TCVMA 163-2024 動物分枝桿菌多重熒光熔解曲線檢測方法

T/CVMA163—2024動物分枝桿菌多重熒光熔解曲線檢測方法Mutiplexfluresencemeltingcurveanalysisfordetectionofmycobactrium2024-5-23發(fā)布2024-5-23實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I12規(guī)范性引用文件GB/T6682分析實驗室用水NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范4符號和縮略語DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraITS：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternalPBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphatebuffersaPCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReactioTm值：在熱變性過程中，隨著溫度的逐漸升高，探針逐漸從靶序列上脫落，其雙鏈解鏈到一半時所對應(yīng)的溫度稱為他們的熔解溫度（MeltingTemperUNG：尿嘧啶DNA糖基化酶（UracilN-Glycosylase）5試劑和耗材5.1試劑25.1.10TritonX-100：商品化試劑。5.1.12多重實時熒光PCR檢測（熔解曲線5.2.1無菌注射器。5.2.2真空采血管。5.2.3無菌離心管。5.2.5微量移液器吸頭（與微量移液器相應(yīng)規(guī)格適配）。5.4陽性靶標序列及質(zhì)粒6儀器與設(shè)備3滅菌并烘干，或160℃干烤1h滅菌；或使用一次性無菌用等效工具。分混合?？鼓齽┎捎脵幟仕徕c緩沖液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝劑。采集混有黏液、血液、黏膜的糞便，或用刮匙從動物直腸深4取1mL～2mL全血樣品，15000g離心10min，棄上清液；加等量體積滅菌雙蒸水充分振蕩，15000g離心10min；棄上清液，若紅細胞裂解不完全，應(yīng)采用無菌雙蒸水重復洗滌；收0.01mol/LpH7.6PBS重懸沉淀，充分振蕩混勻；將沉淀懸浮液移入微量離心管，15000g離心10min；在痰液樣品加入2倍～4倍體積4%氫氧化鈉消化液，振蕩混勻，室溫離心10min，棄上清液，重復本步驟一次；收集沉淀分別從三個不同的位置取適量的組織樣品，剪碎，按1:5的比例加入檸檬酸鈉磷酸緩沖液，充分研蕩，75℃溫浴0.5h～1h；取上清液，15000g離心10min；棄上清液，加等量0.01mol/LpH7蕩混勻，使沉淀充分懸浮，15000g離心10min，棄上清液，重復本步驟1次），室溫靜置0.5h～1h；取上層約3mL液體（避免吸取粗渣），5000g離心1min，取上清液，15000g離心10min；棄上清液，加等量0.01mol/LpH7.6PBS，充分振蕩混勻，15000g離心10在處理后的沉淀物中加入50μL～100μLDNA提取液，充分振蕩混勻，56℃溫浴30min，98℃~上清液，直接用于PCR或貯存于-80℃?zhèn)湓谔幚砗蟮某恋砦镏屑尤?0μL～100μLDNA提取液，充分振蕩混勻，56℃溫浴30min，9858.2.3PCR反應(yīng)液配液標準為：分別?。╪注：n=實際檢測樣品所需測試數(shù)+陽性對照測試數(shù)+陰性對照測試8.2.5將配制好的PCR反應(yīng)管裝入自封袋轉(zhuǎn)移至至樣品制備區(qū)。貯存在2℃~8℃之間直至樣品提取8.3.2用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)9結(jié)果判定9.1結(jié)果分析條件設(shè)定9.2試驗成立的條件——ROX通道只出現(xiàn)74.9℃~82.9℃（內(nèi)控熔點）的熔解峰；6——FAM通道只出現(xiàn)56.5℃~63℃（結(jié)核分枝桿菌復合群特異熔點）的熔解峰；——ROX通道出現(xiàn)67.9℃~74.5℃（分枝桿菌屬特異熔點——ROX通道出現(xiàn)74.9℃~82.9℃（內(nèi)控熔點9.2.39.2.1和9.2.2要求須在同一次試驗中同時滿足，否則，本次試驗9.3結(jié)果判定樣品在ROX通道只出現(xiàn)74.9℃~82.9℃（內(nèi)控熔點）的熔解峰，其他通道均無熔解峰，則表示陽性樣品判讀依據(jù)對于每一份樣品，其在ROX通道74.9℃~82.9℃處應(yīng)有熔解峰（內(nèi)控否則該樣品檢測無效；根據(jù)樣品在ROX通道67.9℃~74.5℃處是否有熔解峰進行判讀，若無熔解峰，則樣品不含分枝桿菌，單一感染陽性判定樣品在ROX通道出現(xiàn)67.9℃~74.5℃（分枝桿菌屬特異熔點）和74.9℃~82.9℃（內(nèi)控熔點）恥垢分枝桿菌：FAM通道76.0℃~83.0℃;瘰疬分枝桿菌：FAM通道63.5℃~72.0℃;結(jié)核分枝桿菌復合群：FAM通道56.5℃~63.0℃;龜分枝桿菌：FAM通道49.0℃~56.0℃;副結(jié)核分枝桿菌：HEX通道66.5℃~75.1℃,Cy5通道61.9℃~69.9℃;堪薩斯分枝桿菌：HEX通道60.5℃~66℃;偶然分枝桿菌：ROX通道61.8℃~67℃;潰瘍分枝桿菌或海分枝桿菌：ROX通道52.7℃~60.7℃;胞內(nèi)分枝桿菌：Cy5通道61.9℃~69.9℃;鳥分枝桿菌：Cy5通道54.9℃~61.5℃?；旌细腥娟栃耘卸?.3.3樣品無效出現(xiàn)這種情況的原因可能是樣品經(jīng)提取后核酸中含有抑制PCR反應(yīng)的雜質(zhì)或者實驗人員操作出現(xiàn)錯79.3.4可能影響檢測結(jié)果的因素準確會引起試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或檢測10.4樣品處理與PCR加樣應(yīng)在不同的區(qū)域進行,不同區(qū)域配備獨立的加樣工具和用具。該區(qū)域可以是器應(yīng)能耐受煮沸、10%次氯酸鈉溶液消毒處理。每次實驗結(jié)束，應(yīng)在紫外消毒前，及時清理廢棄物及10.5PCR反應(yīng)液等試劑應(yīng)按檢測需求分10.7上機運行前，應(yīng)檢查蓋緊各PCR管，8DNA提取試劑的配制A.1檸檬酸鈉磷酸緩沖液A.20.5mol/LEDTA（pH8.0）稱取186.1gEDTA，加入到800mL蒸餾水中，磁力攪拌器上劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0定容至1L，分裝后121℃±2℃高壓滅菌15min，室溫貯存。A液（0.2mol/LNaH2PO4溶液）：稱取一水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O）27.6g，或二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4?2H2O）31.2g，溶于蒸餾水中，定容B液（0.2mol/LNa2HPO4溶液稱取十二水磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉（Na2HPO4?2H2O）35.6g，溶于蒸餾水中，稱取17g氯化鈉，用適量蒸餾水溶解，量取13mLA液加87mLB液，用蒸餾水定容A.4氫氧化鈉消化液取35g～40gNaOH，2g鉀明礬，20m按比例加入），加入1L蒸餾水混勻，即為氫氧化鈉消化液。A.5DNA提取液A.64%硫酸濃度取98%的濃硫酸10毫升（含硫酸10*98%*1.9序列信息(5′→3′)通用引物-R1GCGTTTTCGGCGGTTTGTCAAACTTTTTTGACTGCCAGACA海/潰瘍探針-P6>CP072765.1:1473145-1473795MycobacteriumtuberculosisstraH37Rv_CGchromosome,compleTGCATGACAACAAAGTTGGCCACAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTT>LN831039.1:3901029to3901329MycobacteriumsmegmatisgenACGAGAGACACTCTCCGTTGGGGAGGGTGTGAGCCGTGAGGAGGAGCGCTGTAGTGGCGCCGGCTTGGGCCCTGAGACAACAGGCCCGTTGTTCCCTGGCCACTGTGTGGGGAGGCGTGTTGTTGCCCTGCTTTGGTGGTGGGGTGTGchelonaestrainDSM43chromosome,completeGGCACACTGTTGGGTCCTG>LR031415.1:28to309MycolicibacteriumfortuitumDNAspacerregion,strainKACGAAAAGGGTTGAGACACTGGGTCTTACCCGAGCCGTGAGGAACCGGTTGCCTGTAGTGGGCACGGTTTGGTGCACAACAAACTTTTTTGTTTTGGGGGGTGGCATCCGGTT>LR135168.1:4406391to4406635MycobacteriumulceransstrGTCTGTAGTGGACGGAAGCCGGGTGCA>LR031430.1:28to271MycobacteriumintracellulareATCCintergenicspacerregion,KM06-472ACGAAAAGCACTCCAATTGGTGGG>CP046507.1:3010473to3010741MycobacteriumaviumsubsstrainDSM44156chACGAAAAGCACCCCAACTGGTGGGGTGCGAGCCGTGAGGGGTTCC>AB026702.1:101to345MycobacteriumscrofulaceumDNAACGAAAAGCACCCCAACTGGTGGGGTGCGAGCCGTGAGGGGTTCT菌>LR031424.1:28to272MycobacteriumkansasiiDNAcontaining16S-23Sintergenicspacerregion,strainKM0ACGAAAAGCATCCCAACAAGTGGGGTGCGTCTGTAGTGGACGAAAGCCG菌>CP053068.1:4756908to4757254MycobacteriumaviumsubparatuberculosisstrainDSM44135chromosome,complete>LR782542.1:8037817to8037Arabidopsisthaliana