巴氏染色原理

/巴氏染色法是脫落細(xì)胞染色中最好的染色方法。蘇木素染液，細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木素精堿性染料以離子或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。分化：蘇木素染色之后，用水洗去未結(jié)合在細(xì)胞上的染液，但是在細(xì)胞核中結(jié)合過多的染料和細(xì)胞漿中吸附的染料必須用分化液1%鹽酸酒精脫去，才能保證細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色的分明，把這個過程稱為染色的分化作用。因酸能破壞蘇木素的醌型結(jié)構(gòu)，使色素與組織解離，分化不可過度。藍(lán)化：分化之后蘇木素在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài)，而呈藍(lán)色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱堿性水使蘇木精染上的細(xì)胞核變呈藍(lán)色，稱藍(lán)化作用，一般多用自來水浸洗即可變藍(lán)，也可用溫水（50度溫水最佳）變藍(lán)。EA50染液的酸堿度對于巴氏染色的成功起著關(guān)鍵作用，EA50染液由伊紅、亮綠、等染料配成。伊紅、亮綠、橘黃等屬于酸性染料，在溶解媒中其發(fā)色團(tuán)是負(fù)離子部分，發(fā)色團(tuán)可與蛋白質(zhì)中帶正電的氨基結(jié)合，從而是胞漿顯藍(lán)色、綠色、橘黃色或紅色，但蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷的多少是隨溶液的PH值而改變的，在偏堿環(huán)境中，蛋白質(zhì)的羧基游離增多（帶負(fù)電），在偏酸環(huán)境中蛋白質(zhì)氨基游離增多（帶正電），磷鎢酸在染色過程中，不但作為媒染劑可增加染料的著色力，同時磷鎢酸與碳酸鋰還是一對弱酸弱堿，實際上是一對緩沖劑，可中和分化與藍(lán)化時可能留下的少量酸或堿，保證染色達(dá)到理想效果，其適用于上皮細(xì)胞與間皮組織的標(biāo)本，是陰道脫落細(xì)胞檢查中最常用的染色方法，該染色法不但具有顯示細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰、分色明顯、透明度好、胞漿受色鮮艷等特點(diǎn)。巴氏染色法將胞核染為深藍(lán)色；鱗狀上皮底層、中層與表層角化前細(xì)胞胞質(zhì)染綠色，表層不全角化細(xì)胞胞質(zhì)染粉紅色，完全角化細(xì)胞胞質(zhì)呈桔黃色；細(xì)菌：灰色；滴蟲：淡藍(lán)灰色；黏液：淡藍(lán)色或粉紅色；中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞胞質(zhì)均為藍(lán)色；紅細(xì)胞染粉紅色；高分化鱗癌細(xì)胞可染成粉紅色或桔黃色；腺癌胞質(zhì)呈灰藍(lán)色。巴氏染色的操作方法與注意事項染色有4個步驟：1、固定；2、核染色；3、胞漿染色；4、透明。主要達(dá)到以下要求：1、核的結(jié)構(gòu)清晰；2、透明度高；3、分色恰當(dāng)。一、固定固定的目的細(xì)胞制片的迅速固定是制片過程中關(guān)鍵的一步，否則會影響細(xì)胞學(xué)診斷的準(zhǔn)確性。對于不同的標(biāo)本需要不同的固定方法。最為常用的固定方法是95％酒精作為固定液的濕固定法。酒精作為一種脫水劑能夠防止細(xì)胞內(nèi)的酶捋蛋白質(zhì)分解而自容，并凝固細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等，使其保持與組織生活相仿的成分，從而使細(xì)胞各部分，尤其核染色質(zhì)易于著色。對于巴氏染色來說，酒精固定最為重要的。如果酒精濃度不足引起的固定不佳，可造成細(xì)胞的人為變化，并可導(dǎo)致假陽性或假陰性的診斷。1、固定方法濕固定法：作為用95％酒精固定液固定的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本一定使用濕固定法。制片制備完后，趁標(biāo)本新鮮而又濕潤時，立即放入盛有95％酒精的固定缸內(nèi)。制片在固定液內(nèi)至少保持15-30min。固定時間通常不超過1周。這種制片染色后，顏色鮮艷，結(jié)構(gòu)清晰。如果細(xì)胞制片需要送至另一實驗室或郵寄他處染色時，可以固定15min后，把制片取出后立即密封的容器中或者使用甘油防止制片干燥。因為無論固定前或固定后的制片，如果發(fā)生干燥后都會影響染色的效果。2、固定注意事項固定液的過濾：為了防止細(xì)胞污染，凡是使用過的固定液，必須過濾后才能再使用。使用過長的固定液，必須用酒精相對密度計測定，酒精濃度低于90％時應(yīng)該與時更換新液。濕固定的重要性：標(biāo)本再新鮮時與時固定時保證染色效果的重要因素。如蘇木素對細(xì)胞核的染色，巴氏染色中胞漿的特殊著色作用，均可因標(biāo)本干燥后固定而大受影響。制片標(biāo)本的郵寄：標(biāo)本再固定15min后取出，立即加甘油數(shù)滴于制片上，裝入密封的小盒中。實驗室在收到標(biāo)本后，先浸入95％酒精中，使甘油溶去，再進(jìn)行染色。二、核染色1、蘇木素液浸染時間一般在3-5min，但是必須隨氣溫和燃料情況而酌情改變。夏季或放置較久的蘇木素染液容易著色，時間要縮短；冬季或新配制的蘇木素染液和應(yīng)用已久較稀釋的蘇木素液不易著色，時間要延長。在使用蘇木素染色時，一般有2種方法：1）過染法：首先有意識地進(jìn)行深染，然后通過鹽酸酸化過程使核染色趨于合適。這種方法能夠在酸化過程中把胞漿內(nèi)黏附多余的蘇木素染料去掉，使胞漿染色更為鮮艷、清晰、多用于黏液多的標(biāo)本。2）淡染法：在核染色過程中，嚴(yán)格掌握染色時間，使核染色適宜而不用鹽酸酸化，但是胞漿中少量的蘇木素會影響EA染色的質(zhì)量。主要用于黏液少的標(biāo)本，避免在酸化和自來水沖洗的過程中使細(xì)胞成片地脫落。在使用蘇木素染色時，一定要每日進(jìn)行過濾，否則蘇木素結(jié)晶會影響染色的質(zhì)量。一般蘇木素染液可以使用較長時間，所以每日增加少量新鮮染液即可。2、堿化堿化亦稱返藍(lán)過程，可以使用飽和碳酸鋰或3％氨水堿化，目的使蘇木素與早顯色，時間約數(shù)秒。更重要的是流水沖洗，可使藍(lán)色顯的更鮮艷。堿性溶液亦需要充分漂清才不會妨礙下一步的胞漿著色與標(biāo)本制成后的顏色保存。分化和堿化溶液至少每天更換新液。三、胞漿染色胞漿染色在巴氏方法中亦稱為OG—EA染色，它包括橘黃G（OG）和EA兩部分染色。由于橘黃G是一種小分子染料，能夠很快地作用于胞漿，一般染色時間不宜過長，通常1-2min。對于宮頸、陰道上皮中非正常角化細(xì)胞和角化型鱗癌細(xì)胞的胞漿中都可以出現(xiàn)鮮艷的橘黃色。四、封固制片封固制片對于避免空氣干燥的影響，制片經(jīng)長期存放不褪色是非常重要的。一般使用24mm×50mm或24mm×60mm的蓋玻片，用二甲苯調(diào)配的中性樹膠進(jìn)行封固。五、透明染色的最后一步是透明，使細(xì)胞的色度與細(xì)胞的重疊不致影響鏡下檢查。這是在脫水與制片封固之間的一項重要步驟。最常用的透明溶劑使二甲苯，二甲苯的折射率在1.494，載玻片的折射率在1.515，兩者較為匹配。如果二甲苯溶液出現(xiàn)顏色或變得渾濁，一定要更換新液。巴氏染色操作流程95％乙醇固定（15min）→清水沖洗多次→蘇木素染液（3-5min）→清水沖洗三次→藍(lán)化→95％乙醇漂洗→橙黃染液（1-10s）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→100%乙醇漂洗→EA50（3-5m）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→無水乙醇漂洗→無水乙醇（2min）→二甲苯（2min）→中性樹膠封片染色注意事項1、細(xì)胞核著色不佳（1）細(xì)胞核著色過淺：1）鹽酸分化時間過長或蘇木素染液時間過長。需要縮短分化時間或延長堿化時間；每日加入少量新鮮蘇木素染液或重新配制蘇木素液。2）在固定之前制片干燥。所以對巴氏染色的制片需要嚴(yán)格遵守濕固定的原則。3）自來水的PH值偏酸性。使用堿性溶液。（2）細(xì)胞核著色過深：1）鹽酸溶液濃度不夠。適當(dāng)加入幾滴鹽酸以增加濃度。2）制片用高于95％以上濃度的酒精固定后可以出現(xiàn)染色過深。應(yīng)用95％酒精固定。2、細(xì)胞漿著色不佳（1）如果全片內(nèi)胞漿都淡染，則需要延長染色時間或更換新液。（2）如果胞漿不分色，均為淺紅色。制片在固定前干燥或制片被有大量球菌樣細(xì)菌影響胞漿染色。此情況可以適當(dāng)增加染色時間能夠部分糾正不分色狀況。（3）胞漿染成灰色或紫色，是由于蘇木素染色時間過長或鹽酸分化不佳。經(jīng)過褪色后重新蘇木素可以糾正。（4）由于標(biāo)本的不同，同樣配方的EA染液可造成偏藍(lán)、偏綠和偏紅，對不同的標(biāo)本應(yīng)該使用不同的E