飼料安全性評(píng)價(jià) 喂養(yǎng)致畸試驗(yàn) 征求意見稿

1GB/T21035－202×飼料安全性評(píng)價(jià)喂養(yǎng)致畸試驗(yàn)本文本描述了喂養(yǎng)致畸試驗(yàn)的試驗(yàn)方法、技術(shù)要求和評(píng)價(jià)報(bào)告信息。本文本適用于評(píng)價(jià)飼料和飼料添加劑的致畸性。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備GB14922.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)GB14922.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)GB14924.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料通用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB14924.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠、大鼠配合飼料GB14925實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境與設(shè)施國(guó)家科委第2號(hào)令實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1飼料飼料是指經(jīng)工業(yè)化加工、制作的供動(dòng)物食用的產(chǎn)品，包括單一飼料、添加劑預(yù)混合飼料、濃縮飼料、配合飼料和精料補(bǔ)充料。3.2飼料添加劑飼料添加劑是指在飼料加工、制作、使用過程中添加的少量或者微量物質(zhì)，包括營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑和一般飼料添加劑。3.3發(fā)育毒性個(gè)體在出生前暴露于受試物、發(fā)育成為成體之前（包括胚期、胎期以及出生后）出現(xiàn)的有害作用，表現(xiàn)為發(fā)育生物體的結(jié)構(gòu)異常、生長(zhǎng)改變、功能缺陷或死亡。3.4致畸性受試物在妊娠的關(guān)鍵時(shí)期（尤其是器官發(fā)生期間）暴露時(shí)，導(dǎo)致子代發(fā)育畸形的能力。2GB/T21035－202×3.5母體毒性受試物引起親代雌性妊娠動(dòng)物直接或間接的健康損害效應(yīng)，表現(xiàn)為增重減少、功能異常、中毒體征，甚至死亡。3.6妊娠率gestationindex妊娠動(dòng)物數(shù)占確認(rèn)交配雌性動(dòng)物數(shù)的百分比。3.7分娩率parturitionindex分娩活仔雌性動(dòng)物數(shù)占妊娠動(dòng)物數(shù)的百分比。3.8死胎率fetalmortality死胎仔數(shù)占分娩胎仔總數(shù)的百分比。3.9畸胎出現(xiàn)率incidenceofterata畸胎總數(shù)占活胎仔總數(shù)的百分比。3.10畸胎總數(shù)sumofterata出現(xiàn)畸形的所有活胎仔數(shù)。3.11單項(xiàng)畸形出現(xiàn)率incidenceofsingleteratosis出現(xiàn)某種畸形的活胎仔數(shù)占活胎仔總數(shù)的百分比。3.12活胎仔平均畸形出現(xiàn)率meanincidenceofteratosis畸形總數(shù)占活胎仔總數(shù)的百分比。3.13畸形總數(shù)sumofteratosis所有活胎仔出現(xiàn)的各種畸形種類數(shù)。3.14母體畸胎出現(xiàn)率incidenceofterataparturition分娩畸胎的母體數(shù)占妊娠母體總數(shù)的百分比。4試驗(yàn)?zāi)康暮驮砟阁w在孕期受到可通過胎盤屏障的某種有害物質(zhì)作用，影響胚胎的器官分化與發(fā)育，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)胎仔畸形。因此，在受孕動(dòng)物胚胎的器官形成期給予受試物，可檢出該物質(zhì)對(duì)胎仔的致畸作用。檢測(cè)妊娠動(dòng)物接觸受試物后引起的致畸可能性，預(yù)測(cè)其對(duì)人體可能的致畸性。5試劑及溶液配制除非另有規(guī)定，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)用水要求。5.1乙醇固定液：95%乙醇。5.2鮑因（Bouins）固定液：取飽和苦味酸溶液750mL、40%甲醛250mL和乙酸50mL混合而成。5.3氫氧化鉀溶液：分別配制1%和2%兩種不同濃度的氫氧化鉀溶液。3GB/T21035－202×5.4茜素紅（alizarinred）貯備液：將茜素紅加入5mL乙酸、10mL純甘油和60mL1%水合氯醛的混合液中至飽和。5.5茜素紅應(yīng)用液：取茜素紅貯備液1-5mL，用10g/L-20g/L氫氧化鉀溶液稀釋至1000mL，用前臨時(shí)配制。5.6茜素紅溶液：取茜素紅0.1g，氫氧化鉀10g，蒸餾水1000mL，臨用時(shí)配制（剝皮法骨骼染色液）。5.7脫水透明液A：甘油200mL、2%氫氧化鉀溶液30mL，加蒸餾水至1000mL。5.8脫水透明液B：甘油500mL、2%氫氧化鉀溶液30mL，加蒸餾水至1000mL。5.9固定液（B0uinS液）：2,4,6-三硝基酚（苦味酸飽和液）75份、40%甲醛20份、冰乙酸5份。6儀器與設(shè)備6.1實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。6.2放大鏡和解剖顯微鏡。6.3生物顯微鏡。6.4體視顯微鏡。6.5分析天平。6.6游標(biāo)卡尺（百分尺）。7受試物受試物應(yīng)使用原始樣品，若不能使用原始樣品，應(yīng)按照受試物處理原則對(duì)受試物進(jìn)行適當(dāng)處理。8實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇應(yīng)符合GB14922.2的有關(guān)規(guī)定。嚙齒類首選大鼠，非嚙齒類首選家兔。若選用其他物種應(yīng)給出理由。選用健康、性成熟的雄性動(dòng)物和未經(jīng)交配的雌性動(dòng)物，試驗(yàn)開始時(shí)動(dòng)物體重的差異不應(yīng)超過平均體重的20%。所用動(dòng)物應(yīng)注明種類、品系、性別、體重和周齡。8.1.2動(dòng)物性別和數(shù)量性成熟雄性和雌性動(dòng)物通常按1:1或1:2比例合籠交配，如果5d內(nèi)未交配，應(yīng)更換雄性動(dòng)物。為了獲得足夠的胎仔來評(píng)價(jià)其致畸作用，每個(gè)劑量水平的懷孕動(dòng)物數(shù)不少于12只。8.2動(dòng)物準(zhǔn)備試驗(yàn)前動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房至少應(yīng)進(jìn)行3d～5d環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察。8.3動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料應(yīng)分別符合GB14925、GB5749、GB14924.3有關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水和攝食，妊娠動(dòng)物應(yīng)單籠飼養(yǎng)。9劑量分組試驗(yàn)組劑量一般選擇在1/10~1/100母體LD50之間。高劑量一般應(yīng)使母體產(chǎn)生中毒癥狀；低劑量應(yīng)不引起母鼠產(chǎn)生可觀察到的中毒癥狀；在高劑量組與低劑量組之間設(shè)1~2個(gè)中劑量組。設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組或溶劑對(duì)照組，必要時(shí)還要設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。每組孕鼠不能低于12只。試驗(yàn)至少設(shè)3個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照組，溶媒對(duì)照組除不給受試物外，其余處理均同劑量組。4GB/T21035－202×常用經(jīng)口給予的陽(yáng)性對(duì)照物及參考劑量為敵枯雙(0.5mg/kg體重-1.0mg/kg體重）、五氯酚鈉(30mg/kg體重）、阿斯匹林(250mg/kg體重-300mg/kg體重）及維生素A(7500μg/kg體重-13000μg/kg體重視黃醇當(dāng)量）等，或者用環(huán)磷酰胺(15mg/kg體重）于孕第12天腹腔注射1次。曾用陽(yáng)性物開展過致畸試驗(yàn)、并在所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系有陽(yáng)性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)可略去—置陽(yáng)性對(duì)照組。高劑量組原則上應(yīng)使部分動(dòng)物出現(xiàn)某些發(fā)育毒性和(或）母體毒性，如體重輕度減輕等，但不至引起死亡或嚴(yán)重疾病，如果母體動(dòng)物有死亡發(fā)生，應(yīng)不超過母體動(dòng)物數(shù)量的10%。低劑量組不應(yīng)出現(xiàn)任何觀察到的母體毒性或發(fā)育毒性作用。建議遞減劑量系列的組間距2倍-4倍比較合適。當(dāng)組間差距較大時(shí)(如超過10倍）加設(shè)一個(gè)試驗(yàn)組。試驗(yàn)劑量的設(shè)計(jì)參考急性毒性試驗(yàn)劑量、28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)、90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)劑量和人體實(shí)際攝入量進(jìn)行。對(duì)于能求出LD50的受試物，根據(jù)LD50值和劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線斜率設(shè)計(jì)高劑量組的劑量。對(duì)于求不出LD50的受試物，如果28天或90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)未觀察到有害作用，以最大未觀察到有害作用劑量作為高劑量；如果28d或90d經(jīng)口試驗(yàn)觀察到有害作用，以最小觀察到有害作用劑量水平(no-observed-adverse-effectlevel,NOAEL)為高劑量組，以下設(shè)2個(gè)劑量組。設(shè)置劑量水平時(shí)還應(yīng)參考受試物的其他毒理學(xué)資料。10操作步驟10.1受試物給予與觀察一般采用混飼或混飲給予受試物，若選用其他途徑應(yīng)說明理由。以大鼠為例，原則上雄鼠交配前4周~8周開始給予受試物直至交配成功，確證雌鼠受孕為止。雌鼠從交配前2周~4周開始給予受試物至孕期的第13天～第15天。在試驗(yàn)期間，每天觀察試驗(yàn)鼠的體征、行為活動(dòng)、采食和飲水情況。每周至少稱1次體重，并同時(shí)計(jì)算采食量。若采取受試物經(jīng)口灌胃給予，要將受試物溶解或懸浮于合適的溶媒中，首選溶媒為水，不溶于水的受試物可使用植物油(如橄欖油、玉米油等），不溶于水或油的受試物亦可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液或糊狀物等。受試物應(yīng)新鮮配制，有資料表明其溶液或混懸液儲(chǔ)存穩(wěn)定者除外。應(yīng)每日在同一時(shí)間灌胃1次，根據(jù)母體體重調(diào)整灌胃體積。灌胃體積一般不超過10mL/kg體重，如為水溶液時(shí)，最大灌胃體積可達(dá)20mL/kg體重；如為油性液體，灌胃體積應(yīng)不超過4mL/kg體重；各組灌胃體積一致。試驗(yàn)期間，每天觀察試驗(yàn)動(dòng)物的體征、行為活動(dòng)、采食和飲水情況。每周至少稱1次體重，并同時(shí)計(jì)算采食量。10.2受孕檢查雌、雄大鼠按1:1（或2:1）同籠后，每日早晨檢查籠底有無(wú)陰道栓（石蠟狀圓柱體）或用浸濕生理鹽水的棉簽取陰道分泌物涂布于滴有1滴生理鹽水的玻片上，置低倍顯微鏡下檢查有無(wú)精子。發(fā)現(xiàn)陰道栓或精子的當(dāng)天定為孕期的0d。對(duì)于家兔，雌兔和雄兔合籠后陰道涂片檢查到精子當(dāng)日作為"受孕"零天。將檢出的"受孕動(dòng)物"隨機(jī)分到各組，并稱重和編號(hào)。一般每組應(yīng)獲得13~15只受孕動(dòng)物，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)妊娠母獸數(shù)不少于12只。10.3母體觀察和稱重每日對(duì)動(dòng)物進(jìn)行臨床觀察，包括皮膚、被毛、眼睛、黏膜、呼吸、神經(jīng)行為、四肢活動(dòng)等情況，及時(shí)記錄各種中毒體征，包括發(fā)生時(shí)間、表現(xiàn)程度和持續(xù)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)虛弱或?yàn)l死的動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行隔離或處死，母體有流產(chǎn)或早產(chǎn)征兆時(shí)應(yīng)及時(shí)剖檢。孕鼠于孕期的0d、7d、14d和20d稱重，以觀察孕鼠的體重變化，隨時(shí)注意記錄孕鼠的狀況。若通過飲水途徑給予受試物，還應(yīng)記錄飲水量。孕兔或其它動(dòng)物稱重時(shí)間根據(jù)各自孕期長(zhǎng)短確定。5GB/T21035－202×10.4受孕母體處死和檢查10.4.1一般檢查于分娩前1天(一般大鼠為孕第20天、家兔為孕第28天)處死母體，沿腹中線剖開腹腔，取出子宮。剖腹檢查親代受孕情況和胎體發(fā)育。迅速取出子宮，稱量子宮連胎重，以得出妊娠動(dòng)物的凈增重。記錄黃體數(shù)、早死胎數(shù)、晚死胎數(shù)、活胎數(shù)及著床數(shù)。10.4.2活胎檢查（以胎鼠為例）逐個(gè)記錄活胎鼠體重、性別、體長(zhǎng)，外觀檢查頭顱外形、面部、軀干、四肢等有無(wú)畸形，包括，露腦、腦膨出、眼部畸形（小眼、無(wú)眼、睜眼等）鼻孔擴(kuò)大，單鼻孔、唇裂、脊柱裂，四肢及尾畸形等等，見表1。表1致畸試驗(yàn)活胎外觀檢查項(xiàng)目部位檢查項(xiàng)目部位檢查項(xiàng)目部位檢查項(xiàng)目頭部無(wú)腦軀干部胸骨裂腦膨出胸部裂無(wú)肢頂骨裂脊椎裂短肢腦積水腹裂半肢小頭癥脊椎側(cè)彎顏面裂脊椎后彎無(wú)趾小眼癥臍疝并趾眼球突出尿道下裂短趾無(wú)耳癥無(wú)肛門缺趾小耳癥短尾、卷尾耳低位無(wú)尾無(wú)顎癥小顎癥下顎裂10.4.3骨骼標(biāo)本制作與檢查（以胎鼠為例）骨骼標(biāo)本制作方法一：將每窩1/2的活胎放入95%乙醇中固定2周～3周，取出胎仔，流水沖洗數(shù)分鐘后放入10g/L～20g/L的氫氧化鉀溶液內(nèi)(至少5倍于胎仔體積)8h～72h，透明后放入茜素紅應(yīng)用液中染色6h～48h，并輕搖1次/d～2次/d，至頭骨染紅為宜。再放入透明液A中1d～2d，放入透明液B中2d~3d，待骨骼染紅而軟組織基本褪色。6GB/T21035－202×骨骼標(biāo)本制作方法二(剝皮法)：將胎鼠去皮、去內(nèi)臟及脂肪后，放入茜素紅溶液染色，當(dāng)天搖動(dòng)玻璃瓶2次～3次，待骨骼染成紅色時(shí)為止。將胎仔換入透明液A中1d～2d,換入透明液B中2d～3d。待胎鼠骨骼已染紅，而軟組織的紫紅色基本褪去，可換置甘油中。胎仔骨骼檢查：將骨骼標(biāo)本放入小平皿中，用透射光源，在體視顯微鏡下作整體觀察，然后逐步檢查骨骼。測(cè)量頭頂間骨及后頭骨缺損情況，然后檢查胸骨的數(shù)目、缺失或融合(胸骨骨化中心為5個(gè)，劍突1塊；骨化不全時(shí)首先缺第5胸骨、次為缺第2胸骨),肋骨通常12對(duì)～13對(duì)，常見畸形有融合肋、分叉肋、波狀肋、短肋、多肋(常見14肋)、缺肋、肋骨中斷。脊椎發(fā)育和椎體數(shù)目(頸椎7個(gè)，胸椎12個(gè)~13個(gè)，腰椎5個(gè)～6個(gè)，底椎4個(gè)，尾椎3個(gè)～5個(gè))，有無(wú)融合、縱裂等。最后檢查四肢骨。見表2。表2致畸試驗(yàn)胎仔骨骼檢查項(xiàng)目部位檢查項(xiàng)目枕骨骨化中心缺失脊椎骨數(shù)目、形狀異常、融合、縱裂、部分裂開、骨化中心缺失、縮窄、脫離骨盆骨化中心缺失、形狀異常、融合、裂開、縮窄、脫離四肢骨數(shù)目、形狀異常腕骨骨化中心缺失掌骨形狀異常形狀異常肋骨數(shù)目、形狀異常、融合、分叉、缺損胸骨數(shù)目、融合、骨化中心缺失10.4.4內(nèi)臟檢查（以胎鼠為例）將每窩1/2的胎鼠放入鮑因固定液（4.2）中，兩周后作內(nèi)臟檢查。先用自來水沖去固定液，將鼠仰放在石蠟板上，剪去四肢和尾，用刀片從頭部到尾部逐段橫切或縱切。觀察不同切面器官的大小、形狀和相對(duì)位置。切面制作參見圖1~圖5。a）經(jīng)口從上腭與舌之間向枕部橫切（切面1），可觀察大腦、間腦、正腦、舌及顎裂。b）從眼眶前緣垂直縱切（切面2），可觀察鼻道、鼻中隔。c）從頭部經(jīng)眼球中央垂直縱切（切面3），可觀察眼球、視網(wǎng)膜、嗅球。d）從頭部最大橫位處縱切（切面4），可觀察大腦及腦室。e）沿下顎水平穿過頸部橫切（切面5），可觀察舌、咽、氣管、食管和延髓。以后自腹中線剪開胸、腹腔，依次檢查心、肺、橫膈膜、肝、胃、腸等臟器的大小、位置，查畢將其摘除，再檢查腎臟、輸尿管、膀胱、子宮和睪丸位置及發(fā)育情況。然后將腎臟切開，觀察有無(wú)腎盂積水與擴(kuò)大等。見表3。GB/T21035－202×表3致畸試驗(yàn)胎仔內(nèi)臟檢查項(xiàng)目部位檢查項(xiàng)目部位檢查項(xiàng)目部位檢查項(xiàng)目嗅球發(fā)育不全胸部主動(dòng)脈弓腹部多囊腎側(cè)腦室擴(kuò)張食道閉鎖馬蹄腎第三腦室擴(kuò)張氣管狹窄腎積水8GB/T21035－202×頭部（脊髓）無(wú)腦癥無(wú)肺癥腎缺失無(wú)眼球癥多肺癥膀胱缺失小眼球癥肺葉融合睪丸缺失角膜缺損卵巢缺失單眼球氣管食管瘺卵巢異位內(nèi)臟異位子宮缺失右位心子宮發(fā)育不全房中隔缺損輸卵管積水室間隔缺損肝分葉異常腎上腺缺失對(duì)非嚙齒類動(dòng)物，如家兔，應(yīng)對(duì)所有的胎仔均進(jìn)行骨骼和內(nèi)臟的檢查，其檢查程序參照大鼠進(jìn)行。11統(tǒng)計(jì)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)整理每只動(dòng)物的資料并將試驗(yàn)結(jié)果列表，包括試驗(yàn)開始時(shí)體重、各試驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)，子代動(dòng)物數(shù)、試驗(yàn)過程中死亡或人為處死的動(dòng)物數(shù)、受孕動(dòng)物數(shù)、臨床中毒表現(xiàn)和出現(xiàn)中毒體征的動(dòng)物數(shù)。胎仔的觀察結(jié)果，包括畸形類型及其他相關(guān)信息。用合理的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)下述指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：母體體重、體重增重（處死時(shí)母體體重-孕6d體重）、子宮連胎重、體重凈增重（處死時(shí)母體體重－子宮連胎重－孕6d體重）、著床數(shù)、黃體數(shù)、吸收胎數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)及百分率、胎仔的體重及體長(zhǎng)、有畸形的胎仔數(shù)（包括外