《甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程（征求意見稿）》

ICS65.020.20B15DB32甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程TechnicalregulationformoleculardetectionofAlternariabrassi（送審稿）江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布1本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布機(jī)構(gòu)不應(yīng)承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：余方偉、曾曉萍、李建斌、馬金俊、王神云、張偉、于利。2甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程中重組酶聚合酶擴(kuò)增方法的原理、試劑和材料、儀器設(shè)備、試驗(yàn)步驟和結(jié)果判定。本文件適用于甘藍(lán)類蔬菜葉片、花莖、角果等樣品中蕓薹生鏈格孢（Alternariabrassicicola）的室2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，標(biāo)注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不標(biāo)注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌基本信息中文學(xué)名：蕓薹生鏈格孢英文學(xué)名：Alternariabrassicicola分類地位：半知菌亞門，絲孢目，暗色菌科，鏈格孢屬。其菌落形態(tài)和孢子特征見附錄A。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）RPA重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinasepolymeraseamplification）ATP三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate）5原理重組酶聚合酶擴(kuò)增是一種快速分子檢測(cè)技術(shù)，主要依靠重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶在特定恒溫條件下實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)對(duì)靶標(biāo)序列的高效擴(kuò)增。RPA反應(yīng)開始時(shí)，重組酶在ATP的參與下結(jié)3合引物，形成重組酶-引物復(fù)合體。這些復(fù)合體能夠掃描與引物序列互補(bǔ)的目標(biāo)雙鏈DNA，然后侵入5'端位點(diǎn)，隨后單鏈結(jié)合蛋白與被置換單鏈結(jié)合使其穩(wěn)定。最后鏈置換DNA聚合酶結(jié)合在核酸蛋白復(fù)合體的游離3'端，進(jìn)行鏈延伸。以上步驟循環(huán)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)DNA數(shù)量的指數(shù)增長(zhǎng)。6試劑和材料除另有說明，本方法所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的規(guī)定。6.1.1RPA所用的引物序列見表1。表1引物序列擴(kuò)增片段大小AbF1AbR1CAGACATGAACACGCCAACATGACTAGACCGTGAGGCTTAGCGTAGAGTGTCAACGGTTC213bp6.1.2基因組DNA提取試劑盒。6.1.3RPA試劑盒。6.1.4DNA抽提液：Tris飽和酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1混合。6.1.550×TAE緩沖液。6.1.6瓊脂糖。6.1.7核酸染料。6.1.8DL2000DNAMarker。7儀器設(shè)備7.1電子天平，感量0.01g。7.2臺(tái)式低溫高速離心機(jī)。7.3微量移液器：最大量程分別為2.5μL、10μL、20μL、100μL和1000μL。7.4PCR儀。7.54℃冰箱和-20℃冰箱。7.6水平電泳儀。7.7凝膠成像儀。8試驗(yàn)步驟8.1樣品采集參照附錄A信息，采集疑似黑斑病的病樣，病樣可暫時(shí)保存于4℃冰箱，但不宜超過48h。48.2樣品處理取約100mg待檢測(cè)樣品置于液氮中充分研磨，使用基因組DNA提取試劑盒（CW0531M，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）提取基因組DNA，保存于-20℃冰箱備用。8.3RPA反應(yīng)以提取的疑似病株樣品組織DNA溶液為模板，采用DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（WLB8201KIT，濰坊安普未來生物科技有限公司）進(jìn)行RPA反應(yīng)。同時(shí)設(shè)置以下對(duì)照：陽性對(duì)照為添加蕓薹生鏈格孢基因組DNA溶液作為模板；陰性對(duì)照為添加健康甘藍(lán)類蔬菜葉片來源的基因組DNA溶液作為模板；空白對(duì)照為添加無菌水作為模板。檢測(cè)體系見表2。表2蕓薹生鏈格孢的RPA反應(yīng)體系組分體積(μL）Abuffer29.4AbF1（10μM）2AbR1（10μM）2DNA模板2ddH20Bbuffer2.5總體積50依次向反應(yīng)管中加入上述組分，充分混勻后置于PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)條件為38℃,30min。反應(yīng)結(jié)束后加入等體積DNA抽提液，4℃條件下以13200r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中。配制1×TAE緩沖液和1%瓊脂糖凝膠（每50mL瓊脂糖溶液中加入5μL10000×核酸染料用微量移液器各吸取5μLDL2000DNAMarker和10μL上清點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。9結(jié)果判定9.1試驗(yàn)成立條件陽性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無目的條帶，試驗(yàn)成立（參考附錄B）；如陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照任意一項(xiàng)不滿足以上條件，此次試驗(yàn)視為無效。9.2試驗(yàn)結(jié)果判定被檢樣品出現(xiàn)大小為213bp的條帶，判為檢出黑斑病菌，否則判為未檢出黑斑病菌。5A.1病菌生物學(xué)特性蕓薹生鏈格孢的菌落呈青褐色，氣生菌絲少，易產(chǎn)生孢子。分生孢子梗單生或簇生，常見直立生長(zhǎng)，少見屈膝狀彎曲。分生孢子常串生，倒棍棒狀，淡褐色至深褐色，具橫膈膜3~7個(gè)，縱、斜隔膜較少，僅0~3個(gè)，喙不發(fā)達(dá)，為單細(xì)胞短喙，孢子大小18~130μm×8~20μm。圖1蕓薹生鏈格孢菌落和孢子形態(tài)A.2黑斑病癥狀甘藍(lán)類蔬菜的葉片、花莖和角果均可發(fā)病。該病多發(fā)生在外葉上，發(fā)病初期在葉面上產(chǎn)生黑色小斑點(diǎn)，直徑3~7mm，同心輪紋不顯著。溫度高時(shí)，病斑迅速擴(kuò)大為灰褐色圓形病斑，直徑5～30m