時間分辨乙肝應(yīng)用

時間分辨乙肝應(yīng)用放射免疫分析技術(shù)radioimmunoassayRIA靈敏度高:達到ng甚至pg水平特異性強重復性高標本用量少極大地推動了臨床和科研進步標記原理為以后得檢測技術(shù)得發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。同位素高度靈敏＋免疫反應(yīng)特異性缺點125I得半衰期短而導致其試劑有效期短。標記物125I得穩(wěn)定性差,導致試劑盒批間、批內(nèi)得變異較大;標準曲線有效期短,必須每次定標,造成浪費。操作繁瑣,出報告時間長。無法保存?zhèn)溆?。放射?125I),對環(huán)境得污染及對身體得危害,已經(jīng)為重視環(huán)保得國家逐步取消。(如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室)酶免疫分析法

enzyneimmunoassayEIA避免了對環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。操作簡單,不需要特殊設(shè)備,容易推廣。曾經(jīng)一度被認為就是取代放免得檢測手段。酶得高效催化＋免疫反應(yīng)特異性缺點對底物得顯色遵循比爾定律,標準曲線得直線范圍窄靈敏度、重復性不及放免,易造成漏檢和假陽性。因酶得純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響,導致穩(wěn)定性不好?；瘜W發(fā)光免疫分析法(CLIA)

chemiluminescenimmunoassay單個樣本檢測速度快,適合做急診。靈敏度較高。自動化程度高。光反應(yīng)得高度靈敏＋免疫反應(yīng)特異缺點發(fā)光過程短,樣品不能重復檢測。本底較高,易受環(huán)境物質(zhì)干擾。試劑穩(wěn)定性較差,需多次定標。檢測精度不高,在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑;試劑價格高。電化學發(fā)光免疫分析(ECL)

electrochemiluminescence80年代末期問世得新型化學發(fā)光免疫分析方法。電化學＋免疫反應(yīng)電化學發(fā)光底物-三聯(lián)吡啶釕N羥基琥珀酰胺(NHS)酯電極表面得電化學發(fā)光反應(yīng)本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬?？梢宰骷痹\非開放性試劑系統(tǒng)。試劑價格過高。免疫熒光測定技術(shù)(IFA)Immunofluorescenceassay熒光物質(zhì)＋免疫反應(yīng)細胞免疫、微生物、自身免疫等敏感度不高本底高大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜時間分辨熒光免疫分析技(TRFIA)

Time-ResoledFluoroimmunoassay鑭系元素標記技術(shù)＋免疫反應(yīng)一、基本原理固相Ab受檢抗原Eu標記抗體ExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitation二、TRFIA得主要特點(一)靈敏度高、特異性強酶聯(lián)免疫 (精度:10-9mol/L)放射免疫 (精度:10-12mol/L)化學發(fā)光 (精度:10-15mol/L)電化學發(fā)光 (精度:10-17mol/L)時間分辨熒光(精度:10-18mol/L)生物芯片試劑 DELFIAImmuliteACS-180AFP 0、1-1000IU/ml0、2-300IU/ml1、0-1000IU/mCEA0、1-500ng/ml 0、2-500ng/ml0、5-100ng/mlHCG 0、5-10000U/L5-5000U/L2-1000U/L TSH 0、005-100μU/ml0、002-75μU/ml0、03-150μU/mlFSH 0、05-256mU/ml0、1-170mU/m0、3-200mU/ml Prog 0、08-120nmol/L無0、1-40ng/mlProlactin0、04-250ng/ml0、5-150ng/ml0、3-200ng/ml 以上數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己得產(chǎn)品說明書標記物具有獨特熒光特性得稀土金屬---鑭系元素鑭系元素:15種Eu、Tb、Sm、Nd、DyEu螯合物激發(fā)光熒光Eu螯合物熒光得特點高強度長壽命Eu螯合物714000ns1Eu螯合物得熒光衰變時間很長,極大地降低了檢測背景。200800400600熒光強度激發(fā)短壽命熒光白蛋白4.1ns球蛋白3.0nsFITC4.5ns測量時間新循環(huán)1000次循環(huán)/s2stokes位移大,激發(fā)光譜與發(fā)射光譜無重疊,很容易排除散射光對發(fā)射光譜得影響、stokes位移:最大激發(fā)波長至最大發(fā)射波長之間得距離激發(fā)光發(fā)射光Eu螯合物熒光光譜300600400500波長nm熒光強度273nm異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300600400500波長nm熒光強度發(fā)射光激發(fā)光50nmEu螯合物熒光光譜300600400500波長nm熒光強度異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300600400500波長nm熒光強度3激發(fā)光譜帶較寬、可增加激發(fā)能,提高靈敏度4發(fā)射光譜很窄,50%得發(fā)射光譜寬度∠10nm,利用615±5范圍得濾光片,只允許此波段內(nèi)發(fā)射光通過并被檢測,排除其她波長得熒光,一方面降低了背景,另一方面使能量消耗減少,提高提高檢測靈敏度。異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300600400500波長nm熒光強度Eu螯合物熒光光譜300600400500波長nm熒光強度5Eu螯合物有相對高得比活性比活性:單位時間內(nèi),每個標記分子得可探測事件得數(shù)目熒光物質(zhì)相對比活性很高原因:在測定時,熒光物質(zhì)可反復被激活。基態(tài)激發(fā)態(tài)激發(fā)光躍遷發(fā)射熒光常用標記物得相對比活性125I標記物1個可探測事件/s/7、5*106分子化學發(fā)光標記物1個可探測事件/s/標記分子熒光標記物很多個可探測事件/s/標記分子(二)線性范圍寬標準曲線穩(wěn)定,試劑保質(zhì)期長0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6時間分辨熒光免疫檢測得標準曲線相當穩(wěn)定,同一批次得試劑盒可用兩點法加批次得參考曲線定標(三)重復性好同一標本連續(xù)20次檢測,CV值∠2％。同一批(10個)標本連續(xù)3天檢測,其CV值=2、9%。檢測后反應(yīng)板連續(xù)3天重復閱讀,CV∠1％TRFIA檢測HBsAg得重復性6003007002001000-50100時間延遲(微秒)強度發(fā)射光波長(納米)500利用不同波長和不同時間檢測,在同一孔中可測量多個鑭系元素得量(四)同一標本孔同時檢測多個項目技術(shù)特點檢驗先進性時間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零本底、高特異性解離-增強熒光性大大提高穩(wěn)定得熒光螯合物線性范圍更寬重復性更好原子標記標記位點多,可達20個對標記物結(jié)構(gòu)及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性,高精確度試劑保質(zhì)期至少一年標準曲線保留時間長同一批次只需兩點定標多標記單,雙,三,四標記同一試劑盒可同時測多個項目三、應(yīng)用內(nèi)分泌科檢查甲狀腺系列:TSH,UltraTSH,T3,T4,FT3,FT4,TBG,TG糖尿病系列:Insulin,C-Peptie生長激素類:hGH其她: Cortisol婦產(chǎn)科檢查FSH,LH,HCG,ProlactinE2,E3,Testo,Prog,SHBG腫瘤科檢查AFPCEAPSAhTG,β-2MicroNSEPAPPSA(Free/Total)PSAEQMCA-50CA-125CA-199CA-153*CA-724*CY-211*遺傳科檢查產(chǎn)前篩查:hAFP/

HCG,PAPPA新生兒篩查:Neo-TSH,Neo-T4,Neo-IRT,Neo-17a-OHProg,PKU核酸探針及基因雜交檢測,多標記定量PCR檢測。肝炎系列甲肝,乙肝,丙肝血液科檢測貧血檢查: Ferritin,VitB12,Folicacid白血病: 免疫細胞分型等細胞學檢查細胞毒試驗等多種檢測項目,細胞質(zhì)及組織化學分析等多種檢測項目酶類檢測及細胞受體檢測(包括MHC,HLA等多種檢測)科研工具單標記檢測,雙標記檢測,三標記檢測,四標記檢測時間分辨熒光免疫測定技術(shù)在病毒性肝炎診斷和療效監(jiān)測中得應(yīng)用病毒性肝炎得種類HepatitisAVirusHepatitisBVirusHepatitisCVirusHepatitisDVirusHepatitisEVirusHepatitisGVirusTTVHepatitisGvirus(HGV)

Science、1996Jan26;271(5248):505-8、

AnRNAvirus,hepatitisGvirus(HGV),fromtheplasmaofapatientwithchronichepatitis、entiregenome(9392nucleotides)encodingapolyproteinof2873aminoacids、HGVwasassociatedwithacuteandchronichepatitis、Thevirusistransfusion-transmissible、Ithasaglobaldistributionpresentwithinthevolunteerblooddonorpopulation、9699000102039798HGVandGBV-Cweretwoisolatesofthesamevirus、TheHGV/GBV-CgenomesequenceandorganizationarecloselyrelatedtohepatitisCvirus、infectionismonandfrequentlypersistsinhumans,infectionhasnotbeenfoundtobeassociatedwithanyknowndiseasestate、(acuteorchronichepatitis)growinlymphocytes,notinhepatocytes,

Recentstudiessuggest:GBV-CinfectioninHIV-positivepeopleisassociatedwithprolongedsurvival、coinfectionofhumanlymphocyteswithGBV-CandHIVleadtodecreasedHIVreplication、HGVmayprovidenovelapproachesfortreatingHIVandAIDS、TTvirus(TTV)foundin1997fromahepatitispatientwithoutvirusmarkers、However,therealimpactofTTVonliverdiseasesremainsuncertaintodate、DuetothelackofsuitablecellsystemstosupportthegrowthofTTV,thebiologyofTTVisstillobscure、HBsAgHBcAgHBVDNAPolymerase一、HBV得主要生物學性狀HBV感染病毒在體內(nèi)大量復制免疫反應(yīng)病毒核酸進入血液釋放病毒蛋白(Ag)分子生物學方法刺激機體產(chǎn)生抗體核酸定性或定量血清學方法病毒抗原或抗體臨床診斷和療效觀察二、HBV感染診斷得主要實驗室指標血清免疫學檢測得臨床意義1HBV感染診斷得主要指標2判斷機體對HBV得免疫狀況主要指標3判斷病程得主要指標AcuteHepatitisBDNA4-12周1-2周2周－3月3－6月潛伏期急性早期潛伏后期急性期康復期痊愈標志物相對濃度有傳染性可能有傳染性有免疫力血清學轉(zhuǎn)換期HBsAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBcIgMAnti-HBeAnti-HBsChronicHBVInfection潛伏期(4-12周)急性感染(6個月)慢性感染HBsAgAnti-HBcAnti-HBcIgMHBeAgAnti-HBeDNA3HBV血清學標志物與HBVDNA得關(guān)系血清學標志物:

反映機體對病毒得免疫狀況,病程,判斷病情。不能完全反映病毒在體內(nèi)復制狀況。HBVDNA

反映病毒在體內(nèi)復制水平,觀察藥物療效,部分“小三陽”及低水平病毒復制時出現(xiàn)陰性。不能反映機體得免疫狀況和病情三、時間分辨熒光檢測HBsAg與其她方法得比較TRFIA與ElecsysSystems2010檢測HBsAg定性結(jié)果比較TRFIA陽性陰性合計陽性60060陰性04040總數(shù)6040100ElecsysSystems2010靈敏度＝〔40／(0＋40)〕×100％＝100％靈敏性＝〔60／(0＋60)〕×100％＝100％兩者符合率100％與EIA檢測HBsAg定性結(jié)果比較TRFIAEIA陽性陰性合計陽性59160陰性04040總數(shù)5941100與ElecsysSystems2010檢測HBsAg定量結(jié)果比較ElecsysSystems2010檢測HBsAg(COI)與TRFIA檢測HBsAg(ng/L)得相關(guān)性＝0、987TRFIA在乙肝“兩對半”定量檢測應(yīng)用一、

極大地提高了檢測得靈敏度TRFIA檢測HbsAg靈敏度可達0、2ng/ml,而酶標(ELISA)檢測HbsAg靈敏度就是2ng/ml,也就就是說只有血清中得HbsAg達到2ng/ml酶標才會呈陽性。1、縮短急性乙肝HBsAg檢測“窗口期”2、如病毒發(fā)生變異后,表達量較低,常規(guī)ELISA測不出抗原,而TRFIA定量具有極高得靈敏度,可發(fā)現(xiàn)并極有可能同時檢測出HbsAg和抗-Hbs。3可發(fā)現(xiàn)低濃度HbsAg攜帶者。特別就是一些群體如醫(yī)護工作者、病人家屬等,由于長期密切接觸,但又非直接經(jīng)血傳播感染成急性乙肝,而就是長期少量感染,并刺激機體產(chǎn)生一定得免疫力,可能呈低濃度感染,特別應(yīng)當引起人們得足夠重視,密切關(guān)注并采取措施防止發(fā)展成乙肝或慢性攜帶者。二、

動態(tài)觀察療效和病情監(jiān)測。疾病得發(fā)生、發(fā)展、療效、預后就是一個動態(tài)得變化得過程,TRFIA定量檢測乙肝“兩對半”各項標志物得濃度變化可對乙肝得病程、治療、預后起一個全程動態(tài)檢測得作用,能夠為醫(yī)生對病情療效作出合理得解釋提供依據(jù),指導治療。1、定量分析HbsAg和抗-Hbs得濃度變化,可以預見急性乙肝就是否處于恢復期。如HbsAg濃度降低,抗-Hbs得濃度逐漸升高,可說明病情正往恢復期發(fā)展。反之,HbsAg濃度處于較高水平或上升趨勢,而抗-Hbs一直處于較底水平,則容易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者。2、定量分析HbeAg和抗-Hbe得濃度變化,可以反映病情變化和治療效果。明確檢測HbeAg向抗-Hbe轉(zhuǎn)換得時期,即表現(xiàn)為HbeAg濃度下降和抗-Hbe濃度升高得過程。高濃度得HbeAg還可間接提示病毒處于高復制狀態(tài),具有較高得傳染性。高濃度得抗-Hbe一方面提示病情得好轉(zhuǎn),而在某些時候(如肝功能指標很差)可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。3、抗-Hbc濃度得高低可以反映病毒感染得狀態(tài)。乙肝急性感染常常呈現(xiàn)高濃度得抗-Hbc,恢復期濃度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持續(xù)高濃度。低濃