2025年高考生物總復(fù)習(xí)：基因工程的基本工具與操作程序

課時(shí)6基因工程的基本工具與操作程序

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課標(biāo)要求核心考點(diǎn)五年考情核心素養(yǎng)對(duì)接

2023：重慶T12、湖北T4和T22

基因工程的基(4)、新課標(biāo)T6；

本工具2022：湖北T24(3)；

1.闡明DNA重組技術(shù)的2021：湖北T7、全國(guó)乙T38

1.科學(xué)思維一一建立

實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)2023：遼寧T8和T25、江蘇T22、天

模型：基因工程的

切核酸酶、DNA連接酶津T17、山東T25、湖南T19(2)、

操作流程。分析與

和載體三種基本工具；全國(guó)乙T38、浙江1月T24(5)；

綜合：理解基因工

2.闡明基因工程的基本2022：江蘇T24、全國(guó)乙T38、遼寧

程的工具；PCR的原

操作程序主要包括目的T12和T24I、天津T15；

理，推斷PCR反應(yīng)

基因的獲取、基因表達(dá)2021：山東T25、遼寧T24、廣東

所需的條件；根據(jù)

載體的構(gòu)建、目的基因基因工程的基T22、湖北T16、全國(guó)甲T38、天津

基因表達(dá)的過程，

導(dǎo)入受體細(xì)胞和目的基本操作程序T16、江蘇T23、福建T21、浙江6月

推斷目的基因檢測(cè)

因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)T29(二)(2)；

與鑒定的方式。

鑒定等步驟；2020：浙江7月T24和T29(二)

2.科學(xué)探究一一通過

3.DNA的提取和鑒定；(1)(2)、浙江1月T29(二)

DNA的粗提取與鑒

4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(2)；

定及DNA片段的擴(kuò)

(PCR)擴(kuò)增DNA片段2019：江蘇T33、全國(guó)IT38、天津

增與鑒定的實(shí)際操

并完成電泳鑒定，或運(yùn)T9

作，培養(yǎng)科學(xué)探究

用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)2023：江蘇T9D、廣東T11；

DNA的粗提取能力

驗(yàn)2022：山東T13；

與鑒定及DNA

2021：山東T13；

片段的擴(kuò)增與

2020：海南T10；

鑒定

一2019：江蘇T10

1.基因工程是高考的重點(diǎn)，常以科研或生產(chǎn)實(shí)踐為情境，考查基因工程的基本工具及基本

操作程序，也常與核酸的結(jié)構(gòu)、遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)、細(xì)胞工程、胚胎工程等知識(shí)相結(jié)合進(jìn)

命題分析預(yù)測(cè)行綜合考查，多以非選擇題形式呈現(xiàn)，但也可以選擇題的形式呈現(xiàn)。

2.預(yù)計(jì)2025年高考試題仍可能延續(xù)往年的考查形式及特點(diǎn)，分層設(shè)置問題，多角度考查

基因工程的工具、操作程序等相關(guān)知識(shí)，同時(shí)原因分析型試題的比例將大大增加

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考點(diǎn)1基因工程的基本工具

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P343

I-I

1.基因工程的概念

(1)手段：按照人們的愿望，通過［1］轉(zhuǎn)基因等技術(shù),賦予生物新的遺傳特性。

(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和［2］生物產(chǎn)品。

(3)操作水平：［3］分子水平。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作

-4］重組DNA技術(shù)。

2.基因工程的基本工具

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教材補(bǔ)遺［選必3P72“旁欄思考”］DNA連接酶和DNA聚合酶不是一回事。原因：①DNA連接酶是催化

兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，而DNA聚合酶只能催化單個(gè)脫氧核甘酸加到已有的DNA片段3,末

端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；②DNA聚合酶起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶起作用

時(shí)不需要模板。

3.與DNA有關(guān)的幾種酶的比較

\項(xiàng)目

\作用底物作用結(jié)果

種類\

限制酶DNA分子切開磷酸二酯鍵，形成黏性末端或平末端

DNA連接酶兩個(gè)DNA分子片段通過形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成新的DNA分子

DNA聚合酶DNA片段、脫氧核甘酸通過形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成新的單鏈DNA分子

DNA酶[10]DNA分子斷開磷酸三酯鍵，形成脫氧核甘酸

解旋酶雙鏈DNA分子斷開堿基對(duì)間的氫鍵，形成單鏈DNA分子

RNA聚合酶DNA片段、核糖核甘酸通過形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成單鏈RNA分子

基礎(chǔ)自測(cè)

1.重組DNA技術(shù)所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。（X）

2.所有的限制酶都只能識(shí)別同一種特定的核甘酸序列。（X）

3.切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核甘酸序列。（X）

4.限制酶和DNA連接酶的作用部位一致，但作用相反。（4）

5.所有DNA連接酶都能連接黏性末端和平末端。（X）

6.載體的種類有質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒等。（4）

7.載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標(biāo)記基因。（X）

深度思考’

1.原核生物中存在限制酶的意義是什么？

提示當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，原核生物會(huì)利用限制酶切割外源DNA以保證自身安全，這是原核生物在長(zhǎng)期

進(jìn)化過程中形成的防御機(jī)制。

2.原核生物中限制酶為什么不切割自身的DNA?

提示原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已被修飾等。

3.基因工程中的載體與細(xì)胞膜上的載體相同嗎？

提示不同?；蚬こ讨械妮d體通常是質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等，主要作用是攜帶外源基因進(jìn)入受體

細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA進(jìn)行同步復(fù)制；細(xì)胞膜上的載

體一般為蛋白質(zhì)，主要是運(yùn)載要進(jìn)入細(xì)胞的特定物質(zhì)。

4.天然質(zhì)粒一般不能直接用作基因工程載體的原因是什么？

提示只有具有能自我復(fù)制、有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因及對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害等特點(diǎn)的質(zhì)粒

才可以直接用作基因工程的載體。實(shí)際上天然質(zhì)粒一般不完全具備上述條件，其往往需要進(jìn)行人工改造后

才能用于基因工程操作。

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P345

命題點(diǎn)基因工程所需的工具酶分析

1.[2023新課標(biāo)]某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端

含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)

如圖所示。

下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（C）

A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切害U，用Eco〃DNA連接酶連接

B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接

C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接

D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用Eco〃DNA連接酶連接

解析只用一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)使質(zhì)粒和目的基因發(fā)生自身環(huán)化或者使目的基因在質(zhì)粒中

反向連接，而且酶3切割產(chǎn)生平末端，Eco〃DNA連接酶不能連接具有平末端的DNA片段，A錯(cuò)誤；用

酶1切割目的基因，產(chǎn)生的是黏性末端，用酶3切割質(zhì)粒，產(chǎn)生的是平末端，無(wú)法連接，B錯(cuò)誤；質(zhì)粒和

目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA連接酶連接，使目的基因定向插到質(zhì)粒中，C正確；用

酶4切割質(zhì)粒會(huì)破壞標(biāo)記基因，不能選擇酶4切割，D錯(cuò)誤。

通性通法

圖解限制酶的選擇依據(jù)

（1）根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類

①應(yīng)選擇位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲中可選擇Psrl。

②不能選擇目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲中不能選擇I?

（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類

①通常選擇與待切割目的基因相同的限制酶，以確保出現(xiàn)相同的黏性末端，如圖乙中的Psfl。

②在只有一種標(biāo)記基因時(shí)，選擇的限制酶不能破壞標(biāo)記基因，如圖乙中限制酶Snial會(huì)破壞標(biāo)記基因。

2.[2023保定模擬，10分]如圖為大腸桿菌及質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)模式圖，據(jù)圖回答下列問題。

（1）a和質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)相同，都是DNA,二者還具有其他共同點(diǎn)，如能夠自我復(fù)制（寫出一條

即可）。

-ACGCGT-

(2)若質(zhì)粒的切割末端為一TGCGC,則與之連接的目的基因切割的黏性末端應(yīng)為-----A^,可使用—

DNA連接酶把質(zhì)粒和目的基因連接在一起。

(3)氨葦青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上作為標(biāo)記基因，其作用是便于重組DNA的鑒定和篩

選。

(4)下列常在基因工程中作為載體的是(C)

A.蘇云金桿菌抗蟲基因

B.農(nóng)桿菌環(huán)狀RNA分子

C.大腸桿菌的質(zhì)粒

D.動(dòng)物細(xì)胞的染色體

(5)除質(zhì)粒外，常用的載體還有噬菌體和動(dòng)植物病毒等。

解析(1)圖中a是擬核DNA,擬核DNA和質(zhì)粒的本質(zhì)都是DNA分子，均能夠自我復(fù)制。(2)DNA

連接酶可以將具有互補(bǔ)末端的2個(gè)DNA片段連接在一起，形成重組DNA分子，若質(zhì)粒的切割末端為

—ACGCGT-

-TGCGC,則與之連接的目的基因切割的黏性末端應(yīng)為A-o(3)質(zhì)粒上常具有標(biāo)記基因(如抗生

素的抗性基因)，便于重組DNA的鑒定與篩選。

考點(diǎn)2基因工程的基本操作程序

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P346

1.基因工程的基本操作程序

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教材補(bǔ)遺[選必3P77“相關(guān)信息”]Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人

和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體。

2.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

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PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的異同

類型PCR體內(nèi)DNA復(fù)制

時(shí)期人工控制，隨時(shí)進(jìn)行有絲分裂和減數(shù)分裂前的間期

場(chǎng)所細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)

解旋方式90℃以上高溫條件下變性解旋解旋酶催化

酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等

子鏈合成方式從兩條引物的3,端開始連續(xù)合成一條連續(xù)合成，另一條不連續(xù)合成

結(jié)果擴(kuò)增DNA片段或基因合成整個(gè)DNA分子

①都需要DNA模板、引物、能量和一定的溫度條件；②都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原貝

相同點(diǎn)

③DNA的合成都是從子鏈的5,端向3,端延伸

基礎(chǔ)自測(cè)，

1.基因表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子和密碼子。（X）

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。（4）

3.啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼子。（X）

4.Ti質(zhì)粒上的T—DNA可與雙子葉植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起。）

5.將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物受精卵常用基因槍法。（X）

6.PCR擴(kuò)增時(shí)，50℃左右，引物與作為模板的單鏈DNA特定部位相互配對(duì)、結(jié)合。（4）

深度思考、

1.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，為什么一般選用兩種限制酶切割目的基因和載體？

提示因?yàn)橛貌煌南拗泼阜謩e處理目的基因和載體時(shí)，可以使目的基因兩側(cè)和載體上各自具有兩個(gè)不同

的黏性末端，防止目的基因或載體發(fā)生自身環(huán)化及目的基因與載體反向連接。

2.啟動(dòng)子與起始密碼子、終止子與終止密碼子有什么不同？

提示啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比

項(xiàng)目本質(zhì)位置功能

啟動(dòng)子DNA片段目的基因上游RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

終止子DNA片段目的基因下游使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來

mRNA上三個(gè)

起始密碼子mRNA首端翻譯的起始信號(hào)（編碼氨基酸）

相鄰的堿基

mRNA上三個(gè)

終止密碼子mRNA尾端翻譯的結(jié)束信號(hào)（不編碼氨基酸）

相鄰的堿基

3.在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的識(shí)別序列，為什么？

提示不能，因?yàn)槟康幕虻男蛄兄腥艉杏玫降南拗泼傅淖R(shí)別序列，目的基因可能會(huì)被切斷。

4.在用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的過程中，為什么一定要將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T—DNA

±?

提示Ti質(zhì)粒的T-DNA是可轉(zhuǎn)移的DNA,可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上。將

目的基因插入Ti質(zhì)粒的T—DNA中，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。

5.復(fù)性時(shí)，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，但兩條解開的DNA模板鏈結(jié)合的概率較低，其原因是什

么？

提示①模板鏈一般較長(zhǎng)，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率低；②加入引物的量足夠多，而模板鏈較

少，故引物和模板鏈結(jié)合的機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于模板鏈間的。

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P347

命題點(diǎn)1PCR的過程和應(yīng)用分析

1.[2021湖北]某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對(duì)）

外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有

效的是（D）

A.增加模板DNA的量B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間

C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度

解析PCR過程中，引物和模板不完全配對(duì)會(huì)形成非特異條帶，增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速率，

但不會(huì)減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，A錯(cuò)誤；延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間和延伸的時(shí)間對(duì)延伸中的配對(duì)影響不

大，故不能有效減少非特異性條帶的產(chǎn)生，B、C錯(cuò)誤；非特異性條帶增加的原因可能是復(fù)性溫度過低使

引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。

2.[2022遼寧]抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12—5是我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提

供依據(jù)，采用PCR方法進(jìn)行目的基因監(jiān)測(cè)，反應(yīng)程序如圖所示。下列敘述正確的是（B）

A.預(yù)變性過程可促進(jìn)模板DNA邊解旋邊復(fù)制

B.后延伸過程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分

C.延伸過程無(wú)需引物參與即可完成半保留復(fù)制

D.轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測(cè)含有目的基因后即可上市

解析預(yù)變性的溫度為94℃,在這個(gè)溫度下，雙鏈DNA解旋為單鏈，但模板鏈不易和引物結(jié)合，不能進(jìn)

行復(fù)制，A錯(cuò)誤。延伸的目的是合成新的子鏈，后延伸延長(zhǎng)了延伸時(shí)間，使目的基因的擴(kuò)增更加充分，B

正確。延伸過程需要引物與模板鏈結(jié)合，在引物的3'端加上相應(yīng)的核甘酸，C錯(cuò)誤。轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測(cè)含

有目的基因且已經(jīng)表達(dá)使生物體表現(xiàn)出相應(yīng)性狀后，還需要經(jīng)過系列的安全性評(píng)價(jià)，符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)后才能

上市，D錯(cuò)誤。

命題點(diǎn)2基因工程的基本操作程序分析

3.[2023全國(guó)乙節(jié)選，10分]GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以G/T基因?yàn)椴?/p>

料，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類?；卮鹣铝袉栴}。

（1）構(gòu)建突變基因文庫(kù)?？蒲腥藛T將GFP基因的不同突變基因分別插入載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌制備出

GEP基因的突變基因文庫(kù)。

（2）構(gòu)建目的基因表達(dá)載體?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫(kù)中提取目的基因（均為突變基因）構(gòu)

建表達(dá)載體，其模式圖如圖所示（箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向）。圖中①為終止子；②為啟動(dòng)

子，其作用是被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合，驅(qū)動(dòng)GF尸突變基因的轉(zhuǎn)錄。

（3）目的基因的表達(dá)?？蒲腥藛T將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠

色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請(qǐng)從密碼子特點(diǎn)的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是密碼

子的簡(jiǎn)并使基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前相同（答出］點(diǎn)即可）。

（4）新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對(duì)其所含的GFP突變

基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列與GFP基因的不同，將該G“突變基因命名為KF尸基因（黃色熒光蛋白

基因）。若要通過基因工程的方法探究以中基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)思路是選擇合適的運(yùn)載

體，利用合適的限制酶和DNA連接酶將177基因和運(yùn)載體連接起來，構(gòu)建基因表達(dá)載體，之后將基因表

達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌，檢測(cè)酵母菌是否會(huì)發(fā)黃色熒光。

解析（2）一個(gè)基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因，還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等。啟動(dòng)

子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才

能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄在所需

要的地方停下來，位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。（3）結(jié)合題中信息可知，將

構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有的大腸桿菌發(fā)綠色熒光，即GFP蛋白的熒光顏色，推

測(cè)發(fā)綠色熒光的可能原因是密碼子的簡(jiǎn)并使GEP基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前的相同。（4）基因工

程的基本操作程序包括：①目的基因的篩選與獲??；②基因表達(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)

胞；④目的基因的檢測(cè)與鑒定。欲通過基因工程的方法探究KFP基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，可通過基因

工程的方法將目的基因?qū)虢湍妇?，之后檢測(cè)酵母菌是否發(fā)黃色熒光，如果發(fā)黃色熒光，則可證明KFP基

因能在真核細(xì)胞中表達(dá)，否則，不能證明｝TP基因能在真核細(xì)胞中表達(dá)。

4.［2021福建節(jié)選，10分］微生物吸附是重金屬?gòu)U水的處理方法之一。金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在

于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹的基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程

菌?；卮鹣铝袉栴}：

（1）根據(jù)棗樹的MTcDNA的核甘酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物（圖中甲），通過PCR擴(kuò)增基因。已知A

位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為引物1和引物4。

甲

II引物4

引物1Iii祐MT.DNA

A位點(diǎn)B位點(diǎn)________________

-ACGAG--GAATC--CTGC/io--GCctcG--GGTAct-

-GAGCTC--CTATAG--GACGTC--GGGfCC--CfATGG-

XhoIEcoRVPst1SmaIKpn.I

(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性

末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將基因接入載體Eo載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序

列如圖中乙所示。

①選用EcoRV酶將載體P切開，再用T4DNA(填“T4DNA”或“Eco/ZDNA")連接酶將

基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P'。

②載體P'不具有表達(dá)基因的啟動(dòng)子和終止子。選用XhoI和PstI酶組合對(duì)載體P和

載體E進(jìn)行酶切，將切下的基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入用離子

處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。

解析(1)據(jù)題中信息知，A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置，若要通過

PCR技術(shù)擴(kuò)增基因，應(yīng)選用引物1和引物4。(2)①通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出的基因的末端為平末

端，載體P中有限制酶X/?。I、EcoRV、PstI>SmaI的酶切位點(diǎn)，用限制酶I,PstI切割載體

P得到的均為黏性末端，而用限制酶EcoRV和I切割載體P得到的均是平末端，但不能用限制酶Sw

I進(jìn)行酶切，若用限制酶I進(jìn)行酶切，無(wú)法將目的基因插入載體E中，因此，應(yīng)選用EcoRV酶將載

體P切開，再用能連接平末端的T4DNA連接酶將基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P。②載體P,不

具有表達(dá)基因的啟動(dòng)子和終止子。再選用X/?。I和PstI酶組合對(duì)載體P和載體E進(jìn)行酶切，將切下

的基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入用鈣離子處理的大腸桿菌中，篩出MT

工程菌。

考點(diǎn)3DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴(kuò)增與鑒定

f----------------------JWgj麗炯--------------------------『學(xué)生用書

P348

1.DNA的粗提取與鑒定

2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

（1）原理

（2）方法步驟

基礎(chǔ)自測(cè)

1.進(jìn)行“DNA的粗提取”實(shí)驗(yàn)時(shí)，為獲得較好的提取效果，應(yīng)離心2次，第一次離心后應(yīng)保留上清液，第

二次離心后應(yīng)棄去上清液，且兩次離心的轉(zhuǎn)速也不相同。（4）

2.TaqDNA聚合酶是用PCR儀對(duì)DNA分子擴(kuò)增過程中常用的一種耐高溫的DNA聚合酶。（7）

3.PCR中離心的目的是讓反應(yīng)組分在離心管中分層分布。（義）

4.電泳鑒定PCR產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)在每個(gè)加樣孔中加入等量的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液的混合液。（X）

5.粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍(lán)色［2023江蘇，T9D］。（X）

6.過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解［2022山東，T13A］。（Y）

深度思考、

1.能否選擇哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞作為DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料，為什么？

提示不能。因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體等，不含DNA。

2.DNA的電泳鑒定實(shí)驗(yàn)中，影響DNA分子遷移速率的因素有哪些？

提示影響DNA分子遷移速率的因素有凝膠濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等。

f--------------------------之猷避----------------------------學(xué)生用書

P349

命題點(diǎn)1DNA的粗提取與鑒定

1.[2023廣東改編]“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是：裂解一分離一沉淀-鑒定。下列敘述錯(cuò)誤

的是（D）

A.裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)

B.分離：可去除混合物中的部分多糖、蛋白質(zhì)等

C.沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度

D.鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色

解析“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是：裂解、分離、沉淀、鑒定。裂解的目的是使細(xì)胞破裂，

釋放出DNA等物質(zhì)，A正確。DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離

DNA與蛋白質(zhì)等，分離過程中混合物中的部分多糖、蛋白質(zhì)等可被去除，B正確。DNA在不同濃度的

NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度可去除雜質(zhì)，反復(fù)多次以提高DNA的純度，C正確。

進(jìn)行DNA鑒定時(shí)可以使用二苯胺試劑，但要進(jìn)行沸水浴加熱后才能觀察到顏色變化，D錯(cuò)誤。

命題點(diǎn)2DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定

2.[2023浙江6月]某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠G〃a3基

因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得G〃a3-

GF尸基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)

增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。

圖乙

下列敘述正確的是（B）

A.Gma3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因表達(dá)

B.翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白

C.2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是GaS3-GEP基因純合子

D.若用引物1和引物3進(jìn)行PCR,能更好地區(qū)分雜合子和純合子

解析由圖甲可知，GaS3基因與GEP基因共用一個(gè)啟動(dòng)子，且由題干可知兩基因能正常表達(dá)出相關(guān)蛋白

質(zhì)，A錯(cuò)誤；由于啟動(dòng)子在左側(cè)，基因在右側(cè)，轉(zhuǎn)錄基因時(shí)，先轉(zhuǎn)錄基因，再轉(zhuǎn)錄GPP基因，且翻

譯的方向是沿mRNA從5'T3',因此翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；由圖乙可知，

大片段包含GFP基因編碼區(qū)片段，小片段不包含GFP基因編碼區(qū)片段，則2號(hào)小鼠是Gata3-GFP基因純

合子，4號(hào)小鼠是野生型，C錯(cuò)誤；若用引物1和引物3進(jìn)行PCR,雜合子和GaS3-GPP基因純合子均能

擴(kuò)增出條帶，僅有Gma3基因時(shí)無(wú)法擴(kuò)增出條帶，不利于區(qū)分雜合子和純合子，D錯(cuò)誤。

1.[2023遼寧]CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實(shí)時(shí)監(jiān)控CD163蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，將

紅色熒光蛋白R(shí)EP基因與CW63基因拼接在一起（如下圖），使其表達(dá)成一條多肽。該拼接過程的關(guān)鍵步

驟是除去（B）

啟動(dòng)于CD163RFP終止子

雙鏈DNA|||1|

A.CIT63基因中編碼起始密碼子的序列

B.CD/63基因中編碼終止密碼子的序列

C.KFP基因中編碼起始密碼子的序列

D.RFP基因中編碼終止密碼子的序列

解析由題意可知，若想使紅色熒光蛋白R(shí)FP基因與CO/63基因拼接在一起，使其表達(dá)成一條多肽，則

CW63基因和紅色熒光蛋白R(shí)FP基因都需進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，再結(jié)合圖示可知，CD/63基因轉(zhuǎn)錄形成的

mRNA中不能出現(xiàn)終止密碼子，否則在翻譯時(shí)會(huì)提前終止，無(wú)法表達(dá)出既含CD163蛋白又含紅色熒光蛋

白R(shí)FP的一整條多肽，因此該拼接過程的關(guān)鍵步驟是除去C0/63基因中編碼終止密碼子的序列，B符合

題意，A、C、D不符合題意。

2.[2023湖北]用氨茶青霉素抗性基因（4叩R）、四環(huán)素抗性基因（Te產(chǎn)）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所

示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)

化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（D）

Aw1、/3

H喻rI）

A.若用HindIII酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同

B.若用Pv"I酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用印/?I酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否

D.若用小〃I酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨茶青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落

解析若用小"dIII酶切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA連接酶將兩者連接成重組質(zhì)粒，目的

基因和質(zhì)粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用

PvuI酶切，會(huì)破壞氨羊青霉素抗性基因，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落