戚豫1遺傳病的實驗室檢查手段超級簡化版

戚豫1遺傳病的實驗室檢查手段超級簡化版2007,Illumina推出Solexa;ABI推出SOLid…均能在3天內(nèi)完成1人的全基因組測序2024/9/52遺傳病和基因的數(shù)量？遺傳病總數(shù)：14,861種(Online-MendelianInheritanceinMan,OMIM,by2015-3-21)人類基因總數(shù)：≥24,000個人類各種結(jié)構(gòu)和功能蛋白：100,000種89種表型和基因全清楚；4,381種表現(xiàn)找到致病突變——意味著可做直接的基因診斷的病種很少！已知序列：10,391個基因——可做間接診斷的很多！2024/9/53“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因為一切人體正常生理功能和病理狀態(tài)都是由基因決定的狹義：因基因突變而引發(fā)的疾病如何區(qū)分三個概念：

遺傳性疾病：與環(huán)境因素引起的疾病對立

先天性疾?。嚎梢允菄a(chǎn)期感染/藥物所致

家族性疾?。嚎赡茈S著成員的遷出而終止2024/9/54發(fā)病頻率——總計占我國出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每一項只占萬分之幾到千分之幾按系統(tǒng)分類排名前5位：神經(jīng)系統(tǒng)：智力低下、代謝障礙、癲癇心血管系統(tǒng)：先心病內(nèi)分泌系統(tǒng)：糖尿病、腎上腺皮質(zhì)增生生殖系統(tǒng)：不孕不育骨骼系統(tǒng)：多指/趾-并指/趾、軟骨發(fā)育不良2024/9/55先天性疾病的誘發(fā)因素遺傳原因后天環(huán)境所致，因素：物理：X-ray、微波、超聲波、熱化學：砷、鉛、汞（水俁?。┑葻o機物；橙劑、EB（溴乙啶）等有機物生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等圍產(chǎn)期因素誘變，但不肯定致病圍產(chǎn)期因素只侵犯到個別器官，但注意與嵌合遺傳（mosaic）區(qū)分2024/9/56如何檢出？高危人群環(huán)境暴露既往病史家族史感染史遷居情況……遺傳DNA/RNA

環(huán)境無論外來病原體還是本身異常，遺傳物質(zhì)的檢測都是有效手段2024/9/57實驗室檢測手段,分辨率,

和范圍染色體核型Karyotyping:109bp,2800倍鏡下可見熒光原位雜交FISH:107bp,一個基因的一部分多重探針連接擴增MLPA:105bp,幾十個基因比較基因組雜交CGHArray:105bp,幾個基因間接基因診斷:103~105bp,一個或數(shù)個基因直接基因診斷PCR-Sequencing:1bp,一個基因Affymatricchip:1bp,數(shù)千個基因,半個基因組Genome-Wide-Sequencing:1bp,全部萬個基因注：bp,basepair,堿基對2024/9/58從核型;FISH;arrayCGH;MLPA;

到CMA(chromosomalmicroarrayanalysis,染色體微陣列,分子核型)——細胞遺傳學與分子遺傳學相結(jié)合的方法臨床細胞遺傳學的歷史是伴隨著一系列識別染色體方法的技術(shù)進步發(fā)展臨床細胞遺傳學基本工作：核型分析國內(nèi)主要中期染色體核型，G顯帶在400條國外高分辨染色體核型，G顯帶在1500條條件：細胞培養(yǎng)，光鏡，核型分析系統(tǒng)軟件2024/9/591、染色體核型Karyotyping

——基于顯微鏡下濃聚的染色體形態(tài)檢查方法：

G帶、R帶、Q帶（550條，7組）高分辨染色體分帶（>1500條）

FISH（熒光原位雜交）：分裂間期染色體畸變種類：數(shù)目異常（整倍和非整倍）結(jié)構(gòu)異常:-;+;t;del;ins;inv;dup;invdup;fra(X)(q27.3):脆性X;der:衍生染色體;r(13):13號染色體呈環(huán)狀（暗示有缺失）;i(Xq):等臂Xq2024/9/5102、熒光原位雜交技術(shù)FISH(fluorescenceinsituhybridization,)可以結(jié)合，但不依賴于核型分析單色與多色FISH，如SKY-FISH(光譜式多色染色體)是鑒別基因組發(fā)生較大缺失或重復(fù)金標準不足：一次雜交識別的范圍有限——需要很好的臨床診斷或其他提示，花費大人力多，設(shè)備高級方法：探針標記，細胞或染色體的原位雜交條件：探針(cosmid)、DNA提取、PCR、真空干燥、圖像采集與分析2024/9/511FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析系統(tǒng)2024/9/5123、多重探針連接擴增MLPA(multiplexligation-dependentprobeamplification)

SchoutenJP第一次描述一種基于PCR反應(yīng)，通過毛細管電泳鑒定擴增產(chǎn)物是一種高分辨的，用于檢測基因組序列拷貝數(shù)變異的方法(NucleicAcidsRes.2002Jun15;30(12):e57)

2024/9/513

同時檢測40個基因組序列異常，幾乎每個染色體2個近端粒常有微缺失涉及不育、發(fā)育、智力，可一次查全僅需要20ng的DNA

能檢測單個外顯子exon的拷貝數(shù),

探針辨認短的基因組序列,部分變性的DNA,如石蠟包埋,甲醛固定的樣本均可使用相對定量40個mRNA,鑒定啟動子的甲基化狀態(tài),檢測已知的突變和SNPS

MLPA方法功能、特點

2024/9/514MLPA反應(yīng)過程2024/9/515MLPA結(jié)果判定相對峰域與對照相比減少35-50%判定缺失相對峰域與對照相比增加35-50%判定重復(fù)突變/多態(tài)性位于探針的連接點或與探針的連接點很近也可能導(dǎo)致相對峰域減少單一的外顯子缺失需要其他方法證實結(jié)果分析2例2024/9/5162024/9/5172024/9/518MLPA

需要條件PCR儀測序儀2024/9/5194、比較基因組雜交

(Comparativegenomichybridization,CGH)什么是CGH:1992年Kallioniemi創(chuàng)立的基于熒光標記和分子、細胞遺傳學技術(shù)鑒定基因組DNA的獲得、丟失和擴增，并且可以把這些遺傳變異定位在正常的中期染色體上的一種技術(shù)特點:在一個實驗中，用一張中期染色體涂片分析全基因組的大的DNA序列拷貝數(shù)的不平衡改變(獲得和丟失)，即因劑量的變化而不需要分裂的細胞缺點:與測序相比分辨率不高，擴增子約2Mb，檢出的缺失大小5～10Mb——但也是個優(yōu)點：容易辨識和解釋

1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CGH目前最通用的是美國安捷倫公司(Agilent)的平臺，已成為國際上遺傳病診斷、流產(chǎn)組織分析和種植前診斷PGD的第一線手段(first-line)2024/9/520MicroarrayBACs/PACsDNA探針固定在玻璃片上ArrayedbyroboticallyprintingDNAontoslidesAgilentscannerOldarray-CGH2024/9/521Patient2ThispatientpresentedtotheLaboratoryat12monthsofagewithinfantilespasmsanddevelopmentaldelay.Hisheadcircumferencewasbelowthe2ndcentileandweightwasbetweenthe10to25thcentile.Seizurescontinueddaily.Atareviewat32monthsbrachycephaly,lowanteriorhairline,hypertelorism,andalargeprotrudingtongueweresomeoftheadditionalfeaturesobserved.SubtelomericFISHrevealedadeletionofthedistal9qprobePAC112N13.Array-CGHshowedthepatienthasa1.5-1.8Mbdeletionofdistal9q.FurtherFISHevaluationestablishedthedeletionas1.7MbwithbreakpointsbetweentheBACclonesRP11-83N9andRP11-695L17.2024/9/52211qduplication

10qdeletionPatient5Malepatientwhopresentedat18yearsofagewithintellectualdisability,autismanddysmorphicfeatures.SubtelomereFISHshowedaunbalancedtranslocation,withanadditionalcopyofthe11qprobePAC770G7presentondistal10q.Thedistal10qprobePAC137E24Gwasnotpresent.2024/9/523Newarray-CGH?用不同的顏色熒光標記等量病人的測試和參照DNA加入HumanCot1DNA在Microarray上進行雜交

雜交后洗去未結(jié)合的和錯配的靶DNA高分辨掃描儀芯片2024/9/524雙色激光掃描紅色CY5綠色CY3F值產(chǎn)生

referenceDNApatient=2024/9/525真實掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2024/9/526Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列出部分）2024/9/527什么是基因診斷？狹義：針對致病基因的突變分析——是一種直接的診斷擴展：利用致病基因的多態(tài)性(polymorphism)；或利用相鄰的多態(tài)性標記(polymorphicmarkers)進行連鎖分析——是一種間接的診斷廣義：通過對疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，包括復(fù)制(DNA)、表達(RNA)和翻譯(蛋白質(zhì))加以全過程分析所做出的診斷2024/9/528基因診斷技術(shù)基礎(chǔ):PCR聚合酶鏈反應(yīng)

(polymerasechainreaction,PCR):1985年發(fā)明,1992諾貝爾獎試管在熱循環(huán)儀(PCR儀)中反應(yīng)幾小時，待測基因片段，專一地擴增上百萬倍PCR過程：加熱變性：分開模DNA雙鏈冷卻復(fù)性：使引物與目標序列特異結(jié)合保溫延長：使引物按模板序列延長2024/9/529PCR產(chǎn)物檢測PCR反應(yīng)場所以及2024/9/530不適合做PCR診斷的病種染色體病大片段基因缺失和重排所致的遺傳病：

解決辦法：細胞遺傳學，熒光原位雜交FISH、多重探針連接擴增MLPA、比較基因組雜交CGH、基因芯片Affymatricarray和大規(guī)模全基因組測序……基因巨大(Megabases)且無熱點突變的遺傳?。篘F1、DMD、BMD、ADPKDetc.

解決辦法：雜交、酶學、代謝產(chǎn)物、功能分析，截短蛋白分析法(ProteinTruncationTest,PTT)、色譜、串聯(lián)質(zhì)譜……2024/9/531哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需要查閱OMIM遺傳病數(shù)據(jù)庫()2024/9/532哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診斷適用范圍和必要性有器官組織差異性而不適合做組織活檢的遺傳病：longQT等心臟病、糖原累積癥I型(vonGierke型)、癲癇等腦病……診斷后可以治療或提前預(yù)防發(fā)病的遺傳?。喝鏟KU、肝豆狀核變性和G6PD缺乏癥……可以進行產(chǎn)前基因診斷的嚴重的先天代謝病，嚴重的精神疾患或惡性早期致死性疾病：如性別畸形和性發(fā)育異常而找不到染色體異常。可通過選擇性流產(chǎn)加以預(yù)防傳統(tǒng)方法不能診斷、診斷不確切的家族性疾病：多以常顯、X連鎖和母系方式遺傳?？勺鲞B鎖分析2024/9/533例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對氨基甙類如卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、新霉素以及鏈霉素等超級敏感條件致病——使用氨基甙類藥物母系遺傳——線粒體DNA上編碼12SrRNA的基因存在致病突變A1555G一旦發(fā)現(xiàn)，可對全家進行該突變的篩查發(fā)布用藥禁忌2024/9/534Ⅲ-1(先證者)Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-4

A>G:＋

＋

－

＋

－＋

＋

＋

＋＋線粒體mtDNA1555A>G基因診斷(＋：有突變)II-1Ⅱ-2Ⅱ-3Ⅱ-4氨基甙類耳毒家系的基因診斷示意圖I-1I-22024/9/535例2線粒體病的基因診斷mitochondrion線粒體是細胞的能量工廠…2024/9/536Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴重性：在我院兒科臨床診斷的35例中，死亡29例（83%）。目前生存僅僅6例。Leigh病是一種線粒體病，但僅僅有20%由mtDNA突變突變所致，80%由核基因突變所導(dǎo)致。基因檢查：mtDNA突變檢出率極低——229臨床診斷病例中僅僅檢出3例：T8993C2例和T8993G1例（死后尸解結(jié)果mtDNAMut%：血=85%;肌肉=94%;腦=98%；其母外周血=10%）2024/9/537病例1、臨床表現(xiàn)男，4月，主因精神發(fā)育倒退、驚厥入院第一胎，孕9月疑潛在性缺氧行剖宮產(chǎn)，生后無窒息；2月內(nèi)發(fā)育如常，后出現(xiàn)倒退，表現(xiàn)為頸部發(fā)軟、四肢活動差、吸吮能力減弱、低熱、陣發(fā)性呼吸暫停（2~8次/日）檢查：間斷抽搐，四肢肌力、肌張力低下，病理征(-)。血乳酸高、代謝性酸中毒。EEG示左側(cè)為主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。MRI示缺血改變：雙側(cè)殼核、丘腦區(qū)異常信號；腦白質(zhì)發(fā)育落后。兩次眼底檢查未見異常呼吸節(jié)律不整，死前突然出現(xiàn)嘆氣樣呼吸…父31歲、母30歲，均無遺傳病家族史2024/9/5382024/9/5392024/9/540方法PCR擴增mtDNA8791-9413片段(622bp)分別用限制性內(nèi)切酶MspI和SmaI酶解PCR產(chǎn)物2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶解片段對EB染色的片段進行密度掃描，突變比例（Mut%）=突變新增片段密度/原有片段殘留密度+突變新增片段密度結(jié)果患兒體內(nèi)存在高比例的8993T>G突變患兒1親屬中母親含較低比例的同樣突變患兒1肌和腦組織病理檢查符合嬰兒型Leigh綜合征診斷患兒1MRI示腦缺氧性改變M

患兒肌肉患兒血母親陰性對2024/9/541患者L1以第1對引物擴增后PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果T8993GT8993C患者L2以第1對引物擴增后PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果2024/9/542患者CT和死后尸解2024/9/543病理改變：灰質(zhì)為主的海綿樣改變，神經(jīng)細胞壞死和毛細血管增生。陳舊病變出現(xiàn)膠質(zhì)細胞增生，新鮮病變存在格子細胞。腦干黑質(zhì)、舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核和前庭神經(jīng)核在不同病人均受累。其他部位病變可以僅限于腦干，也可以同時累及脊髓灰質(zhì)、基底節(jié)、大腦和小腦皮層以及白質(zhì)。2024/9/544“間接法”基因診斷——連鎖分析

例：苯酮尿癥(PKU)的診斷致病基因：苯丙氨酸羥化酶PAH方法：細菌抑制實驗(篩查)

苯丙酮酸和PAH定量基因診斷困難

70多種突變基因大，突變很分散檢測突變成本高，周期長直接檢測突變或連鎖分析?2024/9/545連鎖分析方法產(chǎn)前診斷PKU

——選擇幾對染色體標記(marker)

←A

←B

連鎖分析示意圖需要多態(tài)性標記（與PAH基因在染色體上的距離越近越好）對先證者(BB)及家系成員(父-AB;母-BC;胎兒-AC)的標記進行分型(genotyping)胎兒-AC：不受累！連鎖診斷準確度：marker與致病基因的連鎖程度——有1%的交換率，理論可信度為99%←C

2024/9/546產(chǎn)前基因診斷對象：胎兒的DNA、代謝產(chǎn)物或酶蛋白取材：絨毛(8周)、羊水(16周)、胎兒靜脈血手段：針對代謝產(chǎn)物：HPLC、GC-MS(有組織特異性)

酶活性：特異性人工底物顯色(有組織特異性)

針對基因：RFLP、PCR等(無組織特異性)要求：雙取樣、雙方法、有資質(zhì)、有質(zhì)控準入：目前北京7家，專家委員會審核和年審管理:《北京市產(chǎn)前診斷與產(chǎn)前篩查工作規(guī)范》《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》2024/9/547體細胞嵌合的遺傳病（生殖細胞嵌合異常比例過低也不行）組織器官異質(zhì)性過大（線粒體?。﹪曳珊托袠I(yè)規(guī)定不允許的范圍，如“天才基因”兒的選擇（遺傳不平衡）性別鑒定（除非性連鎖疾?。┏蕯?shù)量遺傳的多基因病或遺傳相關(guān)的復(fù)雜遺傳病以及沒有做好準備的家庭……哪些病不適合產(chǎn)前基因診斷2024/9/548

非侵入性產(chǎn)前檢查NIPT——血漿游離DNA突變檢測技術(shù)

TTTTCTTTTCc.2383C>Tc.2383C>Tc.4005delGc.4005delGG2671**2024/9/549母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetalcf-DNAdetectedviaYchromosome,Lancet1997胎兒游離DNA：cell-freefetalDNA(cffDNA)母體外周血含有cffDNA，幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)細胞。懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩(wěn)定存在。（7周建立胎兒胎盤循環(huán)）。cffDNA片段比較小，長度在75bp和250bp之間。母體外周血中的cffDNA含量在5%到30%之間。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。與母親體重有關(guān)。產(chǎn)后2hr之內(nèi)消失。2024/9/55022條常染色體23條常染色體20%胚胎

DNA380%2胎兒80%母親染色體非整倍體導(dǎo)致劑量變化2024/9/551技術(shù)和科學的目標

thatgovernmentofthepeople,bythepeople,forthepeople,shallnotperishfromtheearth.————byAbrahamLincoln2024/9/552基因診斷的制高點——多基因病：

能否靠基因芯片或微陣列解決？Randomarrayofclusters100um2024/9/553劃時代的新技術(shù)——大規(guī)模二代測序NGS(NextGenerationSequencing)

人類基因組計劃長達10年、耗資千億、6國數(shù)萬科學家投入，僅完成4個人的基因

2007年：1人，3天內(nèi)，3000美元，費用和時間在以每年遞減一半的速度下降——取代所有一切，40種常見病發(fā)表。。。多基因病時代來了？SOLEXA_illumina1GGenomeAnalyzer2024/9/554InstrumentwithoutCoversFluidics&electronicsFlowcell&detectionLaseroptics2024/9/555FlowcellinImagingLocation2024/9/556基因診斷和產(chǎn)前基因診斷中的知情同意和倫理學問題實驗室有認證、國家標準和質(zhì)量控制實驗人員有許可證有標準實驗流程MOPS、質(zhì)控/質(zhì)評簽發(fā)臨檢報告要慎重、留余地可靠性和及時性兼?zhèn)?024/9/557樣品的采集與保存對象

保存環(huán)境

保存期限白細胞/皮膚細胞*低溫≤?20C°1年EBV轉(zhuǎn)化淋巴細胞系*凍存液氮無限組織冰凍?80C°3年毛發(fā)(帶毛囊)低溫≤?20C°1年口腔脫落細胞低溫≤?20C°1年DNA高鹽冷藏4C°10年RNA全血(抗凍劑)低溫?20/?80C°1年/3年蛋白粗提物低溫≤?70C°半年*白細胞可經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化建立永生細胞株，皮膚成纖維細胞可培養(yǎng)永久保存無限擴增2024/9/558還有很重要的，樣本庫完整有用的樣本一定要有專業(yè)的數(shù)據(jù)庫：臨床和背景資料齊全有編號、易檢索（條形碼管理）納入合適的樣本庫保存條件合格無降解無污染數(shù)據(jù)庫要素：病人一般資料臨床特點家族資料樣品管理家系調(diào)查網(wǎng)絡(luò)組2024/9/559構(gòu)成小型樣本庫的硬件和軟件每臺立式冰箱：16～20個耐酸鋁架;20個蠟紙or塑料盒/架;9×9凍存管/盒=25920～32400管標本(3.5ml)條形碼打印機耐低溫標簽掃碼槍2024/9/560大型標本庫的構(gòu)成與核心區(qū)域規(guī)劃：緩沖區(qū)核心：庫區(qū)監(jiān)控室樣本接收區(qū)樣本處理區(qū)輔助功能區(qū)：用品庫、辦公室、更衣室2024/9/561是多功能的大型實驗室：研究教學臨床基因診斷標本庫實驗中心大樓位于北大醫(yī)院門診南側(cè),7層,面積7000m2CentrallaboratoryResearchTeachingClinicalgeneticdiagnosisBioBank簡介