2024年高中生物新教材選擇性第3章第2節(jié)第1課時(shí)目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建

第2節(jié)基因工程的基本操作程序第1課時(shí)目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建[學(xué)習(xí)目標(biāo)]1.簡(jiǎn)述PCR的原理、條件及過程。2.簡(jiǎn)述基因表達(dá)載體的組成及構(gòu)建過程。一、目的基因的篩選與獲取1．培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的四個(gè)步驟(1)目的基因的篩選與獲取。(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建。(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。(4)目的基因的檢測(cè)與鑒定。2．目的基因(1)概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。(2)作用：根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。(3)類型：與生物抗逆性、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因，如培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的Bt抗蟲蛋白基因，即Bt基因。3．篩選合適的目的基因：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。4．獲取目的基因的方法(1)人工合成目的基因。(2)常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。(3)通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。5．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(1)含義：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。(2)原理：DNA半保留復(fù)制。(3)基本條件①場(chǎng)所：在一定的緩沖液中進(jìn)行，其中一般要添加Mg2＋。②模板：DNA母鏈。③原料：4種脫氧核苷酸。④酶：耐高溫的DNA聚合酶。⑤引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。(4)過程①變性：當(dāng)溫度超過90℃時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。③延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。(5)上一輪循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增(約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))。(6)鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。判斷正誤(1)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)()(2)PCR擴(kuò)增技術(shù)中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚()(3)PCR過程使用的DNA聚合酶的特點(diǎn)是耐高溫()(4)PCR技術(shù)中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高()答案(1)×(2)×(3)√(4)√解析(1)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了變性、復(fù)性、延伸，DNA聚合酶催化子鏈的延伸。(2)PCR擴(kuò)增技術(shù)中，高溫使雙鏈DNA解聚。任務(wù)一：PCR擴(kuò)增技術(shù)圖1、圖2分別是PCR擴(kuò)增技術(shù)相關(guān)過程，請(qǐng)思考回答下列問題：1．PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？并說明理由。提示不是；PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段。2．圖1所示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段？比例是多少？提示第3輪；1/4。3．如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？提示根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。4．圖2是某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理，請(qǐng)分別說明理由。提示第1組：引物Ⅰ和引物Ⅱ會(huì)因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。第2組：引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)因出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。5．要保證目的基因能與載體相連接，還要對(duì)引物進(jìn)行什么操作？提示要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識(shí)別序列。6．如果循環(huán)n次，則共需消耗多少對(duì)引物？提示共需消耗2n－1對(duì)引物。PCR中的數(shù)量關(guān)系復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物的DNA分子數(shù)2482n含其中一種引物的DNA分子數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同時(shí)含兩種引物的DNA分子數(shù)0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的對(duì)數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n1．(2023·山西太原高二診斷)下列有關(guān)獲取目的基因的敘述，錯(cuò)誤的是()A．目的基因就是編碼蛋白質(zhì)的基因B．獲取目的基因是基因工程的第一步C．來自蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因D．序列比對(duì)工具的應(yīng)用為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)答案A解析目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子，A錯(cuò)誤。2．如圖表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B．在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段C．引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，則不能有效擴(kuò)增目的基因D．從理論上推測(cè)，第三輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段占3/4答案D解析由題圖可知，以原來的每條母鏈為模板經(jīng)第一輪合成的兩個(gè)DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時(shí)，兩種引物都含有，故第三輪循環(huán)共產(chǎn)生8個(gè)DNA分子，其中含有引物A的分子是7個(gè)，即占7/8，D錯(cuò)誤。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1．基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2．基因表達(dá)載體的組成3．基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程(1)首先用一定的限制酶切割載體。(2)然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。(3)再利用DNA連接酶將含目的基因的DNA片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。判斷正誤(1)基因工程操作程序的核心步驟是目的基因的獲取()(2)基因表達(dá)載體中有的含有啟動(dòng)子和終止密碼子()(3)標(biāo)記基因不一定是抗生素抗性基因()答案(1)×(2)×(3)√解析(1)基因工程操作程序的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建。(2)基因表達(dá)載體中有的含有啟動(dòng)子和終止子，終止密碼子位于mRNA上。任務(wù)二：分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法1．獲取Bt基因后不能直接將它導(dǎo)入受體細(xì)胞，是因?yàn)橛坞x的DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解，即使可以轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。因此，獲取Bt基因后，還需要借助載體將其導(dǎo)入棉花細(xì)胞，才能使棉花植株獲得抗蟲特性。2．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)目的基因插入的位置應(yīng)該在哪里？為什么？提示啟動(dòng)子下游和終止子上游；因?yàn)橹挥胁迦朐趩?dòng)子和終止子之間，目的基因才可以正常表達(dá)。3．請(qǐng)結(jié)合圖示，回答下列問題：(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ酶切割質(zhì)粒？為什么？提示不能；因?yàn)镾maⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。該基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進(jìn)一步篩選。(2)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？提示可以防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化以及目的基因與載體的反向連接。1．區(qū)分啟動(dòng)子和終止子與起始密碼子和終止密碼子啟動(dòng)子和終止子位于DNA上，是基因表達(dá)載體必需的部分，而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束。2．圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。拓展延伸真、原核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)(1)基因的結(jié)構(gòu)(2)基因表達(dá)遺傳信息①原核生物基因②真核生物基因3．下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的敘述，錯(cuò)誤的是()A．啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，組成它的基本單位是脫氧核苷酸B．基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止密碼子、標(biāo)記基因等組件C．人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可激活或抑制目的基因的表達(dá)D．由于受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也有所差別答案B解析啟動(dòng)子在基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，組成它的基本單位是脫氧核苷酸，A正確；基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等，B錯(cuò)誤；由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物以及微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建是不完全相同的，D正確。4．(2023·江蘇蘇州高二期末)某科研小組利用質(zhì)粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構(gòu)建重組DNA。下列分析不正確的是()A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質(zhì)粒，可得到2條DNA片段B．不能用AluⅠ酶切割質(zhì)粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會(huì)破壞目的基因C．構(gòu)建重組DNA時(shí)，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNAD．導(dǎo)入了重組DNA的細(xì)菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)答案C解析限制酶HindⅢ和PstⅠ在質(zhì)粒上各有一個(gè)識(shí)別切割位點(diǎn)，用HindⅢ和PstⅠ切割質(zhì)粒，可得到2條DNA片段，A正確；AluⅠ的切割位點(diǎn)位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA會(huì)破壞目的基因，B正確；不宜選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNA，因?yàn)橘|(zhì)粒中的兩個(gè)標(biāo)記基因均會(huì)被破壞，且DNA會(huì)反向連接至載體上，C錯(cuò)誤；構(gòu)建重組DNA時(shí)，選擇限制酶HindⅢ和PstⅠ同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNA，會(huì)破壞質(zhì)粒中的氯霉素抗性基因，保留四環(huán)素抗性基因，所以導(dǎo)入了重組DNA的細(xì)菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，D正確。題組一目的基因的篩選與獲取1．(2023·陜西西安高二調(diào)研)基因工程操作“四步曲”的正確順序是()①目的基因的篩選與獲?、趯⒛康幕?qū)胧荏w細(xì)胞③基因表達(dá)載體的構(gòu)建④目的基因的檢測(cè)與鑒定A．①②③④ B．④①③②C．①③②④ D．③①②④答案C2．下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述，正確的是()A．PCR技術(shù)建立在對(duì)擴(kuò)增的目的基因序列完全已知的基礎(chǔ)上B．該技術(shù)需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶C．該技術(shù)需要一對(duì)特異性的引物，要求一對(duì)引物的序列是互補(bǔ)的D．該技術(shù)應(yīng)用DNA半保留復(fù)制原理，也需要模板、原料、能量、酶等條件答案D解析PCR技術(shù)擴(kuò)增的目的基因序列不一定完全是已知的，A錯(cuò)誤；該技術(shù)是通過高溫來使DNA解旋的，不需要解旋酶，B錯(cuò)誤；該技術(shù)需要的一對(duì)引物，分別能與模板DNA的兩條鏈進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，其序列不是互補(bǔ)的，C錯(cuò)誤。3．用PCR擴(kuò)增下面的DNA片段：5′GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG3′3′CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC5′供選擇的引物有：①5′GACCTGTGGAAGC3′②5′CATACGGGATTG3′③5′GTATGCCCTAAC3′④5′CAATCCCGTATG3′共四種，應(yīng)選擇()A．①②B．②③C．③④D．①④答案D解析用PCR擴(kuò)增DNA片段的過程中，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3′端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5′端至3′端延伸的，故引物的堿基序列應(yīng)與每條模板鏈5′端的一段核苷酸鏈的堿基序列相同，即應(yīng)以模板鏈5′端的一段脫氧核苷酸單鏈片段作為引物；由題干信息分析可知，5′端的堿基序列是5′GACCTGTGGAAGC和5′CAATCCCGTATG，故對(duì)應(yīng)的引物為①④，D正確。4．(2023·河北邢臺(tái)高二月考)用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，經(jīng)四輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．第一輪循環(huán)得到2個(gè)DNA分子，即①②各一個(gè)B．第二輪循環(huán)得到4個(gè)DNA分子，即①②③④各一個(gè)C．第三輪循環(huán)得到8個(gè)DNA分子，其中有2個(gè)是等長(zhǎng)的，也就是有2個(gè)⑤D．第四輪循環(huán)得到16個(gè)DNA分子，其中有4個(gè)⑤答案D解析第四輪循環(huán)得到的16個(gè)DNA分子中，兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段有24－2×4＝8(個(gè))，即有8個(gè)⑤，D錯(cuò)誤。題組二基因表達(dá)載體的構(gòu)建5．基因工程的核心是構(gòu)建基因表達(dá)載體，下列不屬于載體作用的是()A．載體能防止目的基因被受體細(xì)胞限制酶“切割”B．載體能協(xié)助目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)制C．載體含有啟動(dòng)子和終止子協(xié)助目的基因表達(dá)D．載體具有標(biāo)記基因，便于篩選含目的基因的受體細(xì)胞答案A解析載體不能防止目的基因被受體細(xì)胞限制酶“切割”，A錯(cuò)誤；載體在受體細(xì)胞中能夠穩(wěn)定存在，并且自我復(fù)制，使目的基因數(shù)量擴(kuò)大，B正確；啟動(dòng)子是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程；終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，所以載體含有的啟動(dòng)子和終止子可協(xié)助目的基因的表達(dá)，C正確；載體具有標(biāo)記基因，標(biāo)記基因便于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，D正確。6．下列關(guān)于基因表達(dá)載體的說法，不正確的是()A．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟B．基因表達(dá)載體包含啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因等C．終止子位于目的基因的下游，能夠終止翻譯過程D．不同的目的基因所需的啟動(dòng)子不一定相同答案C解析基因表達(dá)載體包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因、標(biāo)記基因等，其中啟動(dòng)子位于目的基因的上游，是啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA片段，終止子位于目的基因的下游，能夠終止轉(zhuǎn)錄過程，B正確，C錯(cuò)誤；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其啟動(dòng)子也不盡相同，D正確。7．(2023·銀川高二階段考)科學(xué)家利用質(zhì)粒(如圖)成功構(gòu)建了蛛絲蛋白基因的重組質(zhì)粒，并在家蠶絲腺細(xì)胞中獲得大量蛛絲蛋白。下列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是()A．為防止目的基因自身環(huán)化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ來切割目的基因B．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)選用蠶絲蛋白基因的啟動(dòng)子利于基因在家蠶絲腺細(xì)胞中表達(dá)C．啟動(dòng)子是DNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合部位，可以驅(qū)動(dòng)遺傳信息的轉(zhuǎn)錄D．基因表達(dá)載體中的標(biāo)記基因可以用來鑒別與選擇含有蛛絲蛋白基因的受體細(xì)胞答案C解析啟動(dòng)子是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合部位，C錯(cuò)誤。8．(2023·江蘇南通高二期中)如圖表示pBR322質(zhì)粒和人生長(zhǎng)激素基因所在片段的結(jié)構(gòu)信息，將二者構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌并進(jìn)行篩選。下列有關(guān)敘述正確的是()注：AmpR為氨芐青霉素抗性基因，TetR為四環(huán)素抗性基因。A．可選擇的限制酶組合是酶E和酶GB．所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因C．用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基就能篩選出含重組質(zhì)粒的受體菌D．同時(shí)用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，電泳后可得到3個(gè)條帶答案B解析酶E會(huì)破壞兩種標(biāo)記基因，為避免切割后DNA片段的自身環(huán)化，又保留質(zhì)粒上的標(biāo)記基因，切割時(shí)應(yīng)選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A錯(cuò)誤；重組質(zhì)粒上的四環(huán)素抗性基因被破壞，而重組質(zhì)粒上的氨芐青霉素抗性基因能表達(dá)，用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的有導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌和導(dǎo)入普通質(zhì)粒的受體菌，C錯(cuò)誤；據(jù)圖可知，因酶E有兩個(gè)作用位點(diǎn)，同時(shí)用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，能將質(zhì)粒切割成4個(gè)DNA片段，電泳后可得到4個(gè)條帶，D錯(cuò)誤。9．RT－PCR是以提取的RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得與之互補(bǔ)的DNA(cDNA)序列，再以cDNA序列為模板進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，具體過程如圖所示。下列有關(guān)RT－PCR的敘述，正確的是()A．過程1需要使用耐高溫的DNA聚合酶B．過程2中的引物B可與mRNA互補(bǔ)配對(duì)C．游離的脫氧核苷酸只能加到引物的5′端D．RT－PCR可用于對(duì)RNA病毒的檢測(cè)與鑒定答案D解析過程1是由mRNA形成單鏈DNA的過程，為逆轉(zhuǎn)錄，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶，A錯(cuò)誤；過程2中的引物B可與cDNA互補(bǔ)配對(duì)，而mRNA與cDNA堿基互補(bǔ)配對(duì)，則引物B和mRNA除堿基T和U的區(qū)別外，其余序列相同，不能互補(bǔ)配對(duì)，B錯(cuò)誤；游離的脫氧核苷酸只能加到引物的3′端，C錯(cuò)誤；利用RT－PCR技術(shù)對(duì)某些微量RNA病毒進(jìn)行檢測(cè)，并可提高檢測(cè)的靈敏度(因?yàn)樵黾恿舜郎y(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量，因此便于檢測(cè))，D正確。10．研究人員用如圖1中質(zhì)粒和圖2中含目的基因的片段構(gòu)建重組質(zhì)粒(圖中標(biāo)注了相A．構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶B．使用DNA連接酶將酶切后的質(zhì)粒和目的基因片段進(jìn)行重組C．能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的一定是含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌D．利用PCR鑒定含目的基因的大腸桿菌時(shí)應(yīng)選用引物甲和引物丙答案C解析選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識(shí)別位點(diǎn)，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的兩種標(biāo)記基因都被破壞，因此只能選BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割，A正確；酶切后的質(zhì)粒和目的基因片段要用DNA連接酶連接，構(gòu)建重組載體，B正確；能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的也可能是只含有質(zhì)粒的大腸桿菌，C錯(cuò)誤；PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的11．(2023·哈爾濱高二期末)下列有關(guān)PCR的敘述，錯(cuò)誤的是()A．PCR的原理是DNA半保留復(fù)制，解旋和復(fù)制不是同時(shí)進(jìn)行的B．PCR的過程主要包括變性→延伸→復(fù)性，溫度逐漸降低C．PCR技術(shù)擴(kuò)增時(shí)，一個(gè)DNA分子經(jīng)過n輪復(fù)制共需引物2n－1對(duì)D．常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物答案B解析PCR的原理是DNA半保留復(fù)制，PCR技術(shù)是在較高溫度條件下打開雙鏈后進(jìn)行擴(kuò)增的，是先解旋后復(fù)制，A正確；PCR的過程主要包括高溫變性→低溫復(fù)性→中溫延伸，可見該過程中溫度不是逐漸降低，B錯(cuò)誤。12．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。下列關(guān)于PCR引物的敘述，不正確的是()A．為保證模板鏈與引物結(jié)合的效率，兩種引物之間盡量避免存在互補(bǔ)序列B．為了便于將擴(kuò)增的DNA片段與載體連接，可在引物的3′端加上限制酶識(shí)別序列C．在兩種引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制酶識(shí)別序列，主要目的是使目的基因定向插入載體并可避免目的基因自身環(huán)化D．復(fù)性所需的溫度、時(shí)長(zhǎng)和延伸所需的溫度、時(shí)長(zhǎng)均與引物有關(guān)答案B解析引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)出現(xiàn)引物與自身配對(duì)、引物跟引物配對(duì)情況，降低PCR的效率，A正確；引物引導(dǎo)子鏈合成的方向是5′端→3′端，因此為了便于擴(kuò)增的DNA片段與載體連接，需要在引物的5′端加上限制酶識(shí)別序列，B錯(cuò)誤；為了便于擴(kuò)增的DNA片段與載體連接，常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制酶識(shí)別序列，主要目的是使目的基因能定向插入表達(dá)載體，避免目的基因自身環(huán)化，C正確；復(fù)性所需的溫度、時(shí)長(zhǎng)和延伸所需的溫度、時(shí)長(zhǎng)均與引物有關(guān)，如引物中G與C含量高，需要設(shè)定更高的復(fù)性和延伸溫度，D正確。13．基因工程中可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?；卮鹣铝袉栴}：(1)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，解開DNA雙鏈的酶是______________。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是____________________。上述兩個(gè)解鏈過程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的_________。(2)目前在PCR反應(yīng)中不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_______________________。(3)含有限制酶的細(xì)胞中通常還具有相應(yīng)的甲基化酶，這兩種酶對(duì)DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以對(duì)DNA序列進(jìn)行修飾，使限制酶不能對(duì)這一序列進(jìn)行識(shí)別和切割。含有某種限制酶的細(xì)胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破壞細(xì)胞自身的DNA，其原因可能有：①___________________________________________________________________________________；②_________________________