AbMoleTGS1 與人類端粒酶 RNA：探索端粒維持的關(guān)鍵機(jī)制

AbMole|TGS1與人類端粒酶RNA：探索端粒維持的關(guān)鍵機(jī)制端粒酶在維持端粒長(zhǎng)度和穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵作用，而TGS1介導(dǎo)的人類端粒酶RNA（hTR）的2,2,7-三甲基鳥苷（TMG）加帽結(jié)構(gòu)對(duì)于將端粒酶招募到端粒以及參與Cajal體（CBs）在端粒維持中的作用至關(guān)重要。來(lái)自DipartimentodiScienzedellaVita，UniversitàdegliStudidiTrieste的ValentinaBuemi,OdessaSchillaci,MariangelaSantorsola等多名研究人員發(fā)表了題為《TGS1mediates2,2,7-trimethylguanosinecappingofthehumantelomeraseRNAtodirecttelomerasedependenttelomeremaintenance》的研究成果。在該文章中，研究人員使用了購(gòu)自AbMole的TC-S7001（目錄號(hào)M7388）。文章探討TGS1在端粒維持中的作用及其機(jī)制。通過(guò)酶抑制或瞬時(shí)siRNA介導(dǎo)的敲低，在H1299肺癌細(xì)胞和肺腺癌衍生的腫瘤類器官中消除TGS1功能。結(jié)果顯示，TGS1敲低導(dǎo)致H1299細(xì)胞中hTR的2,2,7-TMG加帽減少5倍，而天然核苷sinefungin處理H1299細(xì)胞10天，可使TGS1蛋白水平逐漸降低，hTR的2,2,7-TMG加帽顯著減少4倍，同時(shí)不影響TRF2和肌動(dòng)蛋白等mRNA的加帽。在獨(dú)立的肺癌模型中，從手術(shù)切除的人肺腺癌生成的腫瘤類器官實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果，即sinefungin處理導(dǎo)致TGS1蛋白減少，但mRNA不變。圖1：臨床前肺癌模型中TGS1阻斷2,2,7-TMG加帽的抑制作用。sinefungin處理或TGS1敲低的H1299細(xì)胞及腫瘤類器官中，CB數(shù)量顯著減少，端粒與剩余CB的關(guān)聯(lián)也顯著降低，表明TGS1缺失會(huì)損害基于CB的端粒維持途徑。通過(guò)TRAP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H1299細(xì)胞中瞬時(shí)RNAi介導(dǎo)的TGS1耗盡或sinefungin處理后，體外端粒酶活性顯著增加，同時(shí)hTR表達(dá)略有增加，但hTERT、TRF2或TRF1的表達(dá)在蛋白質(zhì)或mRNA水平上不受影響。在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hTERT的H1299細(xì)胞克?。╟lone-9）和同時(shí)過(guò)表達(dá)FLAG-hTERT和hTR的H1299細(xì)胞克?。╟lone-22）中，TGS1瞬時(shí)敲低顯著減少了FLAG-hTERT與端粒的共定位頻率，hTRRNA-FISH結(jié)合抗TRF2免疫熒光顯示TGS1敲低細(xì)胞中端粒酶RNA組分向染色體末端的募集顯著減少，sinefungin處理的clone-22細(xì)胞中FLAG-hTERT向端粒的募集也受到抑制。圖2：TGS1指導(dǎo)涉及Cajal體的端粒酶依賴性端粒維持。對(duì)H1299細(xì)胞和肺腫瘤類器官進(jìn)行定量DNA-FISH（Q-FISH）分析顯示，TGS1敲低或sinefungin處理10天后，G豐富的端粒鏈長(zhǎng)度增加10%和15%，而C豐富的端粒鏈長(zhǎng)度分別減少38%和42%，恢復(fù)TGS1功能后，端粒長(zhǎng)度變化恢復(fù)正常。在H1299細(xì)胞模型中，急性RNAi介導(dǎo)的hTERT耗盡也會(huì)導(dǎo)致G豐富和C豐富端粒鏈長(zhǎng)度的改變，與sinefungin處理或TGS1耗盡的H1299細(xì)胞相似。TGS1敲低和sinefungin處理均導(dǎo)致H1299細(xì)胞和肺腫瘤類器官中PML體數(shù)量增加，PML體與端粒的共定位頻率增加，提示TGS1功能喪失促進(jìn)了APB的形成，這是ALT細(xì)胞的關(guān)鍵特征。TGS1缺失導(dǎo)致的端粒姐妹染色單體交換（T-SCE）率顯著增加，而siRNA介導(dǎo)的RAD51耗盡可將TGS1敲低的H1299細(xì)胞中增加的T-SCE頻率恢復(fù)到對(duì)照水平。TGS1抑制端粒酶陽(yáng)性癌細(xì)胞中的ALTsiRNA介導(dǎo)的TGS1耗盡導(dǎo)致端粒處的DNA:RNA雜合體水平增加，磷酸化ATR（Ser428）在端粒的定位增加，RAD51募集到端粒，RAD51在PML體中的定位增加，BLM焦點(diǎn)與端粒標(biāo)記TRF1的共定位頻率增加，C-環(huán)形成增加。圖3：TGS1抑制端粒酶陽(yáng)性癌細(xì)胞中的ALT。在H1299細(xì)胞中，TGS1缺失導(dǎo)致G豐富的端粒鏈增加，C豐富的端粒鏈長(zhǎng)度減少，而同時(shí)缺失TGS1和EXO1時(shí)，這種端粒長(zhǎng)度變化得到恢復(fù)。EXO1缺失還挽救了TGS1敲低的H1299細(xì)胞中CB體數(shù)量和CB與端粒的共定位頻率，消除了端粒向PML體的增加定位。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，sinefungin和5-Aza-2′-脫氧胞苷聯(lián)合處理增加了sinefungin處理的H1299細(xì)胞中的APB數(shù)量，增強(qiáng)了BLM螺旋酶向端粒的募集和C-環(huán)形成，使C豐富的端粒鏈長(zhǎng)度增加53%，G豐富的端粒鏈長(zhǎng)度增加40%，同時(shí)提高了DNA聚合酶δ亞基POLD3向端粒的募集，提示ALT介導(dǎo)的端粒延伸。本研究表明，TGS1介導(dǎo)的hTR的2,2,7-TMG加帽在將端粒酶復(fù)合物引導(dǎo)至染色體末端以及使CB參與端粒維持方面起著關(guān)鍵作用。TGS1缺失或被sinefungin抑制會(huì)阻斷端粒酶向端粒的招募，導(dǎo)致EXO1介導(dǎo)的單鏈3'端粒突出的形成，進(jìn)而參與RAD51依賴性同源重組和APB形成。端粒酶陽(yáng)性的H1299細(xì)胞和肺腫瘤類器官中TGS1敲低細(xì)胞的端粒單鏈改變與端粒酶陰性ALT細(xì)胞中的經(jīng)典端粒特征相關(guān)，如DNA:RNA雜合體負(fù)載增加、復(fù)制應(yīng)激、RAD51和BLM募集到端粒重復(fù)序列、APB形成、端粒姐妹染色單體交換率升高以及C-環(huán)豐度增加等。總之，TGS1依賴的hTR的2,2,7-