支原體“現(xiàn)形記”：培養(yǎng)、指示、PCR

支原體“現(xiàn)形記”：培養(yǎng)、指示、PCR支原體，細(xì)胞培養(yǎng)人員的夢(mèng)魘，堪稱細(xì)胞培養(yǎng)界的“隱形殺手”。支原體就像慢性毒藥一樣，殺細(xì)胞于無形之中。經(jīng)常悄然潛入細(xì)胞培養(yǎng)體系，無聲無息的毀掉細(xì)胞。除了經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)室老手，一般人難以察覺支原體污染?？蒲蟹矫?，Nature、Cell等期刊高度重視細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的支原體檢測(cè)信息。目前許多國(guó)家有相關(guān)的法規(guī)，確保源于細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)品無支原體污染。因此，支原體檢測(cè)作為生物制品開發(fā)生產(chǎn)的重要質(zhì)控指標(biāo)，貫穿原材料、細(xì)胞庫、病毒種子庫、終產(chǎn)品等過程。接下來，我們將全方位歸納支原體污染的知識(shí)點(diǎn)，并揭開其神秘面紗，以便我們及時(shí)識(shí)別和處理支原體污染。防不勝防的支原體支原體（Mycoplasma）是目前發(fā)現(xiàn)是最小原核生物，大小為0.1-0.3μm，可以在過濾膜（0.22-0.45μm）自由穿梭，即常規(guī)過濾除菌對(duì)其無效。支原體無細(xì)胞壁，造成大多數(shù)抗生素對(duì)其無效?？股氐闹饕饔脵C(jī)制之一：抑制細(xì)胞壁合成。支原體細(xì)胞形態(tài)存在差異，有球形、桿狀、拉絲、分支等。常規(guī)顯微鏡難觀察到支原體的蹤跡和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡能觀測(cè)到。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的支原體污染（A.支原體模式圖；B.熒光顯微鏡下被污染的大鼠細(xì)胞，箭頭所示為支原體。源自參考文獻(xiàn)：doi:10.3390/cells12050682）支原體種類繁多，已超過180種，其中20多種能夠污染體外培養(yǎng)的細(xì)胞。但據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)室95%以上的支原體來自這6種：人源的口腔支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體，牛源的萊氏無膽甾原體和精氨酸支原體，以及豬源的豬鼻支原體。支原體不能被革蘭氏染色，可在瓊脂平板上形成“菌落”，并被甲基藍(lán)染色。支原體在瓊脂平板形成的“煎蛋菌落”（源自參考文獻(xiàn)：doi:10.1038/nprot.2010.43）支原體分布廣泛，附著在器皿表面，不需要寄生，在無生命的培養(yǎng)基中“自由”生長(zhǎng)繁殖，因此防不勝防。支原體污染的嚴(yán)重性支原體污染隱蔽性強(qiáng)。污染初期支原體與細(xì)胞共存，培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)沒有明顯變化，死亡率也不會(huì)增加，培養(yǎng)基不發(fā)生渾濁。等發(fā)現(xiàn)異常時(shí)，可能已經(jīng)多次傳代，難分清是在哪一代出現(xiàn)的污染。導(dǎo)致無法根治，只能從頭再來。支原體污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。支原體抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致染色體畸變，細(xì)胞抗原性改變，復(fù)蘇后存活率降低等。支原體污染還會(huì)影響細(xì)胞代謝和功能，造成細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、mRNA等合成障礙。支原體（橙色）可以包圍并感染細(xì)胞并使基因表達(dá)研究的結(jié)果無效（源自參考文獻(xiàn)：doi:10.1038/511518a）支原體污染增加成本。發(fā)現(xiàn)不及時(shí)往往意味著大量時(shí)間、精力和金錢的浪費(fèi)，尤其是對(duì)于生物制藥企業(yè)來說更是后果嚴(yán)重。支原體污染可能造成生物制品產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，甚至整批產(chǎn)品都需丟棄，生產(chǎn)車間也需停產(chǎn)整頓。細(xì)胞庫支原體檢測(cè)是生物制品工藝流程的重中之重。企業(yè)在細(xì)胞庫進(jìn)入GMP車間前，應(yīng)做好細(xì)胞庫支原體和病毒檢定，生產(chǎn)過程中完成對(duì)細(xì)胞收獲液的檢定。細(xì)胞庫一旦發(fā)生支原體污染，需要開展相應(yīng)調(diào)查，對(duì)所有可能風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域進(jìn)行清潔，并制定相應(yīng)預(yù)防措施，相應(yīng)區(qū)域無法開展生產(chǎn)工作。因此從細(xì)胞株構(gòu)建開始，就應(yīng)做好支原體檢測(cè)，從源頭杜絕污染。如何檢測(cè)支原體細(xì)胞培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)變緩、狀態(tài)變瘦、細(xì)胞黏連、出現(xiàn)拉絲鋪展等情況時(shí)，可能存在支原體污染。支原體污染可能來自操作人員和細(xì)胞培養(yǎng)用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能來自于本身已被污染的細(xì)胞系和毒種。支原體污染檢測(cè)技術(shù)常用的有：1.直接培養(yǎng)法：將待測(cè)樣品涂布在支原體固體培養(yǎng)基上，陽性會(huì)出現(xiàn)“煎蛋菌落”；2.指示細(xì)胞法：DNA熒光染色檢測(cè)法：污染的細(xì)胞染色后會(huì)看到細(xì)胞周圍有熒光小點(diǎn)或絲狀物；3.核酸檢測(cè)法（NAT）：常規(guī)PCR、qPCR，根據(jù)支原體基因組內(nèi)的保守序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)待檢樣品的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)直接培養(yǎng)法靈敏度高，可達(dá)1-10CFU/mL支原體·

培養(yǎng)期長(zhǎng)達(dá)28天·

存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)指示細(xì)胞法·

比培養(yǎng)法快

·

成本低·

靈敏度較低·

不適宜檢測(cè)粘附較差的口腔支原體和精氨酸支原體核酸檢測(cè)法（NAT）·

便捷快速

·

通量高·

靈敏度高

·

特異性好·

對(duì)樣本制備和DNA提取質(zhì)量依賴性大·

需驗(yàn)證與培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法的可比性?義翹神州支原體檢測(cè)解決方案1、支原體qPCR檢測(cè)試劑盒義翹神州支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（探針法）（貨號(hào)：MYC01），基于NAT原理，采用FAM、VIC兩種熒光探針，分別檢測(cè)目標(biāo)序列和內(nèi)參，可覆蓋169種支原體DNA序列。經(jīng)專屬性、檢測(cè)限、耐用性驗(yàn)證，已支持多個(gè)藥品申報(bào)。義翹神州支原體qPCR檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)★操作快速：樣本制備和檢測(cè)總時(shí)長(zhǎng)＜3h，無需苦等28天（直接培養(yǎng)法）★靈敏度高：滿足檢測(cè)限要求（10CFU/mL）★專屬性強(qiáng)：驗(yàn)證多個(gè)親緣物種、常用細(xì)胞系和樣本基質(zhì)，無交叉反應(yīng)貨號(hào)產(chǎn)品名稱特色MYC01支原體qPCR檢測(cè)試劑盒(探針法)覆蓋面廣、檢測(cè)限滿足要求、耐用性強(qiáng)RDP01磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒配套使用，節(jié)約時(shí)間和成本產(chǎn)品驗(yàn)證數(shù)據(jù)展示專屬性：驗(yàn)證充分?覆蓋全面：可檢測(cè)至少169種（120種支原體，9種脲原體、33種螺原體、7種無膽甾原體），覆蓋各國(guó)藥典要求的10種支原體。?無樣本基質(zhì)干擾：9種樣品基質(zhì)，1種細(xì)胞制劑凍存液，均未檢出支原體?無交叉：16種非柔膜菌綱菌株、12種工程細(xì)胞、2種哺乳動(dòng)物細(xì)胞（豬、鼠）。檢測(cè)限：滿足要求?口腔支原體10CFU/mL樣品的三次檢測(cè)，8個(gè)重復(fù)：24個(gè)陽性（檢測(cè)陽性率100%）耐用性：?20次凍融，37℃加速長(zhǎng)達(dá)30天，性能不受影響2、專業(yè)的支原體檢測(cè)服務(wù)義翹神州建立了北京和蘇州雙檢測(cè)中心，通過CMA和CNAS認(rèn)證，生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室完全按照GxP質(zhì)量體系管理，配套透射電鏡、共聚焦顯微鏡、熒光定量PCR儀等先進(jìn)儀器設(shè)備。義翹神州可依據(jù)藥典方法及ICH、FDA及其它監(jiān)管法規(guī)，為客戶提供最佳的檢測(cè)方案。出具的中英檢測(cè)報(bào)告獲得NMPA、FDA等監(jiān)管部門認(rèn)可，已助力多家知名公司完成IND和BLA申報(bào)。服務(wù)類型周期支原體檢測(cè)（培養(yǎng)法）6-8周支原體檢測(cè)（DNA染色法）6-8周支原體檢測(cè)（qPCR法）1-2周支原體檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證2-3月相關(guān)案例數(shù)據(jù)分享>支原體檢測(cè)服務(wù)（培養(yǎng)法）義翹神州提供符合法規(guī)要求的支原體檢測(cè)服務(wù)（培養(yǎng)法），靈敏度符合中國(guó)藥典要求，肺炎支原體達(dá)到10-9，口腔支原體達(dá)到10-5。>支原體檢測(cè)服務(wù)（DNA染色法）義翹神州提供符合法規(guī)要求的指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法），如果樣品被支原體污染，在熒光顯微鏡下除細(xì)胞外，可見大小不等、不規(guī)則的熒光著色顆粒?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1，Weiskirchen,etal.ABeginner’sGuidetoCellCulture:PracticalAdviceforPreventingNeedlessProblems.Cells2023./10.3390/cells120506822，Young,etal.DetectionofMy