DB12T 652-2016 轉基因耐除草劑大豆DAS-68416-4及其衍生品種定性檢測 實時熒光PCR法

67.050B

23

DB12天 津 市 地 方 標 準DB12/T

652—2016轉基因耐除草劑大豆

DAS-68416-4

及其衍生品種定性檢測

PCR

法Detection

of

plants

and

—Qualitative

method

herbicide-resistant

soybean

and

derivates2016-09-27

發(fā)布 2016-11-01

實施天津市市場和質量監(jiān)督管理委員會發(fā)布DB12/T

652—2016 本標準按照

GB/T

—

給出的規(guī)則起草。本標準由天津市農村工作委員會提出。本標準起草單位：天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所、中國農業(yè)科學院生物技術研究所、天津市東麗區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗所。本標準主要起草人：蘭青闊、李亮、趙新、劉雪巖、宛煜嵩、王成、陳銳、朱珠、劉娜、徐石勇。本標準

年

9

月首次發(fā)布。DB12/T

652—2016

DAS-68416-4

PCR

1 范圍本標準規(guī)定了轉基因耐除草劑大豆

DAS-68416-4

轉化體特異性的定性

PCR

檢測方法的術語和定義、檢測方法、結果分析與表述。本標準適用于轉基因耐除草劑大豆

DAS-68416-4

DAS-68416-4

轉化體成分的定性

PCR

檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法農業(yè)部

1485

4—2010 轉基因植物及其產品成分檢測

DNA

農業(yè)部

2031

8—2013 轉基因植物及其產品成分檢測

大豆內標準基因定性

PCR

法農業(yè)部

2031

19—2013 轉基因植物及其產品檢測

NY/T

轉基因植物及其產品檢測

通用要求3 術語和定義農業(yè)部

2031

8—2013

界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1Lectin

Lectin

編碼大豆凝集素的基因。3.2DAS-68416-4

轉化體特異性序列

sequence

DAS-68416-4DAS-68416-4

外源插入片段

5′端與大豆基因組的連接區(qū)序列。4 原理根據轉基因耐除草劑大豆DAS-68416-4DNA進行PCR擴增。依據是否擴增獲得典型的實時熒光擴增曲線，判斷樣品中是否含有

5 檢測方法5.1

試劑和材料除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合

GB/T

6682

規(guī)定的一級水。5.1.1

熒光定量

PCR

反應試劑盒。5.1.2 引物和探針。DB12/T

652—20165.1.2.1

基因。lec-1215F：5′′lec-1332R：5′′lec-1269P：5′′預期擴增片段大小為

（參見附錄

A）。5.1.2.2

DAS-68416-4

轉化體特異性序列。DAS-68416-4-F：5'-

-

3'：

-

3'：5'

-

3'預期擴增片段大小為

128

（參見附錄

A

10

μmol/L需避光保存。5.2 儀器

0.1

g

和

0.1

PCR

儀；其他相關儀器設備。5.3 分析步驟5.3.1 按

NY/T

672

和農業(yè)部

2031

號公告—19—2013

規(guī)定執(zhí)行。5.3.2 試樣準備按

NY/T

672

和農業(yè)部

2031

號公告—19—2013

規(guī)定執(zhí)行。5.3.3 試樣預處理按農業(yè)部

1485

號公告—4—2010

規(guī)定執(zhí)行。5.3.4 DNA

模板制備按農業(yè)部

1485

號公告—4—2010

規(guī)定執(zhí)行。5.3.5 PCR

反應5.3.5.1 標準樣品和試樣實時熒光

PCR

同時進行標準樣品和試樣的

PCR

反應，每個

PCR

反應設置

3

次平行。DAS-68416-4

轉化體實時熒光

PCR

1

在

PCR

Lectin內標基因實時熒光

PCR

反應按表

2

在

PCR

反應管中依次加入反應試劑，混勻。將

PCR

管放在離心機上，500

g~3

g

離心

10

s

PCR

PCR

熒光

PCR

反應。（反應程序為：94℃變性

5

；進行

45

次循環(huán)擴增反應（94

15

s，60℃退火延伸

1

）；（60

1×10

DAS-68416-4-F0.8

2.0

10

DAS-68416-4-R0.8

2.0

10

DAS-68416-4-P0.4

.0

2.0

25.0

表示體積不確定。根據

25.0

1×10

lec-1215F0.2

0.5

10

lec-1332R0.2

0.5

10

lec-1269P0.2

0.5

.0

25.0

表示體積不確定。根據

25.0

DB12/T

652—2016表

1 DAS-68416-4表

1 DAS-68416-4

PCR

反應體系表

2 Lectin

PCR

反應體系在試樣

PCR

反應的同時，應設置陰性對照、陽性對照和空白對照。以非轉基因大豆基因組DNA質量分數為0.1%~1.0%的基因組

DNA（或采用

與非轉基因大豆基因組相比的拷貝數分數為

0.1%~1.0%的DNA

溶液）作為陽性對照；以水作為空白對照。各對照

PCR

反應體系中，除模板外，其余組分及

PCR

反應條件與

5.3.5.1

6 結果分析與表述6.1 Lectin內標準基因無典型擴增曲線，表明樣品中未檢出大豆成分，結果表述為“樣品中未檢測出大豆成分，檢測結果為陰性”。6.2 LectinCt值≤38DAS-68416-4轉化體特異性序列出現典型Ct值≤因耐除草劑大豆轉化體成分，檢測結果為陽性”。DB12/T

652—20166.3 LectinCt值≤38DAS-68416-4轉化體特異性序列未出現典型擴增曲線，表明樣品中未檢測出DAS-68416-4轉化體成分，結果表述為“樣品中未檢測出轉基因耐除草劑大豆DAS-68416-4

轉化體成分，檢測結果為陰性”。6.4 Lectin

/或

轉化體特異性序列出現典型擴增曲線，但

Ct

值在

～之間，進行重復實驗。如重復實驗結果符合

～

的情形，依照

6.1～6.3

進行判斷。如重復實驗檢

Ct

值仍在

38～

內標準基因和/或轉化體特異性序列，根據檢出參數情況，參照

～

對樣品進行判定。DB12/T

652—2016附錄A（資料性附錄）A.1 Lectin基因實時熒光PCR擴增產物核苷酸序列（Accession

No.K00821）1

CCACATTTGG

CCGGTAGCGT

TGCCAGCTTC61

GCCGCTTCCT

CTTCTATGCC

AAAGGCTTGC

AGATGGGC

A.2耐除草劑大豆DAS-68416-4轉化體特異性序列1 GGGCCTAACT