ELISA基礎(chǔ)知識(shí)和注意事項(xiàng)

2024/9/23ELISA基礎(chǔ)知識(shí)和注意事項(xiàng)2024/9/23

類(lèi)容ELISA的基本原理和相關(guān)概念特別說(shuō)說(shuō)捕獲法ELISA結(jié)果的影響因素ELISA結(jié)果的處理2024/9/23ELISA的基本原理和相關(guān)概念將抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體后,這種酶標(biāo)抗原或抗體既能保留與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合的免疫活性,又同時(shí)保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率,因此可放大抗原抗體反應(yīng)效果,從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感性。2024/9/23ELISA的基本原理抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后,仍然能保持其免疫學(xué)活性而能相互特異性結(jié)合。2024/9/23抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)的二抗結(jié)合,加入合適的底物在酶的作用下顯色,顏色的深淺與特異性抗體水平成比例關(guān)系,可進(jìn)行定性和定量分析。

2024/9/23ELISA的分類(lèi)測(cè)抗原:競(jìng)爭(zhēng)法（也可用于測(cè)抗體）、雙抗體夾心法。測(cè)抗體:間接法、捕獲法、雙抗原夾心法2024/9/23競(jìng)爭(zhēng)法elisa競(jìng)爭(zhēng)法ELISA原理——標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合,標(biāo)本中的抗原含量越多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少,顯色越淺。要用于小分子抗原或半抗原的定量測(cè)定,也可對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定。2024/9/23

包被特異性抗體

酶標(biāo)抗原檢測(cè)抗原孵育洗滌后顯色加樣AB競(jìng)爭(zhēng)法ELISA3.顯色3.孵育1.加樣2024/9/23

雙抗體夾心法雙抗體夾心法ELISA——將特異性抗體包被于固相載體表面,與標(biāo)本中相應(yīng)抗原相結(jié)合,洗滌后再加入酶標(biāo)的第二特異性抗體與抗原結(jié)合,加入底物后顯色。檢測(cè)測(cè)抗原要有至少具有2個(gè)抗原決定簇2024/9/23包被特異性抗體雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)抗原1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色酶標(biāo)特異性抗體2024/9/23雙抗原夾心法雙抗原夾心法ELISA——檢測(cè)標(biāo)本中的總抗體（包括IgM和IgG型抗體）。將特異性抗原包被于固相載體表面,與標(biāo)本中特異性IgM和IgG型抗體結(jié)合,洗滌后加入酶標(biāo)的特異性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合,洗滌后加入底物顯色2024/9/233.洗滌1.加樣2.孵育6.顯色5.孵育4.加入酶標(biāo)抗原雙抗原夾心法ELISA2024/9/23間接法間接法ELISA（IndirectELISA）——將特異性抗原包被于固相載體表面,與標(biāo)本中相應(yīng)特異性抗體結(jié)合,洗滌后再加入酶標(biāo)的抗人IgG或IgM抗體與之結(jié)合,洗滌后加入底物顯色。酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類(lèi)免疫球蛋白分子只需要變換包被抗原,就可用一種酶標(biāo)二抗檢測(cè)各種與抗原結(jié)合的抗體2024/9/231.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色間接法ELISA2024/9/23捕獲法ELISA（CaptureELISA）——專(zhuān)門(mén)用來(lái)檢測(cè)IgM型抗體的方法。將抗人IgM抗體包被于固相載體表面,與標(biāo)本中所有人IgM抗體結(jié)合,洗滌后加入特異性抗原與相應(yīng)的特異性IgM抗體結(jié)合,洗滌后再加入酶標(biāo)的抗原特異性抗體與之結(jié)合,洗滌后加入底物顯色。2024/9/231.加樣2.孵育3.洗滌4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.顯色捕獲法ELISA2024/9/23

區(qū)別理解檢測(cè)抗原？抗體？包被什么？標(biāo)記什么？

2024/9/23間接法和捕獲法比較間接法:假陰性，假陽(yáng)性捕獲法:酶標(biāo)抗體的要求較高2024/9/23間接法的假陽(yáng)性麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM抗人酶標(biāo)IgM抗體類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性結(jié)果假陽(yáng)性結(jié)果2024/9/23間接法的假陰性麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM酶標(biāo)抗人IgM抗體陽(yáng)性結(jié)果假陰性結(jié)果2024/9/23ELISA的有關(guān)名詞概念質(zhì)控血清:質(zhì)控血清是為了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購(gòu)置也可以自配。自己配制時(shí)要注意選用無(wú)脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽(yáng)性對(duì)照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對(duì)結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標(biāo)本不一致，應(yīng)該注意對(duì)結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動(dòng)，不可用于標(biāo)定儀器或評(píng)價(jià)方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質(zhì)控品。2024/9/23室內(nèi)質(zhì)控:實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。室間質(zhì)評(píng):用于考核各個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國(guó)家級(jí)和地方級(jí)的室間質(zhì)評(píng)?？梢岳斫鉃椤案鱾€(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評(píng)比”。2024/9/23臨界值（CUTOFF值）:臨界值是判斷陰陽(yáng)性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測(cè)定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定的。許多試劑都會(huì)給出臨界值或臨界值的計(jì)算方法。本底:就是底色。如ELISAHBsAg，陽(yáng)性顯色，陰性不顯色，本底就是整個(gè)陰性顯色的情況。ELISA抗–HBcAb，陽(yáng)性不顯色，陰性顯色，本底就是整個(gè)陽(yáng)性顯色的情況。2024/9/23靈敏度:能檢測(cè)到的分析物的最小量，表示檢測(cè)下限的能力。相對(duì)靈敏度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）×100%測(cè)定方法及表示方法:靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、陽(yáng)性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)、血清盤(pán)（pannel）及臨床標(biāo)本陽(yáng)性率。2024/9/23特異性:真陰性標(biāo)本的檢出能力。相對(duì)特異性=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）×100%測(cè)定及表示方法:質(zhì)控血清、血清盤(pán)、臨床標(biāo)本陰性率。2024/9/23Elisa結(jié)果的影響因素

試劑盒的選擇標(biāo)本加樣與稀釋溫育洗版顯色質(zhì)控2024/9/23試劑盒的選擇

同行的試劑使用情況上級(jí)部門(mén)對(duì)試劑實(shí)際使用的綜合評(píng)價(jià)使用臨界值質(zhì)控血清進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)比較,選擇林敏度和準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)試劑盒2024/9/23標(biāo)本應(yīng)注意避免溶血在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃、超過(guò)一周測(cè)定的需－20℃保存盡量避免反復(fù)凍融（少量分裝）2024/9/23加樣和稀釋加樣本的準(zhǔn)確性（個(gè)人因素和實(shí)驗(yàn)條件）盡可能排除主關(guān)因素（盡可能用加樣槍,避免直接使用滴瓶）各種試劑盒標(biāo)本的稀釋使用,嚴(yán)格按照說(shuō)明是操作2024/9/23溫育

溫度水浴箱發(fā)硬板應(yīng)漂浮于水上或水面應(yīng)高于反應(yīng)板2024/9/23洗版

手洗洗板機(jī)（微孔液體殘留<2ul、浸泡時(shí)間>45s）2024/9/23顯色通常是A.B兩種液體，不穩(wěn)定，又顏色應(yīng)立即丟棄先加A后加B，顯色時(shí)間嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行終止后15內(nèi)比色2024/9/23質(zhì)控

室內(nèi)質(zhì)控血清即刻法2024/9/23ELISA試劑的常見(jiàn)問(wèn)題原因及其解決顯色淺,靈敏度低假陽(yáng)性多,本底高甚至花板重復(fù)性不好白板2024/9/23顯色淺靈敏度低序號(hào)原因解決方法1試劑盒運(yùn)輸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，受高溫天氣影響，酶的活性降低。試劑運(yùn)輸過(guò)程加放足夠冰袋并盡可能縮短運(yùn)輸時(shí)間。2試劑盒（包括未用完的板條及其他組分）保藏條件不正確。試劑盒內(nèi)所有組分都應(yīng)當(dāng)在4℃冷藏，未使用完的板條要密封保存。3試劑盒使用時(shí)已超出有效期。過(guò)期試劑盒不可以使用。4溫育時(shí)間不夠。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。5恒溫箱溫度達(dá)不到37℃。注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。盡量避免頻繁開(kāi)關(guān)恒溫箱門(mén)。經(jīng)常注意水箱中合適的水位。在保證水不沒(méi)過(guò)酶標(biāo)板的前提下，使水位盡量高，以保證反應(yīng)溫度。2024/9/236加樣量不足；移液時(shí)抽吸排放過(guò)快，有氣泡、或吸頭內(nèi)殘留液體過(guò)多。經(jīng)常校正移液器。注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜過(guò)快，排放要完全。7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒。按照說(shuō)明書(shū)要求，先加入A液、后加入B液，并保證加入量。8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9試劑、樣品使用前未平衡至室溫。試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來(lái)后，要先平衡至室溫方可以使用。10試劑開(kāi)啟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，污染。試劑開(kāi)啟后應(yīng)該在盡可能短的時(shí)間內(nèi)用完，在保證正確貯存的前提最長(zhǎng)不要超過(guò)。12不同批號(hào)試劑中混用不同批號(hào)試劑不能混用2024/9/23假陽(yáng)性多,本底高甚至花板序號(hào)原因解決方法1試劑過(guò)期過(guò)期試劑不能使用2加樣時(shí)污染注意更換吸頭。盡可能避免污染。3加酶時(shí)污染對(duì)先加樣后加酶的操作，加酶時(shí)要注意吸頭不要接觸標(biāo)本，造成污染。當(dāng)可能造成污染時(shí)，一定要更換吸頭，切忌僥幸心理。4恒溫箱溫度過(guò)高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。5整個(gè)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、造成反應(yīng)時(shí)間不同（第一孔與最后一孔反應(yīng)時(shí)間相差很懸殊）。氣溫高時(shí)更明顯。在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成操作。盡量不要堆積多塊板子操作（尤其手工操作時(shí)）。2024/9/236洗液稀釋倍數(shù)過(guò)高按照要求倍數(shù)稀釋洗液7洗板次數(shù)不夠按試劑要求，不可任意減少洗板次數(shù)8洗板時(shí)浸泡時(shí)間不夠按要求操作，并適當(dāng)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。9手工洗板方式不正確洗板時(shí)，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗液要注滿(mǎn)板孔，并保證30-60秒的浸泡時(shí)間。10洗板機(jī)調(diào)試不正確或者有故障（可通過(guò)手工洗板判定）手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修。11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔。12顯色液B液被污染13顯色完后沒(méi)有終止反應(yīng)。顯色完立即終止反應(yīng)。2024/9/23重復(fù)性不好

1加樣量多少不一，操作時(shí)間長(zhǎng)短不一。重復(fù)同一樣品時(shí)，加樣量與加樣時(shí)間相同；同時(shí)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后應(yīng)該將酶標(biāo)板放置在微量振蕩器上，充分混合；標(biāo)本保證一致、無(wú)污染；盡可能由同一名操作人員操作。盡可能模擬相同的反應(yīng)條件。2加入標(biāo)本后沒(méi)有混勻。3重復(fù)實(shí)驗(yàn)的操作人員不同，操作習(xí)慣不同。4反應(yīng)時(shí)間、溫度等不相同。5標(biāo)本不同（被混淆或者處理不同）6精密度測(cè)定方法不標(biāo)準(zhǔn)采用正確的方法操作2024/9/23白板1忘記加酶嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。2忘記加顯色液3酶或A、