TCAAA 108-2023 規(guī)?；H場馬皰疹病毒8型感染診斷技術(shù)

規(guī)模化驢場馬皰疹病毒8型感染診斷技術(shù)2023-10-10發(fā)布2023-11-30實施中國畜牧業(yè)協(xié)會發(fā)布IT/CAAA108—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國畜牧業(yè)協(xié)會提出并歸口。本文件起草單位：聊城大學(xué)、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、西北農(nóng)林科技大學(xué)、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所、山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院、新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所、赤峰學(xué)院、聊城市畜牧獸醫(yī)局、東阿阿膠股份有限公司、東阿阿膠阜新科技開發(fā)有限公司、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、內(nèi)蒙古草原御驢科技牧業(yè)有限公司、陜西佳縣佳米驢畜牧業(yè)養(yǎng)殖有限公司、新疆金胡楊牧業(yè)有限公司、禹城惠民農(nóng)業(yè)科技有限公司、陽谷縣榮發(fā)牧業(yè)有限公司。張燕、董建寶、肖海霞、王懷棟、陳建興、何飛、嵇傳良、于杰、楊濤、吳海青、白晉宇、王高平、張建玲、賈濤、張繼強(qiáng)。1T/CAAA108—2023規(guī)?；H場馬皰疹病毒8型感染診斷技術(shù)本文件規(guī)定了馬皰疹病毒8型診斷的試劑和材料、儀器和設(shè)備、診斷和綜合判定方法，并給出了治療建議。本文件適用于規(guī)?；R場或驢場馬皰疹病毒8型的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和檢測。2規(guī)范性引用文件僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。馬皰疹病毒8型equineherpesvirus8又稱為驢皰疹病毒3型(AHV-3),該病毒主要導(dǎo)致馬屬動物呼吸道疾病、流產(chǎn)和腦脊髓炎等癥狀，是一種嚴(yán)重危害馬屬動物健康的病原。4縮略語下列縮略語適用于本文件。AHV-3:驢皰疹病毒3型(Asinineherpesvirus3)CPE:細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathiceffect)DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4’,6-diaminyl-2-phenylindolinedihydrochloride)EHV-8:馬皰疹病毒8型(Equineherpesvirus8)FBS:胎牛血清(FetalBovineSerum)5試劑和材料5.2商品化Taqpremix酶。5.3PCR引物序列參見附錄A。5.4商品化培養(yǎng)基MEM,FBS。5.5青霉素、鏈霉素，配制參見附錄B。5.9磷酸鹽緩沖液(PBS),配制參見附錄B。5.11商品化DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Maker。5.1210%甲醛固定液，配制參見附錄B。5.13商品化二甲苯。5.140.25%胰蛋白酶，配制參見附錄B。5.153%H?O?-甲醇，配制參見附錄B。2T/CAAA108—20235.16鼠源EHV-8陽性血清，制備方法參見附錄C。6儀器和設(shè)備6.1PCR擴(kuò)增儀。6.2電泳儀和電泳槽。6.3凝膠成像儀。6.4恒溫水浴鍋。6.5超低溫冰箱。6.6細(xì)胞培養(yǎng)箱。6.7倒置顯微鏡。6.8離心機(jī)。6.9石蠟切片機(jī)。7診斷7.1臨床癥狀7.1.1呼吸道型引發(fā)鼻肺炎，食欲不振，常見癥狀初期流出大量漿狀鼻液繼而轉(zhuǎn)變?yōu)槟撔员且?，鼻黏膜、眼結(jié)膜出現(xiàn)廣泛充血，下頜淋巴結(jié)腫大，病驢體溫升高至40℃以上，同時血液中白細(xì)胞數(shù)量明顯減少，整個病程可持續(xù)2周～3周，感染嚴(yán)重的因呼吸困難而死亡。7.1.2流產(chǎn)和新生驢駒死亡型妊娠驢多表現(xiàn)為隱性感染，引發(fā)突發(fā)流產(chǎn)，該類型疾病的潛伏期長短不一繼發(fā)細(xì)菌感染而導(dǎo)致死亡。7.1.3神經(jīng)性腦炎型患病驢出現(xiàn)發(fā)熱，神情呆滯，突然共濟(jì)失調(diào)、感覺障礙，四肢僵硬、倒地抽搐、后肢癱瘓和完全癱瘓等，個別驢出現(xiàn)腦脊髓炎等神經(jīng)癥狀，嚴(yán)重時會導(dǎo)致死亡。7.2病理變化肺臟和腦組織出現(xiàn)明顯的病理損傷，肺臟表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎、出現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤、出血和肺泡間隔增厚，肺泡周圍伴有結(jié)締組織增生。腦組織非化膿性腦炎并出現(xiàn)神經(jīng)元水腫。7.3病毒分離7.3.1樣品采集活驢用鼻拭子采集或全血取樣，也可用病死驢的肺臟或流產(chǎn)驢的胎盤、臍帶、胎兒組織等病料。7.3.2操作方法取適量EHV-8陽性的組織病樣，加入PBS借助組織研磨儀勻漿，放入5mL離心管，反復(fù)凍融3次，4000rpm離心10min,收集上清后加入1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，經(jīng)0.45μm濾膜除菌后，取1mL過濾液接種到單層RK-13細(xì)胞中，試驗設(shè)置空白對照組，37℃吸附2h后，加入適量2%FBSMEM,放置培養(yǎng)箱3d～5d,每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。7.3.3結(jié)果判定若接種RK-13細(xì)胞未出現(xiàn)CPE,應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代，若盲傳后沒有CPE出現(xiàn)，則判定為陰性。若RK-13細(xì)胞出現(xiàn)CPE,可懷疑EHV-8感染陽性，應(yīng)立即用PCR檢測進(jìn)行確診。3T/CAAA108—20237.4PCR檢測將采集組織樣品包括驢的鼻拭子、血液及病死驢的肺、流產(chǎn)胎兒等組織器官，加入無菌PBS研磨勻漿，5000g離心15min,收集100μL上清液借助商品化病毒DNA提取試劑盒制備DNA,凍存?zhèn)溆谩?.4.2PCR檢測。設(shè)置空白對照(以水為模版)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min;個循環(huán)；72℃延伸10min,4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%核酸膠進(jìn)行分析，設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Maker作為對照，待電泳結(jié)束，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。7.4.3測序分析將待測樣品擴(kuò)出的陽性片段克隆到pMD18-T載體送生物公司測序。7.4.4結(jié)果判定若電泳結(jié)果顯示，待測樣品擴(kuò)增出大小為316bp的核酸片段，則初步判定EHV-8核酸陽性，同時空白對照沒有條帶，否則視為無效。若測序的結(jié)果與GenBank提供的標(biāo)準(zhǔn)序列同源性大于90%,則判定為EHV-8感染陽性，否則判定為EHV-8感染陰性。7.5間接免疫熒光檢測7.5.1操作方法將EHV-8標(biāo)準(zhǔn)毒株和待鑒定的樣品分別接種RK-13細(xì)胞，待病變達(dá)到50%～70%,用預(yù)冷的75%乙漂洗3次，每次5min,分別孵育鼠抗EHV-8陽性血清和陰性血清，設(shè)置空白對照，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育1h。PBS漂洗3次，每次5min,加入綠色熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗(1:5000),置于恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min。加入DAPI染細(xì)胞核2min后，PBS漂洗3次后，借助倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。7.5.2結(jié)果判定7.5.2.1若EHV-8陰性鼠血清與空白對照細(xì)胞均無著色，且鼠抗EHV-8陽性血清與標(biāo)準(zhǔn)毒株感染細(xì)胞反應(yīng)為綠色熒光，則判定陰性對照、陽性對照成立。7.5.2.2在符合7.5.2.1的條件下，若待鑒定樣品毒感染細(xì)胞與鼠抗EHV-8陽性血清反應(yīng)為綠色，則7.6免疫組織化學(xué)檢測7.6.1樣品采集采集疑似EHV-8感染的病死驢的肺、胎盤、流產(chǎn)胎兒等組織，按NY/T541規(guī)定的方法執(zhí)行。摘取組織后迅速放入10%甲醛固定液中，根據(jù)組織塊大小確定固定時間，期間更換一次固定液。7.6.3切片制作修整已固定好的組織塊，大小一般為0.5cm×0.5cm×0.5cm,用流水沖洗修整好的組織塊8h~24h,然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟包埋和切片，具體程序如下：70%酒精(2h)→80%酒精(2h)→85%酒精(1h)→90%酒精(40min)→95%酒精(40min)→100%酒精I(xiàn)(30min)→100%酒精Ⅱ(30min)→酒精+二甲苯(1:1)(5min)→二甲苯I(5min)→二甲苯II(5min)→石蠟I(1h)→石蠟Ⅱ(1h)→修塊→切片(厚度為5μm～7μm)。7.6.4組化染色4T/CAAA108—2023二甲苯I(15min)→二甲苯IⅡ(15min)→100%酒精I(xiàn)(2min)→100%酒精Ⅱ(2min)→95%酒精I(xiàn)(2min)→95%酒精Ⅱ(2min)→85%酒精(2min)→75%酒精(2min)→蒸餾水洗(2min)→3%H?O?-甲醇溶液(30min)→PBS洗(5min×3次)→0.25%胰蛋白酶(37℃20min)→PBS洗(5min×3次)→5%BSA(37℃30min)→鼠源EHV-8陽性血清作為一抗(濕盒，4℃過夜),PBS代替一抗作為陰性對照)→PBS洗(5min×3次)→HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗(濕盒，37℃60min)→PBS洗(5min×3次)→DAB顯色(在鏡下控制顯色劑顯色時間)→自來水終止反應(yīng)→蘇木素復(fù)染→95%酒精(3min×2次)→100%酒精(3min×2次)→二甲苯透明(5min×2次)→中性樹膠封片。7.6.5結(jié)果判定普通顯微鏡觀察如組織細(xì)胞中有棕黃色的著色點(diǎn)則判定為陽性，陰性對照無棕黃色著色。8綜合判定若病驢出現(xiàn)呼吸困難，流產(chǎn)和腦脊髓炎等癥狀，且出現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎病理變化或病毒性腦炎，則9隔離與治療對于發(fā)病的驢應(yīng)立即隔離，采取對癥治療措施，及時淘汰EHV5(資料性)A.1PCR引物(5’→3’)EHV-8-gG-F:TCAGACTGTCACTCGTGGGAEHV-8-gG-R:CCTGAAGGCCGTTTAACACAA.2EHV-8gG基因參考序列(大小為316bp)TCAGACTGTCACTCGTGGGAGTCATACACCTATCCAAATACGCTGAGGCAGGCCACCGGACCCCAGACCTTGTTGGTAGGTGCAGTTGGACTCAGAATCTTGGCTCAGGCATGGAAGTTTGTTGGTGATGAAACGTACGACACCATCCGCGCAGAAGCAAAAAATCTAGAGACCCACGTACACTCCAGTGCAGCGGATTCGTCTTCCGAAAACCAATTGTCGCAGGAAAACGTAAACATTCCCGAAGTTGCCCACCTGCGAAGCTGCCAAAACGAAGACAATGCACACACAGGGGGTGTGTTAAACGGCCTTCAGG6T/CAAA108—2023(資料性)試劑及其配制B.1青霉素-鏈霉素溶液：氨芐青霉素G鈉鹽、硫酸鏈霉素過濾。硫酸鏈霉素100mg/mL:稱取5g硫酸鏈霉素粉末，加入50mL滅菌水，溶解后用0.22μm濾膜過濾。B.2磷酸鹽緩沖液(PBS):1LPBS(pH7.4)配方磷酸二氫鉀(KH?PO?):0.27g,磷酸氫二鈉(Na?HPO?):1.42g,氯化鈉(NaCl):8g,氯化鉀(KCl)0.2g,加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙猓缓蠹尤霛恹}酸調(diào)pH至7.4,最后定容到1L。B.310%甲醛固