第五章蛋白質課件

第五章蛋白質蛋白質的化學組成氨基酸蛋白質的結構蛋白質的性質蛋白質在加工貯藏中的變化蛋白質的測定5.1蛋白質的化學組成組成蛋白質的元素主要有C.H、O、N、S和P，

有些蛋白質還含有微量金屬元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，個別蛋白質還含有I。存在自然界中的氨基酸有300余種,但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種,且均屬L-氨基酸（甘氨酸除外）。

5.2氨基酸

1.構成蛋白質的20種氨基酸氨基酸的結構通式R氨基酸的分類

I脂肪類氨基酸

II芳香族氨基酸III雜環(huán)族氨基酸pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子氨基酸的化學性質（2）與金屬離子的整合作用（3）脫氨基、羧基反應（4）褐變反應（5）茚三酮反應在氨基酸分析中具有特殊意義的反應茚三酮反應茚三酮在弱酸性溶液中與α-氨基酸共熱,氨基酸被氧化成醛、CO2和NH3,最后茚三酮與反應產物──氨和還原茚三酮發(fā)生作用,生成藍紫色化合物。

兩個亞氨基酸──脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應形成黃色化合物。OH羥NH3CO2RCHO+還原性茚三酮+(弱酸)加熱3H20氨基酸與茚三酮反應水合性茚三酮+2NH3+水合性茚三酮還原性茚三酮藍紫色化合物

5.3蛋白質的結構蛋白質的分子結構包括

一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)一級結構

二級結構三級結構四級結構定義——1969年，國際純化學與應用化學委員會（IUPAC）規(guī)定:蛋白質的一級結構指蛋白質多肽連中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置。主要的化學鍵肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵一、蛋白質的一級結構2.一級結構的意義一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。目錄二、蛋白質的二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象

。定義

主要的化學鍵:氫鍵

蛋白質二級結構的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉角(

-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉,形成螺旋結構,螺旋一周,沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離為0.15nm;每個aa殘基沿軸旋轉100度.肽鏈內形成氫鍵,氫鍵的取向幾乎與軸平行,每個氨基酸殘基的C=O氧與其后第四個氨基酸殘基的N-H氫形成氫鍵。絕大多數天然蛋白質中的-螺旋幾乎都是右手螺旋。-螺旋都是由L-型氨基酸構成的（Gly除外）。

-螺旋及結構特點1.

-螺旋螺距0.54nm每殘基的軸向高度0.15nm每殘基繞軸旋轉100o2.

-折疊（-pleatedsheet）-折疊或-折疊片也稱-結構或-構象,它是蛋白質中第二種最常見的二級結構。-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列,通過鏈間的氫鍵進行交聯而形成的,或一條肽鏈內的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構象

-折疊-折疊結構幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。-折疊有兩種類型:一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反

-折疊的特點3.-轉角和無規(guī)卷曲

-轉角無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。無規(guī)則卷曲示意圖細胞色素C的三級結構無規(guī)則卷曲１）超二級結構在蛋白質分子中，由若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認的二級結構組合體。幾種類型的超二級結構:αα；ββ；βαβ；βββ．★超二級結構（在結構層次上高于二級結構，但沒有聚集成具有功能的結構域）ααβββαβ超二級結構和結構域超二級結構類型

X

纖維蛋白分子的結構域2）結構域大分子蛋白質的三級結構?？煞指畛梢粋€或數個球狀或纖維狀的區(qū)域,折疊得較為緊密,各行使其功能,稱為結構域(domain)。結構域的概念有三種不同而又相互聯系的涵義:即獨立的結構單位、獨立的功能單位和獨立的折疊單位。

2）結構域類型:α-螺旋域；β-折疊域；α+β域；α/β域；無規(guī)則卷曲+β-回折域；無規(guī)則卷曲+α-螺旋結構域結構域1結構域2-折疊-轉角二硫鍵-螺旋卵溶菌酶的三級結構中的兩個結構域三、蛋白質的三級結構疏水鍵、離子鍵、氫鍵和范德華力等。

主要的化學鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）定義維持蛋白質三級結構的作用力氫鍵:x—H…y疏水作用力:是指非極性基團即疏水基團為了避開水相而群集在一起的集合力范德華力:在物質的聚集狀態(tài)中，分子與分子之間存在著一種較弱的作用力離子鍵:它是由帶相反電荷的兩個基團間的靜電吸引所形成的二硫鍵:是兩個硫原子之間所形成的共價鍵目錄β-折疊β-轉角無規(guī)則卷曲

空穴α-螺旋2.三級結構的特征：含多種二級結構單元；有明顯的折疊層次；是緊密的球狀或橢球狀實體；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水側鏈埋藏在分子內部，親水側鏈暴露在分子表面。實例：肌紅蛋白肌紅蛋白血紅素輔基

肌紅蛋白(Mb)

N端C端抹香鯨肌紅蛋白（Myoglobin）的三級結構四、蛋白質的四級結構四級結構是指由兩個或兩個以上具有三級結構的多肽鏈按一定方式聚合而成的特定構象的蛋白質分子。其中每條多肽鏈稱為亞基。通常亞基只有一條多肽鏈,但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成,這些多肽鏈間多以二硫鍵相連亞基單獨存在時無生物學活性。一般來說具有四級結構的蛋白屬于寡聚蛋白。1.定義2.維持蛋白質四級結構的主要作用力在蛋白質四級結構中，亞基之間的作用力主要包括:氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水鍵。即亞基之間主要是通過次級鍵彼此締合在一起。疏水鍵是最主要的作用力。血紅蛋白四級結構血紅素輔基化學鍵共價鍵次級鍵肽鍵二硫鍵氫鍵疏水鍵鹽鍵范德華力一級結構二、三、四級結構三、四級結構蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵血紅蛋白的四級結構

蛋白質結構與功能的關系第三節(jié)一級結構是空間構象的基礎

牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵蛋白質一級結構與功能的關系研究蛋白質一級結構與功能的關系主要是:研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關系。進行這方面的研究常用的方法有:同源蛋白質氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學修飾及切割實驗等。

2.蛋白質一級結構的變異與分子病分子病—指蛋白質分子中由于AA排列順序與正常蛋白質不同而發(fā)生的一種遺傳病(基因突變造成的)。鐮刀形貧血病:病因:血紅蛋白AA順序的細微變化

-鏈N端氨基酸排列順序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…鐮刀形貧血病:病人體內血紅蛋白的含量乃至紅細胞的量都較正常人少，且紅細胞的形狀為新月形，即鐮刀狀。此種細胞壁薄，而且脆性大，極易漲破而發(fā)生溶血；再者，發(fā)生鐮變的細胞粘滯加大，易栓塞血管；由于流速較慢，輸氧機能降低，使臟器官供血出現障礙，從而引起頭昏、胸悶而導致死亡。正常紅細胞鐮刀形紅細胞正常紅細胞與鐮刀形紅細胞的掃描電鏡圖谷氨酸在生理pH值下為帶負電荷R基氨基酸,而纈氨酸卻是一種非極性R基氨基酸,就使得HbS分子表面的荷電性發(fā)生改變,引起等電點改變,溶解度降低,使之不正常地聚集成纖維狀血紅蛋白,致使紅細胞變形成鐮刀狀,輸氧功能下降,細胞脆弱易溶血.鐮刀型貧血?。ㄒ唬┘〖t蛋白與血紅蛋白的結構蛋白質空間結構與功能的關系一、兩性解離性質及等電點二、蛋白質膠體性質三、蛋白質的沉淀四、蛋白質的變性與復性五、蛋白質的紫外吸收特性六、蛋白質呈色反應第六節(jié)蛋白質的重要性質（一）蛋白質的兩性電離

蛋白質的理化性質

蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外,氨基酸殘基側鏈中某些基團,在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。*蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)當蛋白質溶液處于某一pH時,蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等,即成為兼性離子,凈電荷為零,此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。(二)蛋白質的膠體性質蛋白質屬于生物大分子之一,分子量可自1萬至100之巨,其分子的直徑可達1～100nm,為膠粒范圍之內,由于蛋白質的分子量很大它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質,如丁達現象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜,因此可以應用透析法將非蛋白小分子雜質除去。*蛋白質膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉蛋白質膠體性質的應用由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。透析法:以半透膜提純蛋白質的方法叫透析法半透膜:只允許溶劑小分子通過，而溶質大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等（三）蛋白質的變性、沉淀和凝固

*蛋白質的變性(denaturation)蛋白質的性質與它們的結構密切相關。某些物理或化學因素的作用下,能夠破壞蛋白質的特定空間構象,引起蛋也即有序的空間結構變成無序的空間結構,蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失。這種現象稱為蛋白質的變性.

造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質——破壞非共價鍵和二硫鍵,不改變蛋白質的一級結構。蛋白質沉淀蛋白質在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對的。如果加入適當的試劑使蛋白質分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產生沉淀。定義:蛋白質在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質就會從溶液中沉淀下來，此現象即為蛋白質的沉淀作用?？赡娉恋矶x:在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當的條件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。不可逆沉淀定義:在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀（次級鍵）、強酸堿沉淀（影響電荷）、重金屬鹽沉淀（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。鹽析在蛋白質的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質沉淀析出，這種現象稱為鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質溶液中，會導致蛋白質的溶解度增加，該現象稱為鹽溶。鹽析的機理:破壞蛋白質的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質沉淀方法，該方法不會使蛋白質產生變性。各種蛋白質的親水性及荷電性均有差別,因此不同蛋白質所需中性鹽濃度也有不同,只要調節(jié)中性鹽濃度,就可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分散沉淀析出,這種方法稱為分段鹽析。弱酸或弱堿沉淀法(等電點沉淀）用弱酸或弱堿調節(jié)蛋白質溶液的pH處于等電點處，使蛋白質沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機理:破壞蛋白質表面凈電荷。

有機溶劑沉淀法:在蛋白質溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質產生沉淀。有機溶劑沉淀法的機理:破壞蛋白質的水化膜。注意:有機溶液沉淀蛋白質通常在低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產生的溶解熱會使蛋白質產生變性。重金屬鹽沉淀(條件:pH稍大于pI為宜)當pH稍大于pI時，蛋白質顆粒帶負電荷這樣就容易與重金屬離子結合成不溶性鹽而沉淀。重金屬沉淀法的機理:重金屬鹽加入之后，與帶負電的羧基結合。

加熱變性沉淀法幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固。少量鹽促進蛋白質加熱凝固。當蛋白質處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速.如:煮雞蛋酶的制備:超氧化物歧化酶的提取蛋白質的變性與復性A.蛋白質的變性定義天然蛋白質因受物理、化學因素的影響，使蛋白質分子的構象發(fā)生了異常變化，從而導致生物活性的喪失以及物理、化學性質的異常變化。但一級結構未遭破壞，這種現象稱為蛋白質的變性。引起蛋白質變性的主要因素1.物理因素:加熱、高壓、紫外線照射、X-射線、超聲波、劇烈振蕩和攪拌等2.化學因素:強酸、強堿、脲、去污劑（十二烷基硫酸鈉（SDS））、重金屬鹽、三氯醋酸、濃乙醇等。蛋白質的變性后的表現生物活性喪失；溶解度降低,對于球狀蛋白粘度增加；光吸收系數增大；生物化學性質改變。組分和分子量不變。蛋白質變性的本質:分子中各種次級鍵斷裂，使其空間構象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級結構不破壞。變性后的蛋白質在結構上雖有改變，但組成成分和相對分子質量不變。蛋白質的復性定義:如果引起變性的因素比較溫和，蛋白質構象僅僅是有些松散時，當除去變性因素后，可根據熱力學原理緩慢地重新自發(fā)折疊恢復原來的構象，這種現象稱作復性。電泳蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒,在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術,稱為電泳(elctrophoresis)。根據支撐物的不同,可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。電泳蛋白質在等電點pH條件下,不發(fā)生電泳現象。利用蛋白質的電泳現象,可以將不同帶電性質和不同大小、形狀的蛋白質分子進行分離純化。根據蛋白質凈電荷的差異來分離蛋白質的一種方法是電泳法。幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳,通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的重要技術。蛋白質在遠紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收,在280nm有一特征吸收峰,可利用這一特性對蛋白質進行定性定量鑒定。蛋白質質量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260測定范圍:0.1～0.5mg/ml

蛋白質的紫外吸收

蛋白質的顏色反應⒈茚三酮反應(ninhydrinreaction)

蛋白質經水解后產生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。⒉雙縮脲反應(biuretreaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱,呈現紫色或紅色,此反應稱為雙縮脲反應,雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。蛋白質的顏色反應

雙縮脲反應酚試劑反應

蛋白質定量、定性

茚三酮反應

測定常用方法

另外還有:蛋白黃色反應、米倫氏反應、乙醛酸反應等。1.按組成成分分A.單純蛋白質－－單純蛋白不含有非蛋白質部分。這類蛋白質水解后的最終產物只有氨基酸。

單純蛋白質按其溶解性又可分為:清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白精蛋白、組蛋白以及硬蛋白等二、蛋白質的分類

B.結合蛋白質－－結合蛋白是指由單純蛋白和非蛋白成分結合而成的蛋白質.

按其非氨基酸成分又可分為:核蛋白、脂蛋白、磷蛋白、糖蛋白、血紅素蛋白、黃素蛋白、金屬蛋白2.按分子的形狀或空間構象

A.纖維狀蛋白－－分子很不對稱，形狀類似纖維。一般不溶于水。典型的有:膠原蛋白