高中生物二輪大-PCR 公開課

《二輪大專題—PCR專題》

【命題角度1]PCR的基礎(chǔ)知識(shí)

1.PCR的基本要點(diǎn)（表解）：

名稱及縮寫(1)▲、▲

目的(2)▲

原理(3)▲

前提(4)▲

(5)▲▲

(6)▲▲

反應(yīng)體系(7)▲▲

(8)▲▲

(9)▲、▲

(10)▲▲

反應(yīng)過程(11)▲▲

(12)▲▲

(13)▲長一中鏈：（14）▲

反應(yīng)結(jié)果中TO：（⑸▲

短~~^鏈：（16）▲

反應(yīng)設(shè)備(17)▲

PCR的操作要點(diǎn)(18)▲

2.PCR中圖解（3次循環(huán)）：

殳性停

3

3.PCR過程中使用的酶具備三個(gè)特點(diǎn):

①(19)_▲

②(20)_▲

③(21)_▲

4.PCR中的引物:

來源(22)_▲

作用及要求(23)_▲

類型(24)_▲

朝向(25)_▲

變化(26)_▲

［例1］近十年來，PCR技術(shù)（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用

DNA半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制（如圖），在很短的時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍

甚至幾十億倍，使實(shí)驗(yàn)所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體?；卮鹣铝袉栴}：

18*枚

juMSwT陣備至SST

DNA樣品單鏈DNA兩個(gè)完整的雙

引物與DNA游離脫輒核甘酸連

模板單鏈形成配蕤到DNA單鏈上鏈DNA什

對(duì)結(jié)構(gòu)

（1）加熱94℃目的是打開▲鍵，這一步稱為變性。

（2）當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板▲端結(jié)合,在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終

合成兩個(gè)DNA分子，此過程中原料是▲。

（3）PCR技術(shù)的必要條件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少還需要三個(gè)條件，即：液體環(huán)

境、適宜的▲和▲,前者由PCR儀自動(dòng)調(diào)控，后者則靠▲來維持。

（4）DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是▲。退火溫度的設(shè)置跟引物有關(guān)，若▲,退高溫度

可以高點(diǎn)；若退火溫度太低，會(huì)造成▲,不但會(huì)造成非目標(biāo)DNA片段多，而且會(huì)出現(xiàn)無

序擴(kuò)增。

（5）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有上（填序號(hào)：①升高退火

溫度②降低退火溫度③重新設(shè)計(jì)引物）。

［例2］1985年，穆利斯等人發(fā)明了PCR技術(shù)（即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA雙鏈復(fù)制的原理，

在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核甘酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。

回答下列問題：

（1）PCR反應(yīng)體系的緩沖液一般需要添加」以激活酶。設(shè)定的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃,5min；

94℃,30s；55℃,30s；72℃,Imin；30個(gè)循環(huán)。其中，設(shè)定94℃下5min的預(yù)變性處理，

目的是確?！?。

（2）PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物常采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在▲下

被檢測(cè)出來。若電泳結(jié)果不止一條帶，可能的原因有▲（答出1條）。

（3）PCR技術(shù)可用于基因工程四個(gè)步驟中的▲以及目的基因的檢測(cè)、鑒定。

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【命題角度2］反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)

起點(diǎn)是單鏈RNA,想以之為模板，通過PCR擴(kuò)增得到大量的相應(yīng)的、特定的DNA片段，而PCR

新的挑戰(zhàn)

使用的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶只能以DNA為模板

固有條件PCR擴(kuò)增儀、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、足量的dNTP、緩沖體系、M/+等陽離子

解決策略▲

［例1］以下是有關(guān)冠狀病毒的相關(guān)信息，請(qǐng)思考并回答:

(1)引起人類肺炎的某冠狀病毒(nCoV)是一市單鏈RNA病毒，其跨膜表面糖蛋白(GP)是該

病毒侵染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，科學(xué)家欲利目大腸桿菌作為受體菌批量生產(chǎn)GP以制備相關(guān)

疫苗，研發(fā)疫苗要在短時(shí)間內(nèi)大量快速生產(chǎn)采針可利用▲技術(shù)實(shí)現(xiàn)。從nCoV基因組中分

離出的nCoV—GP基因不能直接與質(zhì)粒重組,其原因是▲。

(2)為了使nCoVTJP基因和質(zhì)粒構(gòu)建----------------------------新電病毒的RNA

基因表達(dá)載體，必須經(jīng)過▲形成----------------------------新冠病毒的RNA

上再進(jìn)行擴(kuò)增兩個(gè)過程，示意圖C5----------------------------DNA.

如下。圖示過程中需要的酶有▲,<=)----------------------------DNA.

-------------------tZJ--------DNA

需要添加的原料為▲,如果圖中2

a---------------------------DNA.

共有N個(gè)箭頭(N>2),以DM1

----------------□-------DNA2

這條鏈為模板開始擴(kuò)增，共消耗CZJDNA.

；；

引物“I―I”▲個(gè)，共產(chǎn)生由CD-------------------DNA

DNA,和DNAs兩條鏈組成的DNA分子

▲個(gè)。

(3)若第(2)問中實(shí)驗(yàn)操作沒有失誤，PCR反4任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)

措施有▲(填序號(hào)：①升高退火溫度，C.度，③重新設(shè)計(jì)引物)，請(qǐng)說明選

擇以上改進(jìn)措施的原因▲。

［例2］我國公布的禁止進(jìn)境檢疫的有害生物煙草環(huán)斑病毒(TRSV)是RNA病毒。檢疫部門取煙草葉片進(jìn)

行該病毒的診斷和檢測(cè)，將待測(cè)樣品利用RTPCR技術(shù)(逆轉(zhuǎn)錄PCR,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的

優(yōu)勢(shì))擴(kuò)增樣品。下圖1是RTPCR技術(shù)的過程示意圖，圖2是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。請(qǐng)回答下

列問題:

一、待測(cè)樣品總RNA

圖2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

(1)圖1過程①表示利用RNA獲得cDNA,該過程需要▲酶的參與,過程②需要加入▲酶。

(2)待測(cè)樣品中RNA的提供者可能是▲和▲,也可能只是▲。

(3)圖1過程①需要加入引物P2,該引物是依據(jù)上的序列設(shè)計(jì)并生產(chǎn)的。過程②引物P2、P1

都需加入，理由是▲。

(4)已知圖2中電泳帶1是取自未感染的煙葉樣品電泳結(jié)果，電泳帶2是不同大小DNA的標(biāo)準(zhǔn)

參照，據(jù)圖分析可以得出的結(jié)論是上，理由是▲。

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【命題角度3］反向PCR（IPCR）

要通過PCR擴(kuò)增的不是已知序列的DNA片段，而是已知序列兩側(cè)的DNA片段，同向引物達(dá)不

新的挑戰(zhàn)

到擴(kuò)增的目的

固有條件PCR擴(kuò)增儀、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、足量的dNTP、緩沖體系、蛇2+等陽離子

解決策略▲

［例1］（2020年江蘇）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)

的序列，具體流程如圖（以EcoRI酶切為例）。請(qǐng)據(jù)圖回答問題：

染色體DNA

G：AATTC^I

I的切EcoRICTTAAiGJ

混合的DNA片段

、r未知序列己如序夕!r~[3'

未知序列b片段F

n連接|DNA連接酶

已知序列

PCR引物環(huán)狀DNA

用擴(kuò)增|hgDNA聚合?他

PCR產(chǎn)物

1\測(cè)序、分析|

y片段F的

完整序列

(1)步驟I用的EcoRI是一種▲酶,它通過識(shí)別特定的上切割特定位點(diǎn)。

(2)步驟H用的DNA連接酶催化相鄰核昔酸之間的3,一羥基與5—一磷酸間形成▲；PCR循

環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得▲；TaqDNA聚合酶的作用是催化▲。

(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟III選用的PCR引物必須是一上

（從引物①?③④中選擇，填編號(hào)）。

DNA序列（出線處省略了部分核作腋序列）

已知5-AACFAKKGCTCAFGA........GCAATGC'G[AGCCTCJ—J*

憚列yiicjAiAciAuACitAiT........6GHA<XK\4Ms'

1)5-AACIATCX(X/TCAT(；A—3r

KR②5JAT(X；TA(；m—3'

引物.)5—；\C；A(?(iCTAC(；CATTGC-3'

①5'TCATGAGC(jCATAGTT-3’

（4）對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中（虛線處省略

了部分核昔酸序列），結(jié)果正確的是：▲。

A.5'—AACTATGCG..AGCCCTT—3,B.5'—AATTCCATG....CTGAATT—3Z

C.5'—GCAATGCGT..TCGGGAA—3'D.5'—TTGATACGC....CGAGTAC—3'

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【命題角度4】重疊延伸PCR

有2種已知(部分)序列的DNA片段，期望不再依靠限制酶切、DNA連接酶連的方式，而是

新的挑戰(zhàn)

在通過PCR擴(kuò)增2種DNA片段的過程中，能直接將二者連接起來，形成重組DNA片段

固有條件PCR擴(kuò)增儀、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、足量的dNTP、緩沖體系、Mg"等陽離子

解決策略

［例1］重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過寡聚核甘酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，通過多次PCR

擴(kuò)增，從而獲得目的基因的方法。下圖是利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增某目的基因的過程。結(jié)合所

學(xué)知識(shí)，分析下列問題：

引物1引物3

目的基因

第一勰面

一引物21油4

-引物I

階引物2引物3

段引物1

；；；；引物4

第

二引物2…，______引物4

階之%3|

段引物1

引物

第——r*-r........4

三

階

---目的基因

段

(1)在引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段形成圖示雙鏈DNA至少要經(jīng)過上次循環(huán)。

(2)若在引物1和引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均復(fù)制一次，共產(chǎn)

生▲種雙鏈DNA分子。

(3)第二階段中引物2與引物3部分堿基的▲關(guān)系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來。

(4)在第一階段獲得兩種具有重疊片段DNA的過程中，必須將引物1、2和引物3、4置于不同

反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因?yàn)椤?/p>

(5)第三階段進(jìn)行重疊延伸時(shí)，是否需要額外添加引物▲,原因是▲。

【命題角度5］利用PCR在目的基因兩側(cè)添加適宜的限制酶識(shí)別序列

通過PCR擴(kuò)增得到的目的DNA片段兩側(cè)沒有限制酶識(shí)別序列，不便于用限制酶進(jìn)一步處理；

新的挑戰(zhàn)希望在PCR擴(kuò)增目的DNA片段時(shí)直接在兩側(cè)添加期望的限制酶識(shí)別序列，便于進(jìn)一步用相應(yīng)

的限制酶切割，產(chǎn)生期望的黏性末端

固有條件PCR擴(kuò)增儀、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、足量的dNTP、緩沖體系、Mg"等陽離子

解決策略▲

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【命題角度6］利用PCR對(duì)目的基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變

PCR擴(kuò)增目的DNA片段時(shí)，不再完全忠實(shí)于模板DNA,而是能夠?qū)δ骋晃稽c(diǎn)的堿基對(duì)進(jìn)行替

新的挑戰(zhàn)

換/增添/刪除，使目的DNA片段發(fā)生定點(diǎn)突變

固有條件PCR擴(kuò)增儀、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、足量的dNTP、緩沖體系、蛇2+等陽離子

解決策略▲

【例1］通過設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因

的過程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板

鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5,端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)

別位點(diǎn)。有關(guān)敘述不正確的是：

MaT

引物］__________________

"G二?引物2

第I輪PCR瑜

TT|/①

引物1?L-I---------------------------/

-丁------------Q引物2

(第2輪PCR第b

引削斗二二;二二二二中黑

人?酹h

t

A.引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入

B.復(fù)性溫度過高會(huì)導(dǎo)致引物不能與模板牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增效率下降

C.第3輪PCR,引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的突變基因

D.第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長的DNA占1/2

【例2］大引物PCR定點(diǎn)突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核甘酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行

兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，

過程如圖所示。下列敘述不正確的是：

誘變引物

第一輪PCR,,一

PCR產(chǎn)物而作大引物

-??

第二輪PCR|

A.第一輪PCR過程中退火所用的溫度與第二輪PCR退火的溫度不一樣

B.PCR擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需要連接到載體分子上才能表達(dá)出相應(yīng)的性狀，該定點(diǎn)誘變產(chǎn)物

需具備啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯

C.第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈

D.將某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),屬于蛋白質(zhì)工程

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［例3］蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對(duì)人體沒有影響。我國科學(xué)家欲獲得高效表達(dá)蛋

白A的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌作為微生物農(nóng)藥，做了相關(guān)研究。請(qǐng)回答下列問題：

(1)研究者將重組質(zhì)粒置于經(jīng)上處理的大腸桿菌細(xì)胞懸液中，獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。

(2)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低，研究者推測(cè)不同生物對(duì)密

碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對(duì)引物(引物B和C中都替換了

一個(gè)堿基)，并按圖中方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增，以得到新的蛋白A基因。

引物B引物D

y3-A-S了—%

￥:蛋白A基因—_

5'=^<-V—；、

引物A引物C

圖1

s-----------------------------------r

IPCR3

y八---------y

、-------v------------------$

新的蛋白A基因

注?圖中7V為堿基序列變化點(diǎn)，

①這是一種定點(diǎn)的▲技術(shù)。

②圖2所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖1中所示的引物？請(qǐng)?zhí)顚懸韵卤砀?若選用該

引物劃“，若不選用該引物則劃“X”)▲。

引物A引物B引物c引物D

PCRi▲▲▲▲

▲▲▲▲

PCR2

▲▲▲▲

PCR3

▲▲▲▲

PCR4

(3)研究者進(jìn)一步將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和▲分別導(dǎo)入大腸桿菌,提取培養(yǎng)液中的

蛋白質(zhì)，用▲方法檢測(cè)并比較三組受體菌蛋白A的表達(dá)產(chǎn)物，判斷新蛋白A基因表達(dá)效

率是否提高。為檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，研究者將上述各組表達(dá)產(chǎn)物加入到長滿了植物

病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，比較▲的大小,以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。

(4)作為微生物農(nóng)藥，使用時(shí)常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌，

其優(yōu)點(diǎn)是▲。

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【命題角度7】巢式PCR

目的DNA片段在全部DNA中所占的比例太低，通過PCR對(duì)其擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)引物特異性過強(qiáng)或過

新的挑戰(zhàn)弱時(shí)，都很難擴(kuò)增出足量的目的DNA片段，期望通過PCR能夠精準(zhǔn)又大量的擴(kuò)增出目的DNA

片段

固有條件PCR擴(kuò)增儀、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、足量的dNTP、緩沖體系、Mg2+等陽離子

解決策略▲

【例1］家畜胚胎的性別鑒定技術(shù)對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)在兩次PCR反應(yīng)中使

用兩組不同引物，先使用外引物對(duì)目標(biāo)區(qū)域DNA片段進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生中間產(chǎn)物，然后

使用內(nèi)引物對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物。下圖是式PCR工作原理示意圖，請(qǐng)

回答：

模板2、、、、、、、、=X、、、g、、、-、、、、za、aa、、、zz、=

,」|使用外引物城祗？欠PCR擴(kuò)增

中間產(chǎn)物

［使用內(nèi)引?進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增

目標(biāo)產(chǎn)物,,

'巢式PCRI作原理示意圖’

(1)巢式PCR反應(yīng)體系中需要加入模板、上、上、引物、Mg"、緩沖液等。

(2)相比于常規(guī)PCR獲得的產(chǎn)物而言，巢式PCR獲得的產(chǎn)物特異性，，原因是如果利用外引

物擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片段，再利用內(nèi)引物擴(kuò)增在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率上。

(3)巢式PCR通常在一個(gè)試管中進(jìn)行第一階段反應(yīng)，然后將中間產(chǎn)物等轉(zhuǎn)移到第二試管中進(jìn)行

第二階段反應(yīng)，不在同一試管完成的主要原因是▲。

(4)科研人員利用多重巢式PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增Y染色體上雄性決定基因(SRY)和常染色體上的

酪蛋白基因(CSN1S1),進(jìn)行早期胚胎的性別鑒定，并將鑒定后的胚胎進(jìn)行移植。下表是

主要實(shí)驗(yàn)步驟，請(qǐng)完成下表：

實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆椒ú襟E要點(diǎn)

胚胎樣品DNA提取選取囊胚的①▲細(xì)胞提取DNA

PCR引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)牛的SRY和CSN1S1基因序列設(shè)計(jì)合成②▲對(duì)引物

PCR過程預(yù)變性f③▲退火f延伸

觀察擴(kuò)增結(jié)果電泳分析

受體牛④▲處理對(duì)受體牛注射前列腺素

胚胎移植將篩選出的胚胎移植到受體牛的子宮內(nèi)

(5)電泳結(jié)果如下圖所示，1?5號(hào)為取自不同胚胎的DNA樣品進(jìn)行巢式PCR的產(chǎn)物。A和B條

帶中代表CSN1S1的是▲?？梢源_定1?5號(hào)中▲號(hào)胚胎為雌性。

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A*

B*八一，

(6)牛胚胎性別的鑒定除了可以利用PCR外，下列方法也可行的有▲。

①差速離心法②核酸探針雜交法

③染色體核型分析法④H-Y抗血清免疫學(xué)法(H-Y抗原編碼基因位于Y染色體上)

【命題角度8］不對(duì)稱PCR

新的挑戰(zhàn)通過PCR較快的得到單鏈DNA

固有條件PCR擴(kuò)增儀、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、足量的dNTP、緩沖體系、姐2+等陽離子

解決策略▲

［例1］PCR技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，可用于擴(kuò)增目的基因，制作探針，引入定點(diǎn)突變，定量檢測(cè)DNA等。

完成下列有關(guān)PCR技術(shù)和相關(guān)應(yīng)用的問題：

(1)PCR技術(shù)可用于基因工程四個(gè)基本步驟中的▲步驟。

(2)在影響擴(kuò)增反應(yīng)的各種因素中，引物的設(shè)計(jì)最為重要，引物的3,端應(yīng)采用簡并密碼較少的

氨基酸的對(duì)應(yīng)核甘酸序列，否則會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增的非特異性序列數(shù)量上。

(3)在正常變性和退火之后研究某TaqDNA聚合酶的催化效率，得到了下列表格:

22℃37℃55℃70℃78℃83℃

子鏈延伸速率(個(gè)核甘酸.秒\酶分子為0.251.522602500

83℃下沒有產(chǎn)物的原因是上。

(4)PCR反應(yīng)后期，由于▲等原因,反應(yīng)速率會(huì)降低。

(5)PCR過程中，溫度的控制至關(guān)重要，變性溫度過低會(huì)因?yàn)椤?最終都會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)效率降

低。退火溫度過高則會(huì)因▲導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的量▲。

(6)不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法。這兩種引物分別為限制

性引物與非限制性引物，其最佳比例一般為1：50~1：100,在PCR反應(yīng)的最初10~15個(gè)

循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物最初主要是雙鏈DNA,但當(dāng)限制性引物消耗完后，非限制性引物引導(dǎo)

的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。假設(shè)反應(yīng)體系中原來有a個(gè)模板DNA,最初10個(gè)循環(huán)

擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA,后20個(gè)循環(huán)均只擴(kuò)增一條鏈，則需要限制性引物▲個(gè),需要非限制

性引物上個(gè)。因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的▲不同,可通過電泳方法將其分離。

【命題角度9】實(shí)時(shí)熒光定量PCR

傳統(tǒng)的PCR只有等擴(kuò)增結(jié)束后，才能進(jìn)一步檢測(cè)目的DNA片段的產(chǎn)量；期望能夠不等PCR擴(kuò)

新的挑戰(zhàn)

增結(jié)束，在PCR進(jìn)行的過程中，就能定量判斷擴(kuò)增的進(jìn)程，定量判斷目的DNA片段的數(shù)量

固有條件PCR擴(kuò)增儀、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、足量的dNTP、緩沖體系、Mg"等陽離子

解決策略▲

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［例1］實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡稱qPCR,靈敏度高特異性好，是目前檢測(cè)微小殘留病變的常用方法。將熒光

標(biāo)記的Taqman探針與待測(cè)樣本DNA混合，當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，與目的

基因結(jié)合的探針被TaqDNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測(cè)到在特定光激發(fā)下

發(fā)出熒光（如圖所示），隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，

可得Ct值（該值與待測(cè)樣本中目的基因的個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān)）。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是：

引物1?@

3’--------------------------------------y

5,-------------------------------------3*

施引物2

用

31----------------------5,

5,------------------31

注：R表示熒光基因，Q表示淬滅基因.

A.每個(gè)模板DNA分子含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)

B.在反應(yīng)過程中，無需ATP為新鏈的合成提供能量

C.做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的核甘酸序列合成引物和Taqman探針

D.熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，說明含有的病變的概率越小

【例2】“實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1?2h內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果。TaqMan

探針是實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR技術(shù)中一種常用探針（如圖1），其5末端連接熒光基團(tuán)（R）,3

末端連接淬滅劑（Q）o當(dāng)探針完整時(shí)，R發(fā)出的熒光信號(hào)被Q吸收而不發(fā)熒光。在PCR擴(kuò)增過程

中，當(dāng)Taq酶遇到探針時(shí)會(huì)使探針?biāo)舛尫懦鲇坞x的R和Q,R發(fā)出的熒光信號(hào)被相應(yīng)儀器檢

測(cè)到，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步（如圖2）。請(qǐng)據(jù)圖回答：

病毒樣品RNA-

I

MMa做針雙鏈DNA一

@弓瞅探針與模慳顯二

熒光基因（SB淬滅劑?引物2

帆延佛解解匕二.T還九

圖］

Tao胸切割探針期Q1’7一

和聚合越EL?⑥

圖2

（1）結(jié)合圖1和圖2分析，“熒光RT—PCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有▲酶、▲

酶、TaqMan探針、引物、dNTP、Mg2\緩沖劑系等。這種分子層面的熒光RT—PCR檢測(cè)具有

特異性和靈敏性都很高的特點(diǎn)，主要與試劑盒中的▲、▲有關(guān)。

（2）根據(jù)TaqMan探針功能分析，探針中堿基序列的設(shè)計(jì)應(yīng)主要依據(jù)工。新冠病毒（nCoV-2019）

是冠狀病毒大家庭中的新的一員，其堿基序列與引起SARS的冠狀病毒堿基序列有79.5%的

相似性，與流感病毒堿基相似度也較高，因此在設(shè)計(jì)TaqMan探針時(shí)應(yīng)篩選出nCoV-2019

特有序列，以避免▲（填“假陰性”或“假陽性”）的出現(xiàn)。

（3）根據(jù)圖1和圖2,Taq酶的除了能催化DNA子鏈的延伸，還能▲。

（4）若每分子探針?biāo)忉尫诺腞基團(tuán)熒光強(qiáng)度為定值a,則反應(yīng)體系中某時(shí)刻熒光信號(hào)強(qiáng)度（Rn）

主要與▲、▲有關(guān)。在檢測(cè)過程中，隨著PCR的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，“雜交雙

鏈”熒光信號(hào)的強(qiáng)度也等比例增加，加了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般要達(dá)到或超過閾值

時(shí)才確診?？赏ㄟ^熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)生量的變化從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖（如右

圖）。“平臺(tái)期”出現(xiàn)的最可能的原因是試劑盒中上等有限，超出一定的循環(huán)數(shù)后，熒

光標(biāo)記的“雜交雙鏈”不再增加。

,呼臺(tái)期T

(

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米指數(shù)擴(kuò)增階號(hào)

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