DB50-T 1607-2024 水生動(dòng)物細(xì)菌性病原菌耐藥檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

ICS65.150CCSB52DB50IDB50/T1607—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站提出。本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所、西南大學(xué)、重慶市水產(chǎn)學(xué)會(huì)。本文件主要起草人：張利平、王波、陳波、李虹、梅會(huì)清、翟旭亮、廖雨華、周勇、朱成科、卓東渡、馮俊、薛明洋、薛洋、徐鳳、甘婷婷、吳曉清、周春龍、劉曉莉、何忠誼。1DB50/T1607—2024水生動(dòng)物細(xì)菌性病原菌耐藥檢測(cè)技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了水生動(dòng)物細(xì)菌性病原菌耐藥檢測(cè)的試劑、儀器設(shè)備、藥敏實(shí)驗(yàn)、結(jié)果判定、無(wú)害化處理和病原微實(shí)驗(yàn)室生物安全等技術(shù)要求。本文件適用于水生動(dòng)物細(xì)菌性病原耐藥檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SC/T7015病死水生動(dòng)物及病害水生動(dòng)物產(chǎn)品無(wú)害化處理規(guī)范SC/T7028水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌耐藥性調(diào)查規(guī)范通則SC/T7201.1魚類細(xì)菌性病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)WS233病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則WS/T639抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1最低抑菌濃度Minimalinhibitoryconcentration；MIC在藥物敏感性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中能抑制肉眼可見(jiàn)微生物生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度。3.2敏感Susceptible；S當(dāng)抗菌藥物對(duì)分離株的MIC處于敏感范圍時(shí)，使用推薦劑量進(jìn)行治療，該藥在感染部位通常達(dá)到的濃度可抑制被測(cè)菌的生長(zhǎng)，臨床治療可能有效。3.3耐藥Resistant；R當(dāng)抗菌藥物對(duì)分離株的MIC處于該分類范圍時(shí)，該藥物濃度不能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，和（或）被測(cè)菌株獲得特殊耐藥機(jī)制，臨床治療效果不佳。4試劑4.1實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用水、NaCl、腦心浸液肉湯、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基。試劑配制應(yīng)符合附錄A的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)定。2DB50/T1607-20244.2耗材96孔藥敏板、“V”型加樣槽(30o～45o)。5儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、生物安全柜、醫(yī)用冰箱、高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、麥?zhǔn)蠞岫葍x、移液器。6藥敏試驗(yàn)6.1單菌落制備6.1.1將已鑒定的病原菌在腦心浸液瓊脂平板（或者選用已知的適宜培養(yǎng)基）上進(jìn)行平板劃線，28℃±2℃培養(yǎng)16h～24h。6.1.2待測(cè)菌株應(yīng)為單菌落。單菌落的制備可參考SC/T7201.1中分離和純培養(yǎng)方法進(jìn)行。6.2菌懸液制備無(wú)菌棉簽挑取單個(gè)菌落于5mL無(wú)菌生理鹽水的比濁管中混勻，麥?zhǔn)蠞岫葍x測(cè)量，使其達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙?，?biāo)記為A管。菌懸液應(yīng)在15min內(nèi)使用。6.396孔藥敏板加樣6.3.1取1支10mL的無(wú)菌腦心浸液肉湯，以無(wú)菌操作方式向空白對(duì)照孔中分別加入100μL無(wú)菌腦心浸液肉湯。6.3.2另取一支10mL的無(wú)菌腦心浸液肉湯，從A管中吸取200μL菌懸液加入到其中，記為B管。6.3.3將B管中菌液混勻后倒入無(wú)菌“V”型槽內(nèi)。6.3.4利用移液器吸取“V”型槽內(nèi)的菌液，加入到所有微孔中（空白對(duì)照除外），每孔100μL?？瞻讓?duì)照孔最后加入100μL無(wú)菌生理鹽水。96孔藥敏板所用藥物及藥物濃度見(jiàn)附錄B。6.3.5將加樣后的96孔藥敏板放置于28℃±2℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h后讀取結(jié)果。6.4結(jié)果讀取若陰性對(duì)照孔底渾濁，或陽(yáng)性對(duì)照孔澄明，則此次試驗(yàn)無(wú)效，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若陰性對(duì)照孔底澄明，陽(yáng)性對(duì)照孔渾濁，則與陽(yáng)性對(duì)照孔比較，孔底內(nèi)液體渾濁則為陽(yáng)性（+）；孔底內(nèi)液體澄明，則為陰性（-）。微孔內(nèi)抑制肉眼可見(jiàn)微生物生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度為MIC。當(dāng)出現(xiàn)單一跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度。結(jié)果讀取參考附錄C96孔藥敏板結(jié)果參考圖。6.5質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)菌株宜為大腸埃希菌（ATCC25922）。標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏實(shí)驗(yàn)同步驟6.1～6.4規(guī)定方法進(jìn)行。7結(jié)果判定對(duì)照受試菌的MIC，依據(jù)SC/T7028中規(guī)定要求，將菌株判定為敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）。3DB50/T1607—20248無(wú)害化處理實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的器皿、耗材及產(chǎn)物均需要經(jīng)過(guò)121℃,15min高壓滅菌后，方可處置。9生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)人員必須穿著合適的實(shí)驗(yàn)服、佩戴好口罩、帽子及一次性手套。進(jìn)行活體處理或接觸含有微生物的物品后，要洗手。離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前要脫掉手套，一次性手套不得清洗和再次使用。如果發(fā)生污染性物質(zhì)溢出等事故，應(yīng)及時(shí)向?qū)嶒?yàn)室負(fù)責(zé)人報(bào)告，并記錄經(jīng)過(guò)和處理方案。禁止在實(shí)驗(yàn)室飲食、吸煙、化妝和儲(chǔ)存食物。非工作人員禁止進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。4DB50/T1607-2024試劑配制A.1滅菌生理鹽水A.1.1配方NaCl8.5g水1000mLA.1.2配制混勻，121℃高壓滅菌15min，備用。A.2腦心浸液（BHI）肉湯A.2.1配方腦心浸液肉湯培養(yǎng)基50.0g水1000mLA.2.2配制混勻，加熱使之完全溶解，用1mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH,使滅菌后為7.2～7.4。分裝燒瓶，121℃,高壓滅菌15min。4℃保存?zhèn)溆?。A.3腦心浸液（BHI）瓊脂平板A.3.1配方腦浸液瓊脂培養(yǎng)基24.5g水1000mLA.3.2配制混勻，加熱使之完全溶解，用1mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH,使滅菌后為7.2～7.4。分裝燒瓶，121℃,高壓滅菌15min，冷卻至50℃左右，制成平板。4℃保存?zhèn)溆谩?DB50/T1607—202496孔板藥敏板的制備B.1試劑和材料B.1.1抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶B.1.2溶劑與稀釋劑各藥物的溶劑與稀釋劑見(jiàn)表B.1。試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中三級(jí)水的要求表B.1抗菌藥物儲(chǔ)備液所用的溶劑和稀釋劑水水水水水水水水水水水注1：復(fù)方藥物，先單獨(dú)配置與儲(chǔ)存，做藥物敏感性試驗(yàn)時(shí)，再按B.1.3抗菌藥物稀釋取滅菌的BHI肉湯，在無(wú)菌96孔板的第1孔加入160μL。在第2孔至第10孔中分別加人100μL。在第1孔中加人抗菌藥儲(chǔ)備液40μL，吹打混勻;取第1孔中的含藥肉湯100μL至第2孔中吹打混勻；吸取第2孔中的100μL含藥肉湯至第3孔中吹打混勻，重復(fù)上述操作,將藥物進(jìn)行2倍梯度稀釋，當(dāng)?shù)?2孔稀釋完后吸出l00μL含藥肉湯棄去，使含有藥物的BHI肉湯每一孔均為l00μL。其中坐標(biāo)G11、G12、H11、H12，各加100μLBHI肉湯，作為陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔。藥敏板藥物及