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文檔簡介
時(shí)間分辨乙肝應(yīng)用放射免疫分析技術(shù)radioimmunoassayRIA靈敏度高:達(dá)到ng甚至pg水平特異性強(qiáng)重復(fù)性高標(biāo)本用量少極大地推動(dòng)了臨床和科研進(jìn)步標(biāo)記原理為以后得檢測技術(shù)得發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。同位素高度靈敏+免疫反應(yīng)特異性缺點(diǎn)125I得半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。標(biāo)記物125I得穩(wěn)定性差,導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)得變異較大;標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短,必須每次定標(biāo),造成浪費(fèi)。操作繁瑣,出報(bào)告時(shí)間長。無法保存?zhèn)溆?。放射?125I),對(duì)環(huán)境得污染及對(duì)身體得危害,已經(jīng)為重視環(huán)保得國家逐步取消。(如整個(gè)歐洲僅尚存幾個(gè)放免試驗(yàn)室)酶免疫分析法
enzyneimmunoassayEIA避免了對(duì)環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。操作簡單,不需要特殊設(shè)備,容易推廣。曾經(jīng)一度被認(rèn)為就是取代放免得檢測手段。酶得高效催化+免疫反應(yīng)特異性缺點(diǎn)對(duì)底物得顯色遵循比爾定律,標(biāo)準(zhǔn)曲線得直線范圍窄靈敏度、重復(fù)性不及放免,易造成漏檢和假陽性。因酶得純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響,導(dǎo)致穩(wěn)定性不好?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)
chemiluminescenimmunoassay單個(gè)樣本檢測速度快,適合做急診。靈敏度較高。自動(dòng)化程度高。光反應(yīng)得高度靈敏+免疫反應(yīng)特異缺點(diǎn)發(fā)光過程短,樣品不能重復(fù)檢測。本底較高,易受環(huán)境物質(zhì)干擾。試劑穩(wěn)定性較差,需多次定標(biāo)。檢測精度不高,在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑;試劑價(jià)格高。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECL)
electrochemiluminescence80年代末期問世得新型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。電化學(xué)+免疫反應(yīng)電化學(xué)發(fā)光底物-三聯(lián)吡啶釕N羥基琥珀酰胺(NHS)酯電極表面得電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬??梢宰骷痹\非開放性試劑系統(tǒng)。試劑價(jià)格過高。免疫熒光測定技術(shù)(IFA)Immunofluorescenceassay熒光物質(zhì)+免疫反應(yīng)細(xì)胞免疫、微生物、自身免疫等敏感度不高本底高大家學(xué)習(xí)辛苦了,還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜時(shí)間分辨熒光免疫分析技(TRFIA)
Time-ResoledFluoroimmunoassay鑭系元素標(biāo)記技術(shù)+免疫反應(yīng)一、基本原理固相Ab受檢抗原Eu標(biāo)記抗體ExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitation二、TRFIA得主要特點(diǎn)(一)靈敏度高、特異性強(qiáng)酶聯(lián)免疫 (精度:10-9mol/L)放射免疫 (精度:10-12mol/L)化學(xué)發(fā)光 (精度:10-15mol/L)電化學(xué)發(fā)光 (精度:10-17mol/L)時(shí)間分辨熒光(精度:10-18mol/L)生物芯片試劑 DELFIAImmuliteACS-180AFP 0、1-1000IU/ml0、2-300IU/ml1、0-1000IU/mCEA0、1-500ng/ml 0、2-500ng/ml0、5-100ng/mlHCG 0、5-10000U/L5-5000U/L2-1000U/L TSH 0、005-100μU/ml0、002-75μU/ml0、03-150μU/mlFSH 0、05-256mU/ml0、1-170mU/m0、3-200mU/ml Prog 0、08-120nmol/L無0、1-40ng/mlProlactin0、04-250ng/ml0、5-150ng/ml0、3-200ng/ml 以上數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己得產(chǎn)品說明書標(biāo)記物具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘孟⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素:15種Eu、Tb、Sm、Nd、DyEu螯合物激發(fā)光熒光Eu螯合物熒光得特點(diǎn)高強(qiáng)度長壽命Eu螯合物714000ns1Eu螯合物得熒光衰變時(shí)間很長,極大地降低了檢測背景。200800400600熒光強(qiáng)度激發(fā)短壽命熒光白蛋白4.1ns球蛋白3.0nsFITC4.5ns測量時(shí)間新循環(huán)1000次循環(huán)/s2stokes位移大,激發(fā)光譜與發(fā)射光譜無重疊,很容易排除散射光對(duì)發(fā)射光譜得影響、stokes位移:最大激發(fā)波長至最大發(fā)射波長之間得距離激發(fā)光發(fā)射光Eu螯合物熒光光譜300600400500波長nm熒光強(qiáng)度273nm異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300600400500波長nm熒光強(qiáng)度發(fā)射光激發(fā)光50nmEu螯合物熒光光譜300600400500波長nm熒光強(qiáng)度異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300600400500波長nm熒光強(qiáng)度3激發(fā)光譜帶較寬、可增加激發(fā)能,提高靈敏度4發(fā)射光譜很窄,50%得發(fā)射光譜寬度∠10nm,利用615±5范圍得濾光片,只允許此波段內(nèi)發(fā)射光通過并被檢測,排除其她波長得熒光,一方面降低了背景,另一方面使能量消耗減少,提高提高檢測靈敏度。異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300600400500波長nm熒光強(qiáng)度Eu螯合物熒光光譜300600400500波長nm熒光強(qiáng)度5Eu螯合物有相對(duì)高得比活性比活性:單位時(shí)間內(nèi),每個(gè)標(biāo)記分子得可探測事件得數(shù)目熒光物質(zhì)相對(duì)比活性很高原因:在測定時(shí),熒光物質(zhì)可反復(fù)被激活?;鶓B(tài)激發(fā)態(tài)激發(fā)光躍遷發(fā)射熒光常用標(biāo)記物得相對(duì)比活性125I標(biāo)記物1個(gè)可探測事件/s/7、5*106分子化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物1個(gè)可探測事件/s/標(biāo)記分子熒光標(biāo)記物很多個(gè)可探測事件/s/標(biāo)記分子(二)線性范圍寬標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定,試劑保質(zhì)期長0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6時(shí)間分辨熒光免疫檢測得標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)穩(wěn)定,同一批次得試劑盒可用兩點(diǎn)法加批次得參考曲線定標(biāo)(三)重復(fù)性好同一標(biāo)本連續(xù)20次檢測,CV值∠2%。同一批(10個(gè))標(biāo)本連續(xù)3天檢測,其CV值=2、9%。檢測后反應(yīng)板連續(xù)3天重復(fù)閱讀,CV∠1%TRFIA檢測HBsAg得重復(fù)性6003007002001000-50100時(shí)間延遲(微秒)強(qiáng)度發(fā)射光波長(納米)500利用不同波長和不同時(shí)間檢測,在同一孔中可測量多個(gè)鑭系元素得量(四)同一標(biāo)本孔同時(shí)檢測多個(gè)項(xiàng)目技術(shù)特點(diǎn)檢驗(yàn)先進(jìn)性時(shí)間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零本底、高特異性解離-增強(qiáng)熒光性大大提高穩(wěn)定得熒光螯合物線性范圍更寬重復(fù)性更好原子標(biāo)記標(biāo)記位點(diǎn)多,可達(dá)20個(gè)對(duì)標(biāo)記物結(jié)構(gòu)及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性,高精確度試劑保質(zhì)期至少一年標(biāo)準(zhǔn)曲線保留時(shí)間長同一批次只需兩點(diǎn)定標(biāo)多標(biāo)記單,雙,三,四標(biāo)記同一試劑盒可同時(shí)測多個(gè)項(xiàng)目三、應(yīng)用內(nèi)分泌科檢查甲狀腺系列:TSH,UltraTSH,T3,T4,FT3,FT4,TBG,TG糖尿病系列:Insulin,C-Peptie生長激素類:hGH其她: Cortisol婦產(chǎn)科檢查FSH,LH,HCG,ProlactinE2,E3,Testo,Prog,SHBG腫瘤科檢查AFPCEAPSAhTG,β-2MicroNSEPAPPSA(Free/Total)PSAEQMCA-50CA-125CA-199CA-153*CA-724*CY-211*遺傳科檢查產(chǎn)前篩查:hAFP/
HCG,PAPPA新生兒篩查:Neo-TSH,Neo-T4,Neo-IRT,Neo-17a-OHProg,PKU核酸探針及基因雜交檢測,多標(biāo)記定量PCR檢測。肝炎系列甲肝,乙肝,丙肝血液科檢測貧血檢查: Ferritin,VitB12,Folicacid白血病: 免疫細(xì)胞分型等細(xì)胞學(xué)檢查細(xì)胞毒試驗(yàn)等多種檢測項(xiàng)目,細(xì)胞質(zhì)及組織化學(xué)分析等多種檢測項(xiàng)目酶類檢測及細(xì)胞受體檢測(包括MHC,HLA等多種檢測)科研工具單標(biāo)記檢測,雙標(biāo)記檢測,三標(biāo)記檢測,四標(biāo)記檢測時(shí)間分辨熒光免疫測定技術(shù)在病毒性肝炎診斷和療效監(jiān)測中得應(yīng)用病毒性肝炎得種類HepatitisAVirusHepatitisBVirusHepatitisCVirusHepatitisDVirusHepatitisEVirusHepatitisGVirusTTVHepatitisGvirus(HGV)
Science、1996Jan26;271(5248):505-8、
AnRNAvirus,hepatitisGvirus(HGV),fromtheplasmaofapatientwithchronichepatitis、entiregenome(9392nucleotides)encodingapolyproteinof2873aminoacids、HGVwasassociatedwithacuteandchronichepatitis、Thevirusistransfusion-transmissible、Ithasaglobaldistributionpresentwithinthevolunteerblooddonorpopulation、9699000102039798HGVandGBV-Cweretwoisolatesofthesamevirus、TheHGV/GBV-CgenomesequenceandorganizationarecloselyrelatedtohepatitisCvirus、infectionismonandfrequentlypersistsinhumans,infectionhasnotbeenfoundtobeassociatedwithanyknowndiseasestate、(acuteorchronichepatitis)growinlymphocytes,notinhepatocytes,
Recentstudiessuggest:GBV-CinfectioninHIV-positivepeopleisassociatedwithprolongedsurvival、coinfectionofhumanlymphocyteswithGBV-CandHIVleadtodecreasedHIVreplication、HGVmayprovidenovelapproachesfortreatingHIVandAIDS、TTvirus(TTV)foundin1997fromahepatitispatientwithoutvirusmarkers、However,therealimpactofTTVonliverdiseasesremainsuncertaintodate、DuetothelackofsuitablecellsystemstosupportthegrowthofTTV,thebiologyofTTVisstillobscure、HBsAgHBcAgHBVDNAPolymerase一、HBV得主要生物學(xué)性狀HBV感染病毒在體內(nèi)大量復(fù)制免疫反應(yīng)病毒核酸進(jìn)入血液釋放病毒蛋白(Ag)分子生物學(xué)方法刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體核酸定性或定量血清學(xué)方法病毒抗原或抗體臨床診斷和療效觀察二、HBV感染診斷得主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)血清免疫學(xué)檢測得臨床意義1HBV感染診斷得主要指標(biāo)2判斷機(jī)體對(duì)HBV得免疫狀況主要指標(biāo)3判斷病程得主要指標(biāo)AcuteHepatitisBDNA4-12周1-2周2周-3月3-6月潛伏期急性早期潛伏后期急性期康復(fù)期痊愈標(biāo)志物相對(duì)濃度有傳染性可能有傳染性有免疫力血清學(xué)轉(zhuǎn)換期HBsAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBcIgMAnti-HBeAnti-HBsChronicHBVInfection潛伏期(4-12周)急性感染(6個(gè)月)慢性感染HBsAgAnti-HBcAnti-HBcIgMHBeAgAnti-HBeDNA3HBV血清學(xué)標(biāo)志物與HBVDNA得關(guān)系血清學(xué)標(biāo)志物:
反映機(jī)體對(duì)病毒得免疫狀況,病程,判斷病情。不能完全反映病毒在體內(nèi)復(fù)制狀況。HBVDNA
反映病毒在體內(nèi)復(fù)制水平,觀察藥物療效,部分“小三陽”及低水平病毒復(fù)制時(shí)出現(xiàn)陰性。不能反映機(jī)體得免疫狀況和病情三、時(shí)間分辨熒光檢測HBsAg與其她方法得比較TRFIA與ElecsysSystems2010檢測HBsAg定性結(jié)果比較TRFIA陽性陰性合計(jì)陽性60060陰性04040總數(shù)6040100ElecsysSystems2010靈敏度=〔40/(0+40)〕×100%=100%靈敏性=〔60/(0+60)〕×100%=100%兩者符合率100%與EIA檢測HBsAg定性結(jié)果比較TRFIAEIA陽性陰性合計(jì)陽性59160陰性04040總數(shù)5941100與ElecsysSystems2010檢測HBsAg定量結(jié)果比較ElecsysSystems2010檢測HBsAg(COI)與TRFIA檢測HBsAg(ng/L)得相關(guān)性=0、987TRFIA在乙肝“兩對(duì)半”定量檢測應(yīng)用一、
極大地提高了檢測得靈敏度TRFIA檢測HbsAg靈敏度可達(dá)0、2ng/ml,而酶標(biāo)(ELISA)檢測HbsAg靈敏度就是2ng/ml,也就就是說只有血清中得HbsAg達(dá)到2ng/ml酶標(biāo)才會(huì)呈陽性。1、縮短急性乙肝HBsAg檢測“窗口期”2、如病毒發(fā)生變異后,表達(dá)量較低,常規(guī)ELISA測不出抗原,而TRFIA定量具有極高得靈敏度,可發(fā)現(xiàn)并極有可能同時(shí)檢測出HbsAg和抗-Hbs。3可發(fā)現(xiàn)低濃度HbsAg攜帶者。特別就是一些群體如醫(yī)護(hù)工作者、病人家屬等,由于長期密切接觸,但又非直接經(jīng)血傳播感染成急性乙肝,而就是長期少量感染,并刺激機(jī)體產(chǎn)生一定得免疫力,可能呈低濃度感染,特別應(yīng)當(dāng)引起人們得足夠重視,密切關(guān)注并采取措施防止發(fā)展成乙肝或慢性攜帶者。二、
動(dòng)態(tài)觀察療效和病情監(jiān)測。疾病得發(fā)生、發(fā)展、療效、預(yù)后就是一個(gè)動(dòng)態(tài)得變化得過程,TRFIA定量檢測乙肝“兩對(duì)半”各項(xiàng)標(biāo)志物得濃度變化可對(duì)乙肝得病程、治療、預(yù)后起一個(gè)全程動(dòng)態(tài)檢測得作用,能夠?yàn)獒t(yī)生對(duì)病情療效作出合理得解釋提供依據(jù),指導(dǎo)治療。1、定量分析HbsAg和抗-Hbs得濃度變化,可以預(yù)見急性乙肝就是否處于恢復(fù)期。如HbsAg濃度降低,抗-Hbs得濃度逐漸升高,可說明病情正往恢復(fù)期發(fā)展。反之,HbsAg濃度處于較高水平或上升趨勢,而抗-Hbs一直處于較底水平,則容易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者。2、定量分析HbeAg和抗-Hbe得濃度變化,可以反映病情變化和治療效果。明確檢測HbeAg向抗-Hbe轉(zhuǎn)換得時(shí)期,即表現(xiàn)為HbeAg濃度下降和抗-Hbe濃度升高得過程。高濃度得HbeAg還可間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài),具有較高得傳染性。高濃度得抗-Hbe一方面提示病情得好轉(zhuǎn),而在某些時(shí)候(如肝功能指標(biāo)很差)可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。3、抗-Hbc濃度得高低可以反映病毒感染得狀態(tài)。乙肝急性感染常常呈現(xiàn)高濃度得抗-Hbc,恢復(fù)期濃度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持續(xù)高濃度。低濃
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