實(shí)驗(yàn)1-光學(xué)顯微鏡的使用及顯微繪圖資料教程

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)12024/9/26光學(xué)顯微鏡的使用及顯微繪圖細(xì)胞膜的滲透性觀察液泡系的超活染色與觀察Feulgen反應(yīng)制作細(xì)胞DNA定性、定量測(cè)定樣品減數(shù)分裂的觀察植物染色體標(biāo)本的制備動(dòng)物染色體標(biāo)本的制備考馬斯亮藍(lán)染色顯示細(xì)胞骨架細(xì)胞凝集反應(yīng)及細(xì)胞吞噬細(xì)胞融合染色體分帶技術(shù)實(shí)驗(yàn)1

光學(xué)顯微鏡的使用

及顯微繪圖22024/9/26一、目的要求（1）熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和各部件性能。（2）掌握低倍鏡/高倍鏡的正確使用方法，掌

握油鏡的使用方法。（3）掌握顯微繪圖的基本方法（4）了解細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，動(dòng)物、植物和微

生物細(xì)胞的基本共性和特性32024/9/26二、儀器設(shè)備及材料1.光學(xué)顯微鏡/顯微照相系統(tǒng)（帶油浸物鏡）2.目鏡測(cè)微尺及鏡臺(tái)測(cè)微尺3.香柏油、二甲苯4.

永久裝片、擦鏡紙42024/9/26顯微照相系統(tǒng)62024/9/26三、顯微鏡的構(gòu)造1．機(jī)械部分支持和調(diào)節(jié)光學(xué)系統(tǒng)Charge-coupledDevice72024/9/26三、顯微鏡的構(gòu)造2．光學(xué)系統(tǒng)82024/9/26三、顯微鏡的構(gòu)造3．顯微鏡的能力

顯微鏡的能力是質(zhì)量和性能的標(biāo)志。能力包括分辨率、放大率、焦點(diǎn)深度和視場(chǎng)寬度等，其中最重要的是分辨率。R：分辨率（分辨的兩個(gè)點(diǎn)的最短距離），

R值愈小，分辨率越大。λ：照明光線的波長(zhǎng)(可見(jiàn)光平均波長(zhǎng)

約550nm）。N.A.：物鏡的鏡口率n：物鏡和被檢物體之間介質(zhì)的折射率α：物鏡的鏡口角（從物鏡光軸上的物點(diǎn)所發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑邊緣所張的角度）。92024/9/26表1在550nm光波下不同物鏡的分辨距離

放大倍數(shù)（×）1040100鏡口率（N.A.）0.280.651.25分辨距離（d）1μm0.42μm0.22μm102024/9/26科勒照明優(yōu)點(diǎn)：視場(chǎng)照明均勻，樣品不受熱，不產(chǎn)生耀眼眩光，影像清晰。

1893年德國(guó)杰出的學(xué)者AugustKohler提出柯勒照明法。其具體做法：在光源與聚光器之間，加放一光源聚光鏡和視場(chǎng)光闌，光源聚光鏡把光線集成光錐，使光源燈成像于聚光器的孔徑光闌平面處。同時(shí)，聚光器又使視場(chǎng)光闌成像在樣品平面處。由此充分地利用了照明光源，使點(diǎn)狀的光源達(dá)到較大的照明，從而使樣品得到均勻的照明，并防止了高溫。這對(duì)顯微攝影和鏡檢觀察至關(guān)重要。112024/9/26四、油鏡的原理油鏡（油浸系物鏡，通常有黑圈或Oil的標(biāo)志），以香柏油或石蠟油為介質(zhì)。這類油的折射率與玻璃的折射率大致相同。光線從被檢物體直接射入物鏡，其間因折射或反射而引起的光線損失很小，所以可以充分利用鏡口角，顯著提高物鏡的分辨率。油鏡（鏡口率一般在1.25左右）的分辨率在0.2

m左右，這就是光學(xué)顯微鏡的分辨極限。表1幾種物質(zhì)的折射率介質(zhì)空氣水石蠟油香柏油加拿大樹(shù)膠光學(xué)玻璃折射率（n）1.0031.331.471.5151.5151.54122024/9/26五、顯微鏡的使用方法使用顯微鏡的要領(lǐng)就是從低倍物鏡開(kāi)始觀察，先粗調(diào)后細(xì)調(diào)。

在低倍物鏡下找到要觀察的東西后，再逐步加大物鏡倍數(shù)，仔細(xì)觀察。132024/9/26低倍鏡的使用

（1）檢查：各部件有無(wú)損壞，如發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，立即報(bào)告教師請(qǐng)求處理。（2）準(zhǔn)備：將顯微鏡放于前方略偏左側(cè)以便觀察。打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，觀察底座的光路中是否有光亮。慢慢調(diào)節(jié)同一旋鈕，光線應(yīng)逐步增強(qiáng)。轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)鈕，將載物臺(tái)下降使物鏡與載物臺(tái)距離略拉開(kāi)。再旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，將低倍鏡4X對(duì)準(zhǔn)載物臺(tái)中央的通光孔（可聽(tīng)到“咔噠”聲）。（3）放標(biāo)本片：標(biāo)本片標(biāo)簽面向上，用標(biāo)本夾夾好，把要觀察的部分移到通光孔的正中央。（4）調(diào)節(jié)焦距：邊從目鏡中觀察，邊調(diào)節(jié)粗聚焦旋鈕，使載物臺(tái)緩慢上升，直至視野中出現(xiàn)物像為止。如物像不太清晰，可轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)鈕，使物像更加清晰。（5）換10X物鏡觀察。此時(shí)，只須稍稍調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕即可。142024/9/262024/9/2615低倍鏡的使用

如果按上述操作步驟仍看不到物像時(shí)，可能由以下原因造成：①轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)鈕太快，超過(guò)焦點(diǎn)。應(yīng)按上述步驟重新調(diào)節(jié)焦距。②物鏡沒(méi)有對(duì)正，應(yīng)對(duì)正后再觀察。③標(biāo)本沒(méi)有放到視野內(nèi)，應(yīng)移動(dòng)標(biāo)本片尋找觀察對(duì)象。④光線太強(qiáng)，尤其觀察比較透明的標(biāo)本片或沒(méi)有染色的標(biāo)本時(shí)，

易出現(xiàn)這種現(xiàn)象，應(yīng)將光線調(diào)暗一些后，再觀察。162024/9/26低倍鏡的使用

高倍鏡的使用如按上述操作仍看不到物像時(shí)，可能由下列原因造成：①觀察的部分不在視野內(nèi)，應(yīng)在低倍鏡下尋找到后，移到視野中央，再換高倍鏡觀察。②標(biāo)本片放反了，應(yīng)把標(biāo)本片放正之后，再按上述步驟操作。③焦距沒(méi)調(diào)好，應(yīng)仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距。如需要更換標(biāo)本片時(shí)，應(yīng)該先把載物臺(tái)下降，然后把標(biāo)本片移到載物臺(tái)前方，再取下。（1）依照低倍鏡操作步驟，先用低倍鏡找到清晰物像。（2）將需要觀察的部分移到視野的中央。（3）眼睛從側(cè)面注視物鏡，用手移動(dòng)轉(zhuǎn)換器，換高倍鏡40X。（4）眼睛向目鏡內(nèi)觀察，同時(shí)微微上下轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)鈕，直至視野內(nèi)看到清晰的物像為止。此時(shí)應(yīng)把聚光器的孔徑光闌適當(dāng)調(diào)大，使之與物鏡的鏡口率相匹配。光源的強(qiáng)度也應(yīng)調(diào)高。172024/9/26油鏡的使用應(yīng)先調(diào)低倍鏡、高倍鏡找到要觀察的物像，然后再用油鏡觀察，操作如下：（1）先用低倍鏡觀察標(biāo)本，然后更換高倍鏡，把待觀察的部分移到視野中央。（2）把載物臺(tái)下降約1.5厘米，再把油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。（3）在蓋玻片上所要觀察的位置滴一小滴香柏油。（4）細(xì)心擰動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，使載物臺(tái)慢慢上升。這時(shí)要仔細(xì)觀察物鏡前端與標(biāo)本之間的距離，先使物鏡前端與油滴接觸，然后再慢慢使載物臺(tái)上升，至物鏡前端接近而沒(méi)有碰到蓋玻片為止。這步操作要特別小心，防止油鏡壓碎標(biāo)本或損壞油鏡（油鏡的工作距離約0.2mm）。（5）眼睛要看目鏡中，擰動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋，使載物臺(tái)慢慢下降到能看清標(biāo)本。這步操作要特別注意不要把細(xì)調(diào)焦螺旋的方向擰錯(cuò)，以防壓碎標(biāo)本。（6）看清標(biāo)本后，把聚光器下的孔徑光闌開(kāi)到它的口徑與視場(chǎng)的直徑恰好一樣大，使聚光器的鏡口率與物鏡的鏡口率相配合。如果聚光器的鏡口率小于物鏡的鏡口率，則物鏡的鏡口率就不能充分發(fā)揮。（7）觀察完畢后，下降載物臺(tái)，把油鏡轉(zhuǎn)離光軸，立即作清潔工作。先用干的擦鏡紙擦一、二次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦兩次，最后再用干擦鏡紙擦一次。擦拭時(shí)要順鏡頭的直徑方向，不要沿鏡頭的圓周擦。擦拭要細(xì)心，動(dòng)作要輕，不可用力擦。如果聚光器上有滴油也要同樣清潔。載玻片上的油可用“拉紙法”擦凈，即把一小張擦鏡紙蓋在載玻片油滴上，在紙上滴一些二甲苯，趁濕把紙往外拉，這樣連續(xù)作3—4次，即可干凈。182024/9/26六、顯微鏡使用的注意事項(xiàng)

1．搬動(dòng)顯微鏡時(shí)，要一手握鏡臂，一手扶鏡座，兩上臂緊靠身體。切勿一手斜提或前后擺動(dòng)，不要發(fā)生太大震動(dòng)，以防鏡頭或其他零件跌落。2．觀察標(biāo)本時(shí)，顯微鏡離實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣應(yīng)保持一定距離(5cm)，以免顯微鏡翻倒落地。3．使用時(shí)要嚴(yán)格按步驟操作，熟悉顯微鏡各部件性能，掌握粗、細(xì)調(diào)節(jié)鈕的轉(zhuǎn)動(dòng)方向與載物臺(tái)升降關(guān)系。轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)鈕向下時(shí)，眼睛必須注視物鏡頭。4．觀察帶液體的臨時(shí)標(biāo)本時(shí)要加蓋玻片，以免液體污染鏡頭。5．粗、細(xì)調(diào)節(jié)鈕要配合使用，細(xì)調(diào)節(jié)鈕不能單方向過(guò)度旋轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)焦距時(shí)，要從側(cè)面注視載物臺(tái)，以免壓壞標(biāo)本和鏡頭。6．禁止隨意擰開(kāi)或調(diào)換目鏡、物鏡和聚光器等零件。7．顯微鏡光學(xué)部件有污垢，可用擦鏡紙或綢布擦凈，切勿用手指、粗紙或手帕去擦，以防損壞鏡面。8．凡有腐蝕性和揮發(fā)性的化學(xué)試劑和藥品，如碘、乙醇溶液、酸類、堿類等都不可與顯微鏡接觸，如不慎污染時(shí)，應(yīng)立即擦干凈。9．使用油鏡觀察樣品后，隨即用二甲苯將油鏡鏡頭和載玻片擦凈，以防其他的物鏡玻璃上沾上香柏油。二甲苯有毒，使用后馬上洗手。10．實(shí)驗(yàn)完畢，要將玻片取出，用擦鏡紙將鏡頭擦拭干凈后移開(kāi)，不能與通光孔相對(duì)。切不可把顯微鏡放在直射光線下曝曬。192024/9/26七、生物顯微繪圖對(duì)標(biāo)本進(jìn)行鏡檢后，對(duì)一些要重點(diǎn)掌握的內(nèi)容，需要及時(shí)繪圖記錄觀察結(jié)果。生物繪圖不同于一般的美術(shù)繪圖，要求將所觀察標(biāo)本的外形和內(nèi)部結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確地描繪，然后對(duì)各部分分別加以注字說(shuō)明。202024/9/26生物繪圖方法1．科學(xué)性和準(zhǔn)確性2．布局好3．線條均勻劃一4．圓點(diǎn)襯陰，以示深淺。5．圖注用鉛筆，用平行線引出。6．寫(xiě)明題目、圖題和放大倍數(shù)。212024/9/26222024/9/