土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

探究?實(shí)踐土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)重慶市優(yōu)質(zhì)課程資源重慶市優(yōu)質(zhì)課程資源提出問題基礎(chǔ)知識(shí)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)操作提示結(jié)果分析提出問題（實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌。（2）統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌?；A(chǔ)知識(shí)（實(shí)驗(yàn)原理）絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2組分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0gH2O定容1000mL該選擇培養(yǎng)基的配方見右表。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)請同學(xué)們閱讀教材19頁資料，思考有關(guān)問題，小組合作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，寫出詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，交流修正?！举Y料一】土壤取樣細(xì)菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距地表3~8cm的土壤層。因此，取樣時(shí)一般要鏟去表層土。在城市，常見的是公園里、街道旁、花盆中的土壤；在農(nóng)村，則容易收集到農(nóng)田或菜園里的土壤。你打算選擇什么樣的土壤做實(shí)驗(yàn)?zāi)兀俊举Y料二】樣品的稀釋

測定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用1×104、1×105和1×106倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。測定土壤中細(xì)菌的總量和能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？如果不同，你打算選用多大的稀釋范圍？

第一次做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，可以將稀釋的范圍放寬一點(diǎn)。例如，可以將1×103~1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)為30~300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)?！举Y料三】微生物的培養(yǎng)與觀察不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在30~37℃的溫度下培養(yǎng)1~2d。本實(shí)驗(yàn)中，我們可以每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。請仔細(xì)觀察你所分離到的菌落，最好以表格的形式將不同菌落的特征（如形狀、大小和顏色等）記錄下來。實(shí)驗(yàn)方案展示：實(shí)驗(yàn)步驟（1）土壤取樣①取樣地點(diǎn)：育才中學(xué)崇藝館前的草地②取樣過程：鏟去表層土，再取土樣，將樣品裝入紙袋③注意事項(xiàng)：取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。（2）制備培養(yǎng)基①選擇培養(yǎng)基：以尿素為唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：作為對照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用（3）樣品的稀釋與涂布平板（稀釋涂布平板法）（3）樣品的稀釋與涂布平板（稀釋涂布平板法）（3）樣品的稀釋與涂布平板（稀釋涂布平板法）每個(gè)濃度至少設(shè)置4個(gè)平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組，三個(gè)重復(fù)），4為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。（3）樣品的稀釋與涂布平板（稀釋涂布平板法）

注意事項(xiàng)：本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標(biāo)記。例如，在標(biāo)記培養(yǎng)皿時(shí)應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。（4）微生物的培養(yǎng)與觀察如何驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌？設(shè)置2個(gè)平板作為空白對照：未接種的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基①將1個(gè)未接種的選擇培養(yǎng)基平板、1個(gè)未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板與3個(gè)接種后的平板一起放入恒溫培養(yǎng)箱（30~37℃）中培養(yǎng)。②隨著時(shí)間延長，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，觀察記錄菌落的特征（形狀、大小和顏色等），選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。平板菌落數(shù)形狀顏色大小1234未接種操作提示010304設(shè)置對照0205火焰旁稀釋土壤樣液做好標(biāo)記制定計(jì)劃火焰旁取樣操作提示小組思考，討論交流1.結(jié)合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。2.你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30～300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個(gè)平板的菌落數(shù)接近？

如果沒有接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。如果得到了兩個(gè)或多個(gè)菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。小組思考，討論交流3.你統(tǒng)計(jì)的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？

如果是用同一土樣進(jìn)行的操作，數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。4.小結(jié)內(nèi)容現(xiàn)象結(jié)論有無雜菌污染的判斷對照的培養(yǎng)皿中無菌落生長選擇培養(yǎng)基中菌落數(shù)偏高菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目樣品的稀釋操作得到3個(gè)或3個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板重復(fù)組的結(jié)果未被雜菌污染被雜菌污染培養(yǎng)基中混入其他氮源選擇培養(yǎng)基具有篩選作用操作成功若選取同一種土樣，統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)接近展示匯報(bào)，交流互評評價(jià)表：項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)科學(xué)性（20分）實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)謹(jǐn)性（20分）實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性（20分）小組分工合理性（15分）結(jié)果表達(dá)清晰度（15分）實(shí)驗(yàn)報(bào)告美觀性（10分）合計(jì)第一組第二組第三組……進(jìn)一步探究：分解尿素細(xì)菌的進(jìn)一步鑒定細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，