。以免沾到管壁上，影響結(jié)果。放置10分鐘，加25％尿素溶液1毫升，振搖10分鐘，加氨基苯磺酸溶液1毫升，混合后加入飽和二氯化汞溶液0.2毫升混合，再加a－萘胺溶液1毫升，混勻，在37—38℃本反應(yīng)較為靈敏，靈敏度為0.025毫克，還可用作定量試驗(yàn)。本法的關(guān)健在于加尿素去除過剩的亞硝酸，一定要徹底去除干凈，否則極易出現(xiàn)假陽性。同時(shí)，每次必須作空白試驗(yàn)加以對照。（3）對硫磷（1605）偶氮染料反應(yīng)：對硫磷的硝基用鋅粉和鹽酸還原成胺基后，用亞硝酸鹽和鹽酸進(jìn)行重氮化。加氨基磺酸胺除去剩余的亞硝酸，最后與N-1-萘基乙二胺偶合，產(chǎn)生紫色，檢出限度約5微克∕毫升，或與β-萘酚堿液偶合，產(chǎn)生橙黃色，靈敏度較差。取試液約2毫升，加等量蒸餾水，6N鹽酸2滴，鋅粉0.2克，然后置40℃如用l％堿性β-萘酚代替N-l萘基乙二胺，則呈橙黃色。在還原過程中，如加2％硫酸銅2—3滴，則可不加熱，只靜置10分鐘。此反應(yīng)非1605所專有：芳香族硝基和伯胺化合物，如硝基苯，苯胺及磺胺類藥物均能產(chǎn)生陽性反應(yīng)。3．不含硫代磷酸脂類有機(jī)磷的顏色反應(yīng)（1）間苯二酚-氫氧化鈉反應(yīng)：敵敵畏、敵百蟲取上述餾液1滴至濾紙上，加1％間苯二酚酒精液1滴及5％氫氧化鈉醇液1滴，置小火加熱片刻，如有敵敵畏則出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，但敵百蟲也出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，須加鑒別。間苯二酚-氫氧化鈉試劑可制成試紙備用：取間苯二酚l克，溶于50毫升酒精，另取氫氧化鈉5克，溶于0．2％聚乙烯醇水溶液中，兩液混合后，將濾紙浸入，浸透后取出。除去多余液體，溫箱干燥，切成紙條備用。用時(shí)將紙條沾取胃液少許，略微加溫，即顯紅色斑。(制成的試紙密封保存最多兩個月)。（2）碘化鉍鉀試劑反應(yīng)：取上述餾液l滴，置濾紙上，噴以碘化鉍鉀試劑，敵敵畏呈橙紅色，而敵百蟲無反應(yīng)。（3）甲醛硫酸試劑反應(yīng)：取上述餾液1滴，置反應(yīng)板上，干后加1滴甲醛硫酸試劑（40％甲醛3滴，加入3毫升濃硫酸中），敵敵畏呈桔紅色。而敵百蟲呈黃褐色。四、有機(jī)磷農(nóng)藥的薄層色譜分析（一）薄層扳硅膠G板，或硅膠CMC板。（二）展開1．硫代磷酸酯類常用展開劑（表12—2）（1）石油醚：丙酮（4：1）（2）正已烷：乙醚（9：1）（3）氯仿：乙醚（9：1）（4）氯仿：環(huán)已烷（1：1）（5）苯：石油醚：丙酮（7：2：1）常見有機(jī)磷農(nóng)藥簿層色譜上Rf值（硅膠G）展開劑有機(jī)磷農(nóng)藥環(huán)已烷：丙酮（1：1）環(huán)已烷：氯仿（1：1）苯：環(huán)已烷（4：1）苯：石油醚：丙酮（7：2：1）石油醚：丙酮（4：1）敵敵畏敵百蟲樂果對硫磷甲基對硫磷內(nèi)吸磷三硫磷治螟磷乙硫磷甲拌磷亞胺硫磷馬拉硫磷殺螟松雙硫磷辛硫磷70.550.390.3，0.720.720.630.650.31，0.770.27，0.580.360.440.330.550.300.090.000.460.370.57，0.590.56，0.66，0.850.570.48，0.380.620.22，0.520.22，0.54，0.630.400.350.550.100.000.620.460.03，0.550.85，0.910.700.50，0.700.650.16，0.600.150.520.390.720.420.400.100.880.820.41，0.870.960.950.890.960.800.680.840.770.910.140.550.450.640.700.680.350.750.250.510.450.592．?dāng)硵澄泛蛿嘲傧x常用展開劑（1）庚烷：丙酮（6：4）（2）庚烷：丙酮（1：1）（3）石油醚：醋酸乙酯（1：1）敵敵畏和敵百蟲常用展開劑展開劑農(nóng)藥庚烷：丙酮（6：4）庚烷：丙酮（1：1）石油醚：醋酸乙酯（1：1）敵敵畏敵百蟲0.440.290.690.450.670.18(三)顯色（1）試劑配制①酶溶液：任選下面一種A、新鮮人或動物血清，市售凍干馬血清亦可，用前按1：4用水稀釋。B、新鮮動物（如小白鼠）肝組織勻漿上清液，（將白鼠肝組織按l：9用水研磨成勻漿，離心，取上清液，貯于冰箱備用）。用前按1：4至l：9用水稀釋。②酶作用液A、取10毫克β醋酸萘酯溶于8毫升乙醇中。B、取40毫克快藍(lán)B(FastbluesaltB)溶于32毫升水中。用前：兩液混合即可，但溶液必須澄清。（2）操作方法：將分離提取濃縮液點(diǎn)樣，展開后的薄層板置溴氣(5％溴-四氯化碳液)中處理30～60秒鐘，取出，將溴揮掉后（對不含硫的有機(jī)磷農(nóng)藥的DDVP等可以不經(jīng)過溴處理）噴酶溶液一層，使表面均勻濕潤為度。置保溫盒內(nèi)，放37℃溫箱30分鐘，取出，再噴酶作用液，陽性處顯色斑，若不明顯可再置37酶抑制試驗(yàn)可作為有機(jī)磷農(nóng)藥的篩選方法，陰性結(jié)果可排除有機(jī)磷毒物的存在，而陽性結(jié)果不能肯定是有機(jī)磷類毒物，因?yàn)槟芤种颇憠A酯酶的物質(zhì)很多，尚需進(jìn)一步做確證試驗(yàn)。2．硫代磷酸酯類有機(jī)磷的顯色方法（1）二氯醌氯亞胺-溴法將已展開后的薄層板稍晾干，立即噴0.5％二氯醌氯亞胺醇液，然后于溴蒸氣中熏1分鐘，1605、甲基1605顯紅色，1059顯黃色，其它含硫有機(jī)磷顯橙紅色。（2）溴-剛果紅法經(jīng)展開后的薄層板稍干后，于溴氣缸內(nèi)熏1分鐘，取出揮去多余溴（一定要揮盡，否則背景也為藍(lán)色），再噴0.4％剛果紅溶液，合硫有機(jī)磷顯藍(lán)色斑點(diǎn)，背景桃紅色。（3）氯化鈀法經(jīng)展開后的薄層板稍干后，淡氣熏蒸1分鐘后，噴0.5％氧化鈀液，有機(jī)磷顯黃色斑點(diǎn)。3．?dāng)硵澄泛蛿嘲傧x的顯色方法（1）間苯二酚氫氧化鈉法將展開的薄層板晾干后，噴間苯二酚-氫氧化鈉溶液（1％間苯二酚乙醇液和5％氫氧化鈉溶液，二者臨用前等量混合），敵敵畏、敵百蟲顯紅色，如顯色不明顯可稍加熱促進(jìn)顯色。（2）碘化鉍鉀法將展開晾干的薄層板噴碘化鉍鉀液，敵敵畏顯橙紅色，敵百蟲不顯色。五、氣相色譜法應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的定量分析，方法簡便而準(zhǔn)確，一般采用分配氣相色譜法，由于峰高或峰面積受柱溫、載氣流量、操作中誤差的影響，所以多采用內(nèi)標(biāo)法，即在注入色譜柱前，加入內(nèi)標(biāo)物，經(jīng)色譜分析后，在記錄圖上求得被測物與內(nèi)標(biāo)物的峰高或峰面積比，在事先做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出被分析農(nóng)藥的含量?！财鞑摹?．氣相色譜儀。2．微量注射器3．玻璃色譜柱（2米）〔分析條件〕1．火焰光度檢測器，量少時(shí)可用氮磷檢測器2．固定液：2.5％QF—l和5％DC一2003．擔(dān)體：chromosorbWAWDMCS4．柱溫：2005．檢測器溫度：220℃6．氣化室溫度：230℃7．載氣：N22.4kg(78ml／分)8．燃燒氣：H21.1kg(62ml／分)9．空氣：0.36kg(150m1／分)〔操作〕將檢材（胃內(nèi)容物）2g置于蒸發(fā)皿中，向其中加入內(nèi)標(biāo)物，按前述方法進(jìn)行同步提取凈化(參照檢材處理)，濃縮液取1μl注入氣相色譜儀。配制一個系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，向其中加入相同濃度的內(nèi)標(biāo)物，取1μl注入氣相色譜儀，求出標(biāo)準(zhǔn)液峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比值并與標(biāo)準(zhǔn)液濃度做一曲線求算出檢材中有機(jī)磷農(nóng)藥的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，在上述曲線上即可查出相應(yīng)的濃度?！沧⒔狻常?）在進(jìn)行定量分析之前必須對色譜峰進(jìn)行定性鑒別，方法是與各個標(biāo)準(zhǔn)品色譜的保留時(shí)問加以對照，必要時(shí)可在兩根色譜柱上進(jìn)行。（2）由于氣相色譜法靈敏度高，應(yīng)選用較高純度的化學(xué)試劑。附：試劑配制1．氨基苯磺酸溶液：氨基苯磺酸0.1克，溶于25毫升l0％醋酸中，必要時(shí)略微加溫。2．a(chǎn)一萘胺溶液；a一萘胺0.1克，溶于50毫升10％醋酸中，必要時(shí)加熱，如有出現(xiàn)蘭紫色沉淀，則去渣，留無色溶液備用。3．0.5％N—l萘基乙二胺溶液：N一1萘基乙二胺0.5克，溶于100毫升水中，加少許稀鹽醋酸化。4．1％β-萘酚l克，溶于10％氫氧化鈉溶液100毫升中(用前新配制)。5．5％氫氧化鈉醇液：氫氧化鈉5克，溶于100毫升95％乙醇中。6．1％間苯二酚乙醇液：間苯二酚l克，溶于100毫升95％乙醇中。7。0.5％二氯醌亞胺醇液：0.5克二氯醌氯酰胺溶于100毫升95％乙醇中。8．0.4％剛果紅溶液：0.4克剛果紅溶于100毫升50％乙醇溶液中再加2～3毫升5％氫氧化鈉溶液混合。9．氯化鈀試劑：取11毫克氯化鈀溶于25毫升0.1N鹽酸中。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢驗(yàn)?zāi)康囊螅毫私鈹M除蟲菊酯類農(nóng)藥理化性質(zhì)與毒性，掌握其分離提取原理和常規(guī)的檢測方法。一、檢材的采取對于此類毒物中毒者，可取其吃剩余的食物、嘔吐物、初次洗胃液；中毒死亡者取其胃內(nèi)容物，血液和腦、肝等檢材為宜。二、檢材的分離提取1．分離原理：此類農(nóng)藥對哺乳動物毒性較小，微溶或不溶于水，溶于乙醇、苯、丙酮、氯仿、二氯甲烷乙醚等大多數(shù)有機(jī)溶劑中，遇酸較穩(wěn)定，在堿性介質(zhì)中分解較快。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥大多極性較低，提取液常選用混合溶劑。2．快速提取：取檢材剪碎，加無水硫酸鈉于研缽內(nèi)研至粉狀，置三角燒瓶中，用氯仿：乙醚（1：1）混合液浸泡檢材，置于振蕩器上，振蕩10分鐘，如此反復(fù)浸提三次后，收集提取液，脫色、脫水、過濾、低溫（60℃三、顏色反應(yīng)1．普魯士蘭反應(yīng)．①原理：氰戊菊酯所含的雜質(zhì)帶有氰基團(tuán)，在酸性條件下與堿性硫酸亞鐵作用，再經(jīng)酸化處理可生成普魯士蘭。②操作方法：直接取檢材置于三角瓶中，加蒸餾水至檢材微浸沒或使其呈稀糊狀，加10％H2SO45ml，瓶口復(fù)蓋一張滴有硫酸亞鐵-氫氧化鈉的濾紙，微火加熱半小時(shí)，取下濾紙，用稀鹽酸酸化，濾紙上產(chǎn)生普魯士蘭色。2．碘化鉍鉀試劑顯色：本類農(nóng)藥大多數(shù)能與碘化鉍鉀試劑反應(yīng)顯橙紅色。操作方法：將提取的殘?jiān)蒙僭S氯仿溶解后，用毛細(xì)管吸取適量滴加在濾紙上，加一滴碘化鉍鉀試劑，即顯橙紅色或桔黃色斑點(diǎn)。四、薄層色譜分析法吸附劑用硅膠G或硅膠GF254。展開劑宜選用弱極性的正已烷為基礎(chǔ)，用中等極性的有機(jī)溶劑調(diào)節(jié)極性。例如有五種展開劑對常見的幾種擬除蟲菊酯類殺蟲藥的展開比移值見表13－1擬除蟲菊酯類殺蟲藥的分子中有發(fā)色團(tuán)扣助色團(tuán)，能吸收紫外光；于硅膠GF254板上點(diǎn)樣展開后，在254nm的紫外燈下可見亮綠色的熒光背景上有暗色斑點(diǎn)。也可將展開后的薄層板揮去溶劑用以下方法顯色：（1）薄層板上噴0.5％鄰聯(lián)甲苯胺乙醇液，含氯殺蟲藥顯綠色，背景白色，靈敏度3～5μg。（2）顯色劑用1g鄰聯(lián)甲苯胺溶于10ml冰乙酸中，4g碘化鉀溶于10ml水中，將兩液混合后加水稀釋至1L。先在氯氣發(fā)生器中用10g高錳酸鉀加5ml濃鹽酸使產(chǎn)生氯氣，將薄層板放置其中熏30s后，取出再噴顯色劑。擬除蟲菊酯類殺蟲藥顯藍(lán)色，背景為白色。靈敏度1～5μg。鹵代有機(jī)化合物有干擾。（3）噴上0.8％KMnO4水溶液，背景紫紅色，斑點(diǎn)顯淺黃色。將薄層板置于溴蒸氣中熏約1min后，黃色斑點(diǎn)顏色加深。再噴0.4％剛果紅乙醇液，背景棕紅色，斑點(diǎn)顯藍(lán)色。靈敏度0.5～5μg。有還原性的物質(zhì)都能被KMnO4。氧化而顯色。擬除蟲菊酯類顯色靈敏度較低，經(jīng)溴熏后，顏色加深。用剛果紅試劑噴后，斑點(diǎn)顏色不易褪去，可存放多日。（4）薄層板上噴2：1磷酸水溶液，在110℃烤5～10min，再噴5％磷鉬酸乙醇溶液，在110℃再烤2～5min，擬除蟲菊酯殺蟲藥呈黑藍(lán)色，背景為淺黃色。靈敏度3～5（5）噴0.5％硝酸銀氨性溶液，再用紫外光照射5min，含鹵素的擬除蟲菊酯殺蟲藥呈灰至棕色斑點(diǎn)，背景白至淺灰色。靈敏度3～5μg。（6）碘化鉍鉀試劑顯色：呈橙紅色或桔黃色斑點(diǎn)。擬除蟲菊酯殺蟲藥的薄層層析Rf值殺蟲藥已烷：苯（45：55）已烷：乙醚（50：10）已烷：丙酮：苯（9：1：1）已烷：乙醚：甲酸（70：30：1）已烷：乙酸乙酯（19：1）溴氰菊酯氯氰菊酯氰戊菊酯二氯苯醚菊酯0.720.130.260.640.860.680.760.860.460.360.460.540.410.510.690.540.410.470.530.420.670.770.830.740.810.870.990.670.590.680.660.250.780.710.410.560.640.760.630.860.730.740.93實(shí)驗(yàn)七殺鼠劑的檢測（I）——磷化鋅、敵鼠、的檢驗(yàn)?zāi)康囊螅菏煜ち谆\檢材的分離提取特點(diǎn)，掌握分析鑒定方法。了解敵鼠、安妥的理化性質(zhì)，檢材處理和鑒定要點(diǎn)。一、磷化鋅的檢驗(yàn)1．檢材的采取磷化鋅比重較大，呈灰黑色粉末，一般沉淀于中毒者的胃底部，取材應(yīng)注意最好取中毒者的剩余食物、胃內(nèi)容物、腸內(nèi)容物做毒物檢驗(yàn)。了解因敵鼠鈉中毒潛伏期，應(yīng)取血尿或臟器等進(jìn)行檢驗(yàn)。磷化鋅可分為檢測磷化氫和檢測鋅離子兩部分。檢驗(yàn)磷化氫成分時(shí)，無需分離，可以用加酸后檢查逸出的磷化氫氣體，檢驗(yàn)鋅的成分時(shí)，則需先行有機(jī)質(zhì)破壞，而后檢驗(yàn)鋅離子。2．磷化氫的檢測：硝酸銀試紙法或溴化汞試紙法利用顧特蔡氏測砷裝置，瓶內(nèi)裝適量檢材，加蒸餾水調(diào)成稀糊狀，中間管亦裝入醋酸鉛棉花，上管插入硝酸試紙（以濾紙條浸10％硝酸銀，于暗處晾干備用，瓶內(nèi)加1：1硫酸5～10毫升，立即塞緊瓶塞，放暗處，如有磷化氫存在，半小時(shí)后即變黑褐色，如與溴化汞或氯化汞試紙作用則生成鮮黃色。此法靈敏，但硫化氫對本反應(yīng)有干擾。3．鋅的檢測有機(jī)質(zhì)破壞可用灰化法，取內(nèi)臟檢材5～15克，置坩鍋中。先在電爐上炭化，再置高溫電爐600℃(1)雙硫腙法將部分灰化液用氫氧化鈉堿化取2滴，置于一小試管內(nèi)，加二苯硫代偕肼腙試劑2滴，振搖。四氧化碳層則由綠色變?yōu)樽霞t色。若有0.9微克鋅離子存在即能檢出，故十分靈敏。但許多金屬也能引起此顏色反應(yīng)，常必須在堿性溶液中進(jìn)行方為鋅特效反應(yīng)。(2)亞鐵氰化鋅沉淀反應(yīng)取部分灰化液加稀醋酸酸化，加5％亞鐵氰化鉀溶液，生成亞鐵氰化鋅白色沉淀，沉淀不溶于稀酸，可溶于堿液中。二、敵鼠的檢驗(yàn)(一)檢材的分離提取檢材如是胃內(nèi)容物，食物、嘔吐物等，可經(jīng)搗碎后先用乙醇溫浸、提取，然后揮去乙醇，殘?jiān)儆脽o水乙醇溶解，濾去不溶物，醇液經(jīng)濃縮后，過中性氧化鋁純化柱，用氯仿洗脫，收集氯仿液，揮去氯仿，殘?jiān)┰?。如檢材是液狀體，可先加稀鹽酸酸化，于分液漏斗中，用氯仿振搖提取，將提取液濃縮后通過中性氧化鋁純化柱，再用氧仿洗脫，收集洗脫液，揮干殘?jiān)┰嚒?nèi)臟組織(肝、腎等)，可先將搗碎然后放于具塞三角燒瓶中，用2N硫酸酸化后用40毫升乙醚振搖提取10分鐘，靜置分層分出醚液，再將檢材用20毫升乙醚提取一次，合并兩次乙醚提取液于分液漏斗中，用50毫升1％焦磷酸鈉分兩次反提醚液，合并焦磷酸鈉提取液于另一分液漏斗內(nèi)，棄去醚液，再用50毫升乙酸乙酯分兩次提取焦磷酸鈉溶液，棄去焦磷酸鈉液，乙酸乙酯液用10毫升1％氫氧化鈉液洗一次，再用10毫升蒸餾水洗一次，然后移入蒸發(fā)皿中，于水浴上蒸干殘?jiān)┰嚒?二)分析方法1．顏色反應(yīng)三氯化鐵試驗(yàn)：提取的殘?jiān)苡谝掖迹?～2滴1％三氯化鐵，溶液呈紅色，加氯仿振搖，氯仿層顯紅色。也可直接將殘?jiān)旱渭釉诎状欧磻?yīng)板上，干后加l％三氯化鐵試劑1～2滴，顯磚紅色。2．薄層色譜法(1)薄層板：硅膠G或硅膠CMC板。(2)展開劑：①氯仿：醋酸乙酯：乙醇(4：2：1)②四氯化碳：丙酮2：1③四氯化碳：乙醇=2：1(3)顯色①1％三氯化鐵乙醇液：敵鼠呈紅色斑點(diǎn)。②甲酸能使敵鼠顯紅色，故用含甲酸的展開劑展開時(shí)，可見紅色斑點(diǎn)上升，不必再用其它方法顯色。殺鼠劑的檢測（Ⅱ）——氟乙酰胺、毒鼠強(qiáng)的檢驗(yàn)?zāi)康囊螅赫莆辗阴０贰⒍臼髲?qiáng)中毒案例中檢材的采取以及常用的分析鑒定方法。一、氟乙酰胺的檢驗(yàn)1．檢材的采取最好取剩余食物、胃內(nèi)容物、初次洗胃液，嘔吐物等體外檢材最佳，其次是血液或臟器。氟乙酰胺是水溶性檢材，通過腎臟隨尿液排泄，所以尿是比較理想的檢材。2．中毒原因由于氟乙酰胺、毒鼠強(qiáng)對人畜的毒性極大，因此多年前就被我國禁止生產(chǎn)和使用。但又因其殺鼠效果極佳，生產(chǎn)工藝簡單，成本低，目前仍有不少地下工廠私自違法生產(chǎn)，作為殺鼠劑投放市場，造成許多中毒事件的隨之發(fā)生。對于氟乙酰胺、毒鼠強(qiáng)的檢材，目前報(bào)道的方法較多，現(xiàn)將公安部第二研究所對這兩種殺鼠劑檢測方法介紹如下：氟乙酰胺的檢驗(yàn)程序1．所用試劑：甲醇，10％氫氧化鈉溶液，50％硫酸鋅溶液，50％氫氧化鈉溶液，硫代水楊酸，5％鐵氰化鉀溶液。2．步驟：（1）浸泡過夜：送檢嘔吐物5～10克即可；送檢胃內(nèi)容物10～20克；送檢胃，肝或腸取20～30克；豬、羊、狗或牛、馬及其胃內(nèi)容物或飼料應(yīng)取40克以上；中毒者吃剩的食物應(yīng)取30克左右；送檢飲料器皿如酒瓶之類，應(yīng)取整個食物，臟器均剪碎后用甲醇：水（7：3）通常以100毫升浸泡過夜為宜，具體視送檢檢材情況而定。最少浸泡6～8小時(shí)，通常過夜，特別是腐敗檢材，溶液浸泡宜長不宜短。（2）過濾揮干甲醇：空白添加FCH2CONH2500微克，將所浸泡的檢材溶液過濾（用普通濾紙即可）后，用10％氫氧化鈉調(diào)PH值為8～9之后，將濾液置水浴鍋上揮干甲醇，水溶液溫度以控制在80度以內(nèi)（通常使濾液總體積在3～5毫升左右），揮干甲醇過程中，要常注意溶液的PH值變化。（注意：凡中毒者生前的飲料之類干凈液體可以不經(jīng)過上述兩步，直接視檢材情況而可以做后面的硫靛反應(yīng)）。（3）50％ZnSO4沉淀蛋白：將上述揮干甲醇的檢材濾液（一般3～5毫升）中加50％ZnSO4，量一般為4～5滴管，并一定要充分?jǐn)嚢瑁怪恋淼鞍淄耆?！靜置一分鐘左右逐滴滴加50％NaOH（此時(shí)切忌攪拌?。┐麄€器皿中出現(xiàn)“豆腐腦”狀沉淀物時(shí)（PH值約為7），亦證明沉淀完全之后再滴加50％NaOH（即過量堿），使原沉淀物又呈液狀（PH值約為14）。（4）離心上述沉淀物，一遍即可。（5）硫靛反應(yīng)：在上述檢材離心液中加硫代水楊酸100毫克（視檢材情況），充分?jǐn)嚢?，使之全溶。?）高溫反應(yīng)：在電烘箱中（溫度為140度）烘烤13～14小時(shí)，注意器皿應(yīng)加蓋以防爆沸。（7）鐵氰化鉀反應(yīng)：取出烘箱中檢材，用少量蒸餾水溶解后，加50％鐵氰化鉀，邊加邊攪拌，直至蒸發(fā)皿中呈現(xiàn)粉紅色為宜。置試管中，加入1～2毫升氯仿，離心后可在試管底部呈現(xiàn)紅色沉淀物。（8）薄層色譜反應(yīng)：用氯仿或氯仿：苯（4：1）或苯：丙酮（4：1）作展開劑，此法不用顯色劑！二、毒鼠強(qiáng)的檢測（一）檢材的提取和分離將含有毒鼠強(qiáng)的血液或臟器、食物殘?jiān)葯z材，搗碎后加無水硫酸鈉內(nèi)研至干粉狀，置三角燒瓶內(nèi)，用苯浸泡檢材，置振蕩器上振蕩10分鐘，如此反復(fù)提取三次后，收集提取液，脫水、脫色、過濾，置低溫水浴上揮發(fā)干溶劑，得殘?jiān)z驗(yàn)用。如檢材為液體，可直接用苯于分液漏斗中萃?。ㄈ缧枰捎弥行灾鶎游龇ㄟM(jìn)一步凈化）。(二)檢驗(yàn)方法1．薄層色譜法（1）薄層板：高效硅膠GF254薄層板（2）展開劑：苯：乙酸乙酯（4：1）Rf＝0.79環(huán)己烷：二氧六環(huán)（1：1）Rf＝0.71苯：環(huán)己烷：乙酸乙酯（5：2：2）Rf＝0.58環(huán)己烷：乙酸乙酯：二氧六環(huán)（5：2：2）Rf＝0.76（3）顯色1）UV254燈下觀察檢材斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)進(jìn)行對照。2）碘化鉍鉀試劑顯色：毒鼠強(qiáng)遇碘化鉍鉀試劑后呈暗黃色斑點(diǎn)。2．氣相色譜法GC/FID的色譜條件3％OV－17（2m×2mm）玻璃填充柱，氫氣30Psi，空氣40Psi，柱前壓40Psi，進(jìn)樣口280℃，檢測器的溫度為300℃，柱溫200℃實(shí)驗(yàn)八金屬毒物的檢測目的要求：通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步理解常見金屬毒物的分離和檢測原理，掌握常見金屬毒物的篩選定性方法和砷化物的定量分析方法。一、檢材的采取急性砷、汞中毒，可直接取中毒者的嘔吐物，排泄物，剩余食物等檢材直接進(jìn)行銅片法實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。對于毛發(fā)、指甲、骨骼以及血液，肝、腎等生物檢材，則應(yīng)首先進(jìn)行有機(jī)質(zhì)破壞后，再采用高靈敏度的原子吸收光譜進(jìn)行檢測。二、砷、汞化合物的常見定性定量分析方法1．銅片試驗(yàn)法(Reinschs法)〔原理〕在鹽酸溶液中，砷、汞等金屬能與金屬銅作用而沉積在銅的表面，使其變色，表面沉積物的色澤因元素的不同而異，可初步對毒物予以識別?！膊僮鞣椒ā硨⒓羲榛驌v碎的檢材10克左右置入錐形瓶中，加蒸餾水調(diào)稀至20毫升，加入濃鹽酸5毫升，搖勻；放入2～3片剪成0．3×1cm的銅片，將燒瓶在小火上煮沸30分鐘，并隨時(shí)觀察銅片表面是否變色。如銅片變黑色，表明可能會有砷；如為銀灰色，則可能含有汞。注意事項(xiàng)（1）除砷、汞以外，銻、鉍、硒、硫等化合物也可能在同樣條件下與銅作用，使銅變色，尤其是硫化物普遍存在于腐敗檢材中，其也可能使銅片變成黑色，經(jīng)常干擾反應(yīng)。（2）試驗(yàn)中鹽酸酸度必須保持溶液含2～8％鹽酸，不應(yīng)用氧化力較強(qiáng)的硝酸或硫酸，如酸度過高則砷、汞等易揮發(fā)損失，酸度過低則反應(yīng)不能進(jìn)行，易造成假陰性結(jié)果。（3）反應(yīng)過程中如發(fā)現(xiàn)銅片明顯變黑，可停止加熱，取出銅片，防止長時(shí)間煮沸造成沉積物脫落。（4）所有試劑均不含砷（或汞），應(yīng)同時(shí)做空白和已知樣品的對照試驗(yàn)。2．升華試驗(yàn)〔原理〕砷經(jīng)加熱即氧化升華，遇冷凝集成三氧化二砷八面體或四面體結(jié)晶。汞加熱升華，遇冷凝集成黑色不透明的圓球?！膊僮鞣椒ā硨⑺玫淖兩~片，用水和酒精輕輕洗去附著雜質(zhì)，將銅片置于一小干燥試管(0.6×6cm)內(nèi)，傾斜45度角。在酒精燈上小心加熱試管底部．待銅片開始變色或有煙霧升起時(shí)，立即離開火焰，冷后倒出銅片，將小試管置顯微鏡下觀察結(jié)晶體。〔注意〕銻、硒加熱后生成的氧化物不易升華，鉍和硫化物不能升華。3．砷化物定量分析砷化氫――溴化汞試紙法(Gutzeit氏改良法)〔原理〕砷的氧化物，經(jīng)新生的氫氣還原成砷化氫，隨氫氣逸出，與溴化汞試紙作用，生成黃色至棕色斑點(diǎn)，色斑顏色深淺及長度與砷的含量成正比，利用檢材樣品試紙條上生成的砷斑長度與標(biāo)準(zhǔn)砷斑長度比較即可算出檢材中的砷含量。AsH3+3HgBr2→2HBr+AsH(HgBr)2(黃色)AsH3+3HgBr2→3HBr+As(HgBr)3(黃棕色)〔操作方法〕（1）取嘔吐物、剩余食物等檢材加水稀釋至適當(dāng)量(20～50毫升)，裝入瓶中(圖3—1)。加5毫升無砷濃鹽酸，5毫升15％碘化鉀，4滴40％氯化亞錫，放置15分鐘，以還原5價(jià)砷成3價(jià)砷。中間管內(nèi)松松地裝入醋酸鉛棉花(脫脂棉浸入10％醋酸鉛溶液中，取出擰至半干)，用以吸收硫化氫，以避免顏色干擾。上管內(nèi)插入溴化汞試紙條(120×2．5毫米大小之濾紙條浸入5％溴化汞酒精溶液中5分鐘，取出涼干)。加3克鋅粒于瓶中，迅速塞緊瓶塞，30分鐘后，觀察溴化汞試紙上有無棕黃色斑形成。注意定量測定時(shí)，各裝置瓶內(nèi)都必須保持最后相同的終體積。如圖3—1所示。（2）標(biāo)準(zhǔn)砷溶液的制備在分析天平上稱取三氧化二砷0．261克，加10毫升10％氫氧化鈉溶液溶解，加適量水稀釋，加10％HCL使之微變?yōu)樗嵝裕僭谌萘科績?nèi)加水稀釋至1000毫升，即每1毫升含1毫克的砷