解磷微生物研究進(jìn)展

解磷微生物研究進(jìn)展鄭琨共三十頁(yè)蘇北鹽堿灘涂土壤概況(gàikuàng)解磷微生物的種類(lèi)與分布解磷微生物的分離篩選解磷機(jī)制解磷能力的測(cè)定技術(shù)路線探討共三十頁(yè)一蘇北鹽堿灘涂(tāntú)土壤概況

江蘇沿海灘涂資源(zīyuán)總面積約65.24×104平方公里，由潮上帶(25.98×104平方公里)、潮間帶(26.57×104平方公里)及輻射沙脊群的出露沙洲(12.69×104平方公里)組成。江蘇海岸由砂質(zhì)海岸、基巖海岸、和淤泥質(zhì)海岸組成，以粉沙淤泥質(zhì)海岸為主，占全省海岸線長(zhǎng)度的90.5％共三十頁(yè)

江蘇海岸帶地勢(shì)開(kāi)闊，土壤類(lèi)型單調(diào)，海堤以外主要分布濱海鹽土類(lèi)，堤內(nèi)老墾區(qū)分布潮土類(lèi)。潮間帶的土壤為濱海鹽土(海堤外至零米線的地區(qū))，分為潮灘鹽土、草甸海濱鹽土和沼澤海濱鹽土三個(gè)亞類(lèi)。一般來(lái)說(shuō)，從潮灘鹽土到沼澤海濱鹽土，土壤呈現(xiàn)(chéngxiàn)含鹽量逐漸降低，有機(jī)質(zhì)含量逐漸升高的趨勢(shì)。

共三十頁(yè)開(kāi)發(fā)利用沿海灘涂土壤是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十分迫切和重要的任務(wù)。隨著耐鹽作物育成和耐鹽經(jīng)濟(jì)植物發(fā)現(xiàn)，這些植物的營(yíng)養(yǎng)狀況將成為今后解決的問(wèn)題。鹽堿土壤的另一特點(diǎn)(tèdiǎn)是可溶性有效磷含量低，絕大部分以難溶性磷酸鹽形式存在。而且鹽堿土壤一般無(wú)機(jī)鹽豐富，有機(jī)質(zhì)嚴(yán)重缺乏，土壤板結(jié)，不宜施無(wú)機(jī)肥。我國(guó)每年1/3的磷肥需要進(jìn)口，復(fù)合肥料和微生物肥料使用率不到30%（發(fā)達(dá)國(guó)家達(dá)到50%）。土壤中的解磷微生物，可將土壤中難溶磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物易吸收的可溶性磷，這為改善鹽土植物營(yíng)養(yǎng)狀況提供了出路。共三十頁(yè)二解磷微生物的種類(lèi)(zhǒnglèi)與分布解磷微生物(Phosphate-solubilizingmicrooganism，PSM)是一類(lèi)能夠?qū)⒅参镫y以吸收的磷轉(zhuǎn)化為可利用狀態(tài)的微生物，這類(lèi)解磷微生物除了可以活化土壤中難溶性的磷外，還可以通過(guò)(tōngguò)影響植物根系分泌物的種類(lèi)和數(shù)量，以增加植物根系對(duì)周?chē)鶮,Ca,Mg,Fe,Zn等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，使植物能夠適應(yīng)鹽堿缺磷的環(huán)境。共三十頁(yè)人們?cè)?0世紀(jì)初開(kāi)始注意到微生物與土壤磷之間的關(guān)系。Sackett(1908)發(fā)現(xiàn)一些難溶性的復(fù)合物施入土壤中，可以被作為磷源而應(yīng)用，他們從土壤中篩選出50株細(xì)菌，其中36株在平板上形成了肉眼可見(jiàn)的溶磷圈。1948年Gerretsen發(fā)現(xiàn)植物施入不溶性的磷肥，經(jīng)接種土壤微生物后，促進(jìn)了植株的生長(zhǎng)，增加磷的吸收。他分離出了這些微生物，發(fā)現(xiàn)這些微生物可幫助磷礦粉的溶解(róngjiě)。從此．許多科學(xué)家致力于解磷菌的研究，相繼報(bào)道了許多微生物具有解磷作用。共三十頁(yè)

解磷微生物(PSM)包括細(xì)菌、真菌和放線菌。目前報(bào)道的解磷細(xì)菌主要有芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、腸細(xì)菌屬(Enterbacter)、微球菌屬(Micrococcus)、固氮菌屬(Azotobacter)、沙門(mén)氏菌(shāménshìjūn)屬(Salmonella)、色桿菌屬(Chromobacterium)、產(chǎn)堿菌屬(Alcali—genes)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、硫氧化硫功菌(Thiobacillusthivoxidans)和多硫桿菌屬(Thiobacillus)等。

解磷真菌主要是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和根霉屬(Rhizopus)。而解磷放線菌則絕大部分為鏈霉菌屬(Streptomyces)。共三十頁(yè)按分解底物可以將解磷微生物分為兩類(lèi)：一類(lèi)是能夠分解無(wú)機(jī)磷化合物的稱為無(wú)機(jī)磷微生物(包括假單孢菌屬的一些種，無(wú)色桿菌屬的一些種，黃桿菌屬的一些種以及氧化硫硫桿菌);一類(lèi)是具有分解有機(jī)磷化合物能力的稱為有機(jī)磷微生物（包括芽孢桿菌屬的一些種，變形菌屬的一種，沙雷氏菌屬的一些種）。但由于解磷微生物解磷機(jī)理復(fù)雜(fùzá)，相當(dāng)一部分的解磷既能分泌有機(jī)酸溶解無(wú)機(jī)磷鹽，又能分泌磷酸酶物質(zhì)分解有機(jī)磷（包括節(jié)桿菌屬的一些種、鏈霉菌屬的一些種），因而很難準(zhǔn)確區(qū)分無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷微生物。共三十頁(yè)解磷微生物的分布表現(xiàn)出明顯的根際效應(yīng)(xiàoyìng)，主要表現(xiàn)在：根際土壤中的數(shù)量明顯高于非根際土壤。解磷菌表現(xiàn)出的強(qiáng)根際效應(yīng)可能與根圈磷素營(yíng)養(yǎng)虧缺誘導(dǎo)有關(guān)，但由于根圈微生物的群落結(jié)構(gòu)受根系分泌物及根脫落物的影響，導(dǎo)致不同植物根圈微生物的組成差別很大，這種作用也影響解磷菌的群落組成。共三十頁(yè)同時(shí)，不同的植被類(lèi)型(lèixíng)和不同的生態(tài)環(huán)境中，土壤解磷微生物的數(shù)量，種類(lèi)及菌群結(jié)構(gòu)也不同。林啟美(2000)等調(diào)查農(nóng)田、林地、草地和菜地等4種不同土壤生態(tài)環(huán)境中解磷菌數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)前3種土壤中的有機(jī)磷細(xì)菌只有菜地土壤的1／10，但農(nóng)田土壤中解磷細(xì)菌的總數(shù)所占比例并不低。耕地土壤有機(jī)解磷菌主要是芽孢桿菌屬，林地和菜地則主要是假單胞桿菌屬；無(wú)機(jī)磷細(xì)菌種類(lèi)比較少。共三十頁(yè)三解磷微生物的分離(fēnlí)篩選目前，分離解磷微生物的方法一般是根據(jù)在以磷酸三鈣為唯一磷源的平板(píngbǎn)上產(chǎn)生透明圈來(lái)確定。例如真菌無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：蔗糖2g、葡萄糖2g、NH4Cl1.5g、KCl0.3g、MgSO4.7H2O0.4g、NaCl0.2g、磷酸鈣20g，蒸餾水1000mL，pH7.0。如果篩選耐鹽解磷菌株，則需要根據(jù)實(shí)地鹽濃度在培養(yǎng)基中添加NaCl。共三十頁(yè)解磷微生物的篩選就是在分離出的具有解磷能力的所有菌株中篩選出具有最強(qiáng)解磷能力的菌株。一般來(lái)說(shuō)要以該解磷微生物將要應(yīng)用的實(shí)際環(huán)境(huánjìng)作為篩選實(shí)驗(yàn)的條件，即在與應(yīng)環(huán)境(huánjìng)相同的溫度，pH值，鹽度等條件下培養(yǎng)解磷微生物，以解磷能力最強(qiáng)（一般以培養(yǎng)基中有效磷含量最高為標(biāo)準(zhǔn)）的菌株作為最優(yōu)選擇。共三十頁(yè)四解磷機(jī)制(jīzhì)解磷微生物溶解難溶性磷化物的機(jī)制可歸結(jié)為以下幾類(lèi):(1)通過(guò)生命代謝活動(dòng)產(chǎn)生有機(jī)酸(細(xì)菌一般分泌乳酸、氨基酸、草酸、延胡索酸和檸檬酸等，真菌主要分泌草酸、丙二酸和乳酸等)，這些酸一方面直接(zhíjiē)溶解土壤中難溶性磷酸鹽，另一方面則是通過(guò)鰲合作用釋放出土壤磷素。(2)由NH4+同化作用放出質(zhì)子降低pH值，引起磷酸鹽溶解。(3)通過(guò)呼吸作用放出C02，降低環(huán)境pH值，從而引起磷酸鹽的溶解。(4)磷細(xì)菌釋放H2S，與磷酸鐵進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生硫酸亞鐵和可溶性磷酸鹽。(5)腐解植物殘?bào)w而產(chǎn)生胡敏酸和富里酸。這兩種酸能與復(fù)合磷酸鹽中的鈣、鐵鰲合，從而釋放出磷酸根。它們也能與鐵、鋁及磷酸鹽形成穩(wěn)定的可溶性復(fù)合物，這些復(fù)合物可以被植物吸收利用。(6)微生物對(duì)鈣離子的吸收，使磷酸根離子進(jìn)入土壤溶液。(7)生物礦化作用。即通過(guò)分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶等物質(zhì)，將磷酸脂等有機(jī)磷降解。共三十頁(yè)五解磷能力(nénglì)的測(cè)定解磷能力是表征解磷微生物作用的重要指標(biāo)，可采用定性法和定量法兩種方法測(cè)定。

定性法一般指的是平板溶磷圈法;

平板溶菌圈法:將溶磷菌株在含有難溶性磷酸鹽或有機(jī)磷的固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測(cè)定周?chē)洚a(chǎn)生透明圈的大小。無(wú)機(jī)磷平板一般采用磷酸鈣鹽固體培養(yǎng)基，接種菌株培養(yǎng)數(shù)天后，以磷酸鈣鹽平板上菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈的視為有解無(wú)機(jī)磷能力的菌株。有機(jī)磷平板一般采用卵黃平板培養(yǎng)基，以卵黃平板上菌落周?chē)霈F(xiàn)混濁圈的視為有解有機(jī)磷能力(卵磷脂被水解形成(xíngchéng)脂肪和磷酸)。

共三十頁(yè)溶磷圈直徑（D）和菌落生長(zhǎng)直徑(d)的比值(D/d)是表征(biǎozhēnɡ)解磷菌相對(duì)解磷能力的一個(gè)指標(biāo)。共三十頁(yè)定量(dìngliàng)法包括液體培養(yǎng)法、土培法、砂培法和同位素示蹤法。

液體培養(yǎng)法:將含解磷微生物和不溶性磷化物(如Ca3(P04)2)的培養(yǎng)液和對(duì)照(不含解磷微生物)培養(yǎng)一定時(shí)間后，測(cè)定培養(yǎng)液中可溶性磷的含量。但在液體培養(yǎng)法中如何將溶磷菌分解的無(wú)機(jī)磷浸提出來(lái)并加以測(cè)定，不同的研究者采用(cǎiyòng)的方法不同，總的可分為:培養(yǎng)液過(guò)濾法，離心取上清液法，熏蒸、消煮法等。對(duì)處理后的培養(yǎng)液中磷含量一般都采用(cǎiyòng)鉬藍(lán)比色法測(cè)定，其原理是利用一定的酸度條件下，加鉬酸銨于含磷的溶液中，溶液中的正磷酸與鉬酸絡(luò)合形成磷鉬雜多酸。H3PO4+12H2MoO4=H3[PMo12O40]+12H2O在適宜試劑濃度下，加入適當(dāng)?shù)倪€原劑(如抗壞血酸)，使磷鉬酸中的一部分Mo6+離子被還原為Mo5+，生成一種叫做“鉬藍(lán)”的物質(zhì)，當(dāng)將含不溶性無(wú)機(jī)磷的培養(yǎng)液經(jīng)鉬磷試劑處理后，培養(yǎng)液發(fā)生顯色反應(yīng)，通過(guò)比色法間接求出培養(yǎng)液中水溶性磷的含量。共三十頁(yè)

土培(或砂培)法:一般是通過(guò)接種解磷菌株到培養(yǎng)植物的土壤(或砂土)中，以不接種解磷菌的植株為對(duì)照，通過(guò)測(cè)定土壤浸提液中有效磷的含量來(lái)評(píng)定解磷菌株的解磷能力。砂培法通常也結(jié)合同位素示蹤法使用。

同位素示蹤法:在含標(biāo)記有32P的不溶性磷化合物(有機(jī)磷或無(wú)機(jī)磷)的培養(yǎng)基內(nèi)接種供試菌株，使菌體在培養(yǎng)過(guò)程中吸收32P，再用含32P的菌體(以含32P的不接種菌株培養(yǎng)基為對(duì)照)培育植物幼苗，測(cè)定該植株由標(biāo)記的菌體內(nèi)(tǐnèi)吸入的32P量比對(duì)照樣處理的增加量，即為該菌體的解磷量。共三十頁(yè)六技術(shù)(jìshù)路線探討共三十頁(yè)分子(fēnzǐ)鑒定傳統(tǒng)真菌菌種鑒定方法主要(zhǔyào)以形態(tài)學(xué)為依據(jù)，即通過(guò)培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)和個(gè)體顯微特征，將菌種鑒定到綱、門(mén)、科、屬、種。然而真菌的形態(tài)特征復(fù)雜，且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，因此，在傳統(tǒng)的真菌分類(lèi)中常引起分類(lèi)系統(tǒng)的不穩(wěn)定或意見(jiàn)分歧。在真菌的現(xiàn)代分類(lèi)學(xué)中引入了分子生物學(xué)技術(shù)鑒定方法，可以使菌種的鑒定在以形態(tài)特征和生理生化特征為基礎(chǔ)的鑒定上更加準(zhǔn)確、可靠。共三十頁(yè)目前用于未知菌分類(lèi)鑒定的核酸序列分析最常選用的目的片段是rDNA。真菌基因組中編碼核糖體的基因包括4種，28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA。它們(tāmen)在染色體上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。間隔區(qū)是位于核糖體大小亞基基因之間的核苷酸序列。位于28SrDNA的3’端與18SrDNA的5’端之間的序列稱為核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacers，ITS)，ITS1位于18SrDNA和5．8SrDNA之間，ITS2位于5.8SrDNA和28SrDNA之間(見(jiàn)圖1)共三十頁(yè)共三十頁(yè)rDNA是核基因組中的序列，受到細(xì)胞核中保護(hù)機(jī)制的保護(hù)，同時(shí)具有多變區(qū)和保守區(qū)，利用其保守區(qū)可以(kěyǐ)研究高級(jí)分類(lèi)階元關(guān)系，而利用多變區(qū)則也可研究種和種下關(guān)系。如核糖體DNA中18S，5.8S和28S的基因組序列在大多數(shù)生物中趨于保守，在生物種間變化小，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較小，相對(duì)變化較大，并且能夠提供詳盡的系統(tǒng)學(xué)分析所需要的可遺傳性狀。(技術(shù)路線)共三十頁(yè)發(fā)酵(fājiào)條件優(yōu)化發(fā)酵條件優(yōu)化一般分為兩步：第一步確定各個(gè)培養(yǎng)因子的最佳種類(lèi)，第二部確定各個(gè)最佳因子的最佳水平(shuǐpíng)。第一步一般采用分別確定各因子最佳種類(lèi)的方法。例如，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，選用同一水平的不同碳源（葡萄糖，蔗糖，淀粉，糖蜜，小麥麩皮等）培養(yǎng)微生物，根據(jù)結(jié)果（如菌體鮮重，解磷能力等）選擇出最佳碳源。共三十頁(yè)第二步一般采用正交實(shí)驗(yàn)的方法。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Orthogonalexperimentaldesign)是研究多因素多水平的又一種設(shè)計(jì)方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)(tèdiǎn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是是一種高效