藥物分析講稿-第十二章-甾體激素類藥物的分析

藥物分析講稿-第十二章甾體激素類藥物的分析第十二章甾體激素類藥物的分析桂林醫(yī)學院藥學-唐巖松第十二章甾體激素類藥物的分析第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與分類甾體激素類藥物是一類具有甾體結(jié)構(gòu)的激素類藥物，是臨床上一類較為重要的藥物。甾體激素類藥物種類較多，但基本骨架相同，均具有環(huán)戊烷并多氫菲的母核。其基本骨架及位次編號如下:甾體激素類藥物主要包括腎上腺皮質(zhì)激素和性激素兩大類，性激素又分為雌性激素、雄性激素和蛋白同化激素及孕激素等。一、甾體激素類藥物的類型及結(jié)構(gòu)特征大多數(shù)甾體激素類藥物是由雌性激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素及腎上腺皮質(zhì)激素的基本結(jié)構(gòu)衍生而來的。(一)雌性激素天然的雌性激素為雌二醇，結(jié)構(gòu)如下:對雌二醇進行結(jié)構(gòu)改造，得到一系列高效、長效的雌激素類藥物?！吨袊幍洹肥蛰d的雌激素類藥物有雌二醇(estradiol)、炔雌醇(ethinylestradiol)、炔雌醚(quinestrol)、戊酸雌二醇(estradiolvalemte)、苯甲酸雌二醇(estradiolbenzoate)等。雌激素類藥物的母核有18個碳原子，A環(huán)為苯環(huán)，C3位上有酚羥基，C17位上有β-羥基，有些藥物的C17-羥基形成了酯，有的藥物C17位上有乙炔基(如炔雌醇)。(二)雄性激素和蛋白同化激素天然的雄性激素為睪酮。結(jié)構(gòu)如下:雄性激素類藥物的母核有19個碳原子，蛋白同化激素在C10位上一般無角甲基，其母核只有18個碳原子。A環(huán)上有?4-3-酮基，形成共軛體系，具有紫外吸收;C17位有β-羥基或由它們形成的酯(如丙酸睪酮)?！吨袊幍洹肥蛰d的該類藥物有丙酸睪酮(testosteronepropionate)、甲睪酮(methyl-testosterone)、苯丙酸諾龍(rmndrolonephenylpropionate)等。第1頁共9頁第十二章甾體激素類藥物的分析桂林醫(yī)學院藥學-唐巖松(三)孕激素天然的孕激素為黃體酮，結(jié)構(gòu)如下:孕激素類藥物的母核有21個碳原子，A環(huán)有?4-3-酮基;C17位有甲酮基;有的藥物C17位有α-羥基或與酸形成的酯，還有的具有乙炔基。《中國藥典》收載的孕激素及口服避孕藥有黃體酮(progesterone)、炔諾酮(norethisterone)、炔諾孕酮(norgestrel)、醋酸氯地孕酮(chlonnadinonlacetate)和醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)等。(四)腎上腺皮質(zhì)激素天然的腎上腺皮質(zhì)激素(簡稱皮質(zhì)激素)為氫化可的松，基本結(jié)構(gòu)如下:第2頁共9頁第十二章甾體激素類藥物的分析桂林醫(yī)學院藥學-唐巖松腎上腺皮質(zhì)激素類藥物的母核有21個碳原子;A環(huán)上有?4-3-酮基，為共軛體系，具有紫外吸收;C17位上有α-醇酮基，具有還原性;有的藥物C17位上還有α-羥基;部分藥物C11位有羥基和酮基，C1、C2之間有雙鍵，6α或9α位有鹵素取代或有C16-α-羥基等。《中國藥典》收載的腎上腺皮質(zhì)激素類藥物有氫化可的松(hydrocorfisone)、醋酸潑尼松(prednisoneacetate)、醋酸地塞米松(dexamethasoneacetate)、醋酸氟輕松(fluocinonide)、地塞米松磷酸鈉(dexamethasonesodiumphosphate)、倍他米松(betamethasone)等。二、特征官能團與分析方法第二節(jié)鑒別試驗甾體激素類藥物的鑒別試驗，主要是根據(jù)甾體母核和各種官能團的特征反應進行。常用的鑒別方法有呈色反應、沉淀反應、制備衍生物測定熔點、水解產(chǎn)物的反應、紫外分光光度法、紅外分光光度法、薄層色譜法及高效液相色譜法等。一、呈色反應(一)與強酸的呈色反應許多甾體激素類藥物能與硫酸、鹽酸、高氯酸、磷酸等強酸反應呈色。其中以與硫酸的呈色反應應用-較為廣泛。此反應為甾酮和硫酸的反應，反應機理為酮基先質(zhì)子化，形成正碳離子，再與HS04作用呈色?！吨袊幍洹肥蛰d的某些甾體激素類藥物與硫酸的呈色反應和熒光現(xiàn)象以及加水稀釋后的變化情況見表12-1。甾體激素類藥物與硫酸的呈色反應，操作簡便，反應靈敏。不同的藥物可形成不同的顏色或熒光而能第3頁共9頁第十二章甾體激素類藥物的分析桂林醫(yī)學院藥學-唐巖松相互區(qū)別，目前為各國藥典所采用。(二)官能團的呈色反應不同的甾體激素類藥物具有不同的官能團，利用官能團的顯色反應可以區(qū)別不同的藥物。1、羰基的呈色反應本類藥物結(jié)構(gòu)中C3-酮基和C20-酮基能與某些羰基試劑如2，4-二硝基苯肼、硫酸苯肼、異煙肼等發(fā)生縮合反應，形成黃色的腙而用于鑒別。具有?4-3-酮結(jié)構(gòu)的甾體激素類藥物可立刻反應;具有?1，4-3-酮結(jié)構(gòu)的甾體激素類藥物反應需l,3min;具有C20-酮基的甾體激素類藥物反應需更長時間。2、C17-α-醇酮基的呈色反應腎上腺皮質(zhì)激素藥物分子結(jié)構(gòu)中C17位上有α-醇酮基，具有還原性。能與堿性酒石酸銅試液(斐林試劑)、氨制硝酸銀試液(多倫試劑)以及四氮唑鹽(即氯化三苯四氮唑)反應而呈色。四氮唑鹽具有氧化性，與C17-α-醇酮基反應后被還原為有色的甲而顯色。此顯色反應廣泛應用于皮質(zhì)激素的分析。3、甲酮基的呈色反應甾體激素類藥物分子結(jié)構(gòu)中含有甲酮基以及活潑亞甲基時，能與亞硝基鐵氰化鈉、間二硝基苯、芳香醛等反應呈色。其中與亞硝基鐵氰化鈉的反應是黃體酮的靈敏、專屬的鑒別方法。在一定條件下，黃體酮顯藍紫色，其他甾體激素類藥物均不顯藍紫色，而顯淡橙色或不顯色。4、酚羥基的呈色反應雌激素類藥物C3位為酚羥基時，可與重氮苯磺酸發(fā)生偶合反應，生成紅色偶氮染料。二、沉淀反應(一)與堿性酒石酸銅(斐林試劑)的沉淀反應腎上腺皮質(zhì)激素類藥物C17位上的α-醇酮基具有還原性，與斐林試劑能生成橙紅色的氧化亞銅沉淀。如醋酸潑尼松龍的鑒別方法為:取本品20mg，加甲醇lml，溫熱溶解后，加熱的堿性酒石酸銅試液lml反應，即生成橙紅色沉淀。(二)與氨制硝酸銀(多倫試劑)的沉淀反應腎上腺皮激素類藥物C17位上的α-醇酮基具有還原性，能與氨制硝酸銀反應生成黑色單質(zhì)銀的沉淀。如醋酸去氧皮質(zhì)酮的鑒別反應為:取本品5mg，加乙醇5ml溶解后，加氨制硝酸銀試液0.5ml，即生成黑色沉淀。(三)與硝酸銀的沉淀反應含有炔基的甾體激素類藥物，遇硝酸銀試液，即生成白色的炔銀鹽沉淀。如炔雌醇的鑒別方法為:取本品10mg，加乙醇lml溶解后，加硝酸銀試液5,6滴，即生成白色沉淀。第4頁共9頁第十二章甾體激素類藥物的分析桂林醫(yī)學院藥學-唐巖松六、紅外分光光度法甾體激素類藥物結(jié)構(gòu)復雜，有的藥物之間結(jié)構(gòu)僅有細小的差異，僅靠化學鑒別法難以區(qū)別。紅外光譜特征性強，為鑒別本類藥物提供了有效而可靠的手段。目前，各國藥典收載的甾體激素原料藥，幾乎都采用紅外分光光度法作為鑒別方法。《中國藥典》采用此法鑒別黃體酮、炔雌醇、炔諾酮、炔諾孕酮、苯丙(藥品紅外光譜集)一致。如炔酸諾龍和地塞米松等藥物。藥典規(guī)定供試品的紅外吸收圖譜應與對照的圖譜雌醇的紅外吸收光譜圖，見圖12-1。第三節(jié)特殊雜質(zhì)檢查甾體激素類藥物多由其他甾體化合物經(jīng)結(jié)構(gòu)改造而制得，因而在制備過程中可能會引入原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物以及溶劑和試劑等雜質(zhì)。在甾體激素類藥物的檢查項下，除一般雜質(zhì)的檢查外，還需檢查其特殊雜質(zhì)“有關(guān)物質(zhì)”的限量。此外，根據(jù)藥物在生產(chǎn)和貯存過程中可能引入的雜質(zhì)，有些甾體激素還規(guī)定有游離磷酸鹽、甲醇和丙酮、雌酮、硒、乙炔基等其他檢查項目。如地塞米松磷酸鈉檢查游離磷酸鹽、甲醇和丙酮;炔雌醇、炔諾孕酮檢查乙炔基;曲安奈德、醋酸地塞米松檢查硒;炔雌醇檢查雌酮等。一、有關(guān)物質(zhì)有關(guān)物質(zhì)是本類藥物中存在的具有甾體結(jié)構(gòu)的其他物質(zhì)，可能是合成的原料、中間體、副產(chǎn)物以及降解產(chǎn)物，是多數(shù)甾體激素類藥物中的主要特殊雜質(zhì)。各國藥典普遍采用薄層色譜法和高效液相色譜法檢查甾體激素類藥物中的有關(guān)物質(zhì)。(一)薄層色譜法《中國藥典》利用薄層色譜法檢查有關(guān)物質(zhì)。一般采用主成分自身對照法(高低濃度對照法)。即將供試品制成高、低二種濃度的溶液，高濃度溶液作為供試溶液，低濃度溶液作為對照溶液。利用供試溶液圖譜中雜質(zhì)斑點的數(shù)目和顏色與對照溶液圖譜的主斑點進行比較，通過雜質(zhì)斑點總數(shù)和各單一雜質(zhì)的量進行控制。舉例如下:例12-2醋酸潑尼松龍中有關(guān)物質(zhì)的檢查取本品，加三氯甲烷-甲醇(9:1)制成每lml中約含4mg的溶液，作為供試品溶液;精密量取3ml，置100ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(9:1)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385:60:15:2)為展開劑，展開，晾干，在105?干燥10min，放冷，噴以堿性四氮唑藍試液，立即檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點，與對照溶液的主斑點比較，不得更深。3ml，4mg/ml低濃度液體的含量,,0.12mg/ml100ml第5頁共9頁第十二章甾體激素類藥物的分析桂林醫(yī)學院藥學-唐巖松0.12低濃度液體相當于高濃度液體的3,(),，100%,3%4例如:鹽酸異丙嗪中有關(guān)物質(zhì)的檢查。有多個雜質(zhì)而且結(jié)構(gòu)不清。供試溶液10mg/ml，對照溶液(1)0.15mg/ml，(2)0.05mg/ml。要求:供試液雜質(zhì)斑點不多于3個;雜質(zhì)斑點與對照(2)的主斑點比較，不得更深;如有一點超過，應不深于對照液(2)的主斑點。例12-3醋酸氟輕松中有關(guān)物質(zhì)的檢查供試品溶液;精密量取lml，取本品，加三氯甲烷-甲醇(9:1)溶解并制成每lml中約含3mg的溶液，作為置50ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(9:1)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述ul，分別點于同一硅膠G薄層板上;以三氯甲烷-甲醇(97:3)為展開劑，展開，晾干，在105?兩種溶液各5干燥10min，放冷，噴以堿性四氮唑藍試液，立即檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點，不得多于2個，其顏色與對照溶液的主斑點比較，不得更深。1ml，3mg/ml低濃度液體的含量,,0.06mg/ml50ml0.06低濃度液體相當于高濃度液體的2,(),，100%,2%3(二)高效液相色譜法用高效液相色譜法檢查有關(guān)物質(zhì)，一般采用主成分自身對照法，即采用供試品溶液的稀釋液作為對照，以對照液主峰的面積作為參比，以控制藥物中雜質(zhì)的量。例12-4丙酸睪酮中有關(guān)物質(zhì)的檢查《中國藥典》收載的丙酸睪酮中有關(guān)物質(zhì)的檢查方法為:取本品，加甲醇分別制成每lml含lmg的供試品溶液與每lml含0.01mg的對照溶液。照含量測定項下的色譜條件，取對照溶液10ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高達記錄儀滿量程的20,。再精密量取供試品溶液與對照品溶液各10ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的2倍。供試品溶液如顯示雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1/2，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積。例12-5醋酸可的松中有關(guān)物質(zhì)的檢查醋酸可的松中有關(guān)物質(zhì)的檢查方法為:取本品，用乙腈制成每lml中約含lmg的溶液，作為供試品溶液;精密量取lml，置100ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照含量測定項下的色譜條件，取對照溶液20ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高達記錄儀的滿量程的50,。再精密量取供試品溶液與對照溶液各20ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2.5倍。供試品溶液如顯示雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1/2，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的1.5倍。二、游離磷酸鹽游離磷酸鹽是甾體激素類藥物在生產(chǎn)過程中，由磷酸酯化時殘存的過量磷酸鹽。采用鉬藍比色法檢查。本法是利用在酸性溶液中磷酸鹽與鉬酸銨作用，生成磷鉬酸銨，再經(jīng)還原形成磷鉬酸藍(鉬藍)在740nm波長處有最大吸收。例12-6地塞米松磷酸鈉中游離磷酸鹽的檢查《中國藥典》收載的地塞米松磷酸鈉中游離磷酸鹽的檢查方法為:精密稱取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml使溶解;另取標準磷酸鹽溶液4.0ml，置另一25ml量瓶中，加水11ml;各精密加鉬酸銨硫酸試液2(5ml與1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液lml，加水至刻度，搖勻，在20?放置30,50min。照分光光度法，在740nm波長處測定吸光度。供試品溶液的吸光度不得大于對照溶液的吸光度。三、甲醇和丙酮某些甾體激素類藥物在生產(chǎn)工藝中使用大量的甲醇與丙酮。甲醇對人體有害，因此藥典規(guī)定作甲醇與第6頁共9頁第十二章甾體激素類藥物的分析桂林醫(yī)學院藥學-唐巖松丙酮殘留量檢查?！吨袊幍洹凡捎脷庀嗌V法檢查，規(guī)定采用氣相色譜法測定時不得出現(xiàn)甲醇峰，該法測定甲醇時檢測限為3.1ng。丙酮則采用外標法測定，規(guī)定不得過5.0,(g/g)。五、雌酮以JP(13)收載的炔雌醇中的雌酮的檢查為例，檢查方法為:取本品5mg，溶于0.5ml乙醇，加間二硝基苯0.05g，再加新配制的稀氫氧化鉀-乙醇液0.5ml，在暗處放置1h后，再加乙醇10ml，溶液呈現(xiàn)的顏色不得比對照液(不加本品同樣方法制成)更深。第四節(jié)含量測定根據(jù)甾體激素類藥物的官能團和整個分子結(jié)構(gòu)特征，可采用比色法、紫外-可見分光光度法、熒光法、氣相色譜法和高效液相色譜法測定其含量。二、紫外-可見分光光度法(二)四氮唑比色法1、四氮唑的種類兩種:2，3，5-三苯基氯化四氮唑(縮寫為TTC)，其還原產(chǎn)物為不溶于水的深紅色三苯甲，λmax紅四氮唑(縮寫為RT)。藍四氮唑(縮寫B(tài)T)，其還原產(chǎn)物為暗藍色的雙甲，λmax在480~490nm，也稱在525nm左右。2、反應原理腎上腺皮質(zhì)激素C17-α-醇酮基具有還原性，在強堿性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲。生成的顏色隨所用試劑和條件的不同而定，多為紅色或藍色。3、測定方法USP(23)采用藍四氮唑;中國藥典(1995版)和BP(1993)采用紅四氮唑。4、影響因素四氮唑比色法廣泛用于腎上腺皮質(zhì)激素類藥物的含量測定，但測定時的各種因素如腎上腺皮質(zhì)激素的結(jié)構(gòu)、溶劑和水分、反應溫度和時間、堿的濃度、空氣中氧及光線等，對形成有色甲的反應速度、呈色強度、穩(wěn)定性都有影響。因此，應嚴格控制實驗條件，才能獲得滿意的結(jié)果。(1)取代基的影響一般認為，C11-酮基比C11-羥基的甾體激素類藥物反應速度快;C21-羥基酯化后比其未酯化的母體羥基的反應速度慢;當酯化的基團是三甲基醋酸酯、磷酸酯、琥珀酸酯時，反應速度更慢。(2)溶劑和水分的影響含水量大時會使呈色速度減慢，但含水量不超過5,時，對結(jié)果幾乎無影響。因此可采用95,的乙醇。為了減少整個反應液中水分的含量，則采用無水乙醇。另外，醛具有一定還原性，會使吸光度增高，故一般應采用無醛乙醇作溶劑。(3)溫度和時間的影響呈色反應速度隨溫度增高而加快，一般以室溫或30?恒溫條件下顯色，結(jié)果的重現(xiàn)性較好?！吨袊幍洹分胁捎玫姆磻獥l件是25?的暗處反應40min。(4)堿的種類及加入順序的影響在各類有機堿中，以氫氧化四甲基銨最為理想，能得到滿意結(jié)果，故最為常用。有人指出，當皮質(zhì)激素和氫氧化四甲基銨長時間(24h)接觸后，皮質(zhì)激素有部分分解。因此，以先加四氮唑鹽溶液再加堿液為好。用甲醇或乙醇將10,的氫氧化四甲基銨溶液稀釋后再用，反應完畢后溶液中堿的濃度約為0.01mol/L。(5)空氣中氧及光線的影響反應以及產(chǎn)物對光敏感，因此必須用避光容器并置于暗處顯色，同時在達到最大呈色時間后，立即測定吸光度。氯化三苯四氮唑形成的甲對空氣中氧敏感，氧能明顯影響顏色強度和穩(wěn)定性。因此，BP曾規(guī)定在加入試劑后要往容器中充氮氣。(6)干擾物影響有些還原性物質(zhì)如抗壞血酸、還原性糖、多元酚、硫醇等都能與四氮唑鹽反應而引起干擾，但在甾體激素原料藥及制劑的分析中不易遇到。而某些賦形劑如聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂對藍四氮唑(BT)的顯色反應有較顯著的干擾，山梨醇和角鯊烯也有干擾。因此，測定油膏、冷霜等制劑時應先分離后方能測定。(三)異煙肼比色法1、原理甾體激素類藥物C3-酮基及某些其他位置的酮基都能在酸性條件下與羰基試劑異煙肼縮合生成黃色異煙腙，在一定波長下具有最大吸收。因此，可用比色法測定甾體激素類藥物的含量。第7頁共9頁第十二章甾體激素類藥物的分析桂林醫(yī)學院藥學-唐巖松某些具有兩個酮基(C3-酮基和C20-酮基)的甾體激素類藥物可形成雙腙，如黃體酮、氫化可的松等。2、測定方法3、影響因素異煙肼比色法測定甾體激素類藥物的含量，可受到各種因素的影響，如溶劑、酸的種類和濃度、水分、溫度、光線和氧、反應的專屬性等方面的影響。在操作中應嚴格控制條件，才能獲得滿意結(jié)果。(1)溶劑的選擇只有用無水乙醇或無水甲醇作為溶劑才能得到滿意的結(jié)果。其他溶劑因受到異煙肼鹽酸鹽在其中溶解度小的限制而不能使用。試劑在無水甲醇中的穩(wěn)定性較好，呈色強度也比在乙醇中高，但由于甲醇對制劑輔料植物油的溶解度較無水乙醇小，故一般多選用乙醇。(2)酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度一般使用鹽酸。當鹽酸與異煙肼反應的摩爾比為2:1時可獲得最大的吸光度，即按上述操作中鹽酸濃度為0.0074mol/L(在1000ml醇中含0.625ml濃鹽酸)，異煙肼試液(0.5mg/m1)的濃度相當于0.00365mol/L。也可以使用0.0037mol/L的硫酸，若用醋酸則需將其濃度增大到25,(V/V)，約為4.4mol/L。(3)水分、溫度、光線和氧的影響當溶劑中含水量增加時，縮合產(chǎn)物異煙腙將發(fā)生水解，從而使吸光度降低。因為甾體激素與異煙肼縮合成腙的反應為可逆反應，水分可促使反應逆轉(zhuǎn)而水解。溫度升高，反應速度加快。當在具塞玻管中不致使溶劑揮發(fā)和吸收水分的情況下，光與氧不影響反應。(4)反應的專屬性具有?4-3-酮基的甾體激素類藥物在室溫放置不到lh，即可定量與異煙肼反應;其他甾酮化合物需在長時間放置或加熱后方可反應完全，如C20-酮化合物(黃體酮、可的松等)反應就較慢;C1