2024年高中生物新教材選擇性第3章第2節(jié)第1課時目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建

第2節(jié)基因工程的基本操作程序第1課時目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建[學習目標]1.簡述PCR的原理、條件及過程。2.簡述基因表達載體的組成及構建過程。一、目的基因的篩選與獲取1．培育轉基因抗蟲棉的四個步驟(1)目的基因的篩選與獲取。(2)基因表達載體的構建。(3)將目的基因導入受體細胞。(4)目的基因的檢測與鑒定。2．目的基因(1)概念：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因。(2)作用：根據不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質的基因。(3)類型：與生物抗逆性、生產藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關的基因，如培育轉基因抗蟲棉用到的Bt抗蟲蛋白基因，即Bt基因。3．篩選合適的目的基因：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。4．獲取目的基因的方法(1)人工合成目的基因。(2)常用PCR特異性地快速擴增目的基因。(3)通過構建基因文庫來獲取目的基因。5．利用PCR獲取和擴增目的基因(1)含義：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。(2)原理：DNA半保留復制。(3)基本條件①場所：在一定的緩沖液中進行，其中一般要添加Mg2＋。②模板：DNA母鏈。③原料：4種脫氧核苷酸。④酶：耐高溫的DNA聚合酶。⑤引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。(4)過程①變性：當溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。②復性：當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。③延伸：當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。(5)上一輪循環(huán)的產物可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數形式擴增(約為2n，其中n為擴增循環(huán)的次數)。(6)鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物。判斷正誤(1)PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應()(2)PCR擴增技術中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚()(3)PCR過程使用的DNA聚合酶的特點是耐高溫()(4)PCR技術中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高()答案(1)×(2)×(3)√(4)√解析(1)PCR反應中溫度的周期性改變是為了變性、復性、延伸，DNA聚合酶催化子鏈的延伸。(2)PCR擴增技術中，高溫使雙鏈DNA解聚。任務一：PCR擴增技術圖1、圖2分別是PCR擴增技術相關過程，請思考回答下列問題：1．PCR擴增的是完整的模板DNA分子嗎？并說明理由。提示不是；PCR擴增的僅僅是兩種引物之間所對應的特定DNA片段。2．圖1所示利用PCR技術擴增目的基因，在第幾輪循環(huán)產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段？比例是多少？提示第3輪；1/4。3．如果已知某目的基因的序列和結構，利用PCR篩選和擴增出該目的基因的關鍵是什么？提示根據目的基因兩端的核苷酸序列設計引物。4．圖2是某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理，請分別說明理由。提示第1組：引物Ⅰ和引物Ⅱ會因局部發(fā)生堿基互補配對而失效。第2組：引物Ⅰ′自身折疊后會因出現局部堿基互補配對而失效。5．要保證目的基因能與載體相連接，還要對引物進行什么操作？提示要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識別序列。6．如果循環(huán)n次，則共需消耗多少對引物？提示共需消耗2n－1對引物。PCR中的數量關系復制次數123nDNA分子數2482n含引物的DNA分子數2482n含其中一種引物的DNA分子數1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同時含兩種引物的DNA分子數0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的對數1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n1．(2023·山西太原高二診斷)下列有關獲取目的基因的敘述，錯誤的是()A．目的基因就是編碼蛋白質的基因B．獲取目的基因是基因工程的第一步C．來自蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因可作為轉基因抗蟲棉的目的基因D．序列比對工具的應用為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會答案A解析目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子，A錯誤。2．如圖表示利用PCR技術擴增目的基因的部分過程，其原理與細胞內DNA復制類似。下列有關敘述錯誤的是()A．耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B．在第三輪循環(huán)產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段C．引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補配對，則不能有效擴增目的基因D．從理論上推測，第三輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段占3/4答案D解析由題圖可知，以原來的每條母鏈為模板經第一輪合成的兩個DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時，兩種引物都含有，故第三輪循環(huán)共產生8個DNA分子，其中含有引物A的分子是7個，即占7/8，D錯誤。二、基因表達載體的構建1．基因表達載體構建的目的讓目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2．基因表達載體的組成3．基因表達載體的構建過程(1)首先用一定的限制酶切割載體。(2)然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。(3)再利用DNA連接酶將含目的基因的DNA片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。判斷正誤(1)基因工程操作程序的核心步驟是目的基因的獲取()(2)基因表達載體中有的含有啟動子和終止密碼子()(3)標記基因不一定是抗生素抗性基因()答案(1)×(2)×(3)√解析(1)基因工程操作程序的核心步驟是基因表達載體的構建。(2)基因表達載體中有的含有啟動子和終止子，終止密碼子位于mRNA上。任務二：分析基因表達載體構建的目的和方法1．獲取Bt基因后不能直接將它導入受體細胞，是因為游離的DNA進入受體細胞，一般會直接被分解，即使可以轉錄翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有目的基因。因此，獲取Bt基因后，還需要借助載體將其導入棉花細胞，才能使棉花植株獲得抗蟲特性。2．構建基因表達載體時目的基因插入的位置應該在哪里？為什么？提示啟動子下游和終止子上游；因為只有插入在啟動子和終止子之間，目的基因才可以正常表達。3．請結合圖示，回答下列問題：(1)構建基因表達載體時，能否用SmaⅠ酶切割質粒？為什么？提示不能；因為SmaⅠ會破壞質粒的抗生素抗性基因。該基因是標記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進一步篩選。(2)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優(yōu)點是什么？提示可以防止質粒和目的基因的自身環(huán)化以及目的基因與載體的反向連接。1．區(qū)分啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達載體必需的部分，而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結束。2．圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。拓展延伸真、原核細胞基因的結構和表達(1)基因的結構(2)基因表達遺傳信息①原核生物基因②真核生物基因3．下列關于基因表達載體構建的敘述，錯誤的是()A．啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，組成它的基本單位是脫氧核苷酸B．基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止密碼子、標記基因等組件C．人工構建的誘導型啟動子，當誘導物存在時，可激活或抑制目的基因的表達D．由于受體細胞不同，基因表達載體的構建也有所差別答案B解析啟動子在基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，組成它的基本單位是脫氧核苷酸，A正確；基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等，B錯誤；由于受體細胞有植物、動物以及微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此基因表達載體的構建是不完全相同的，D正確。4．(2023·江蘇蘇州高二期末)某科研小組利用質粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構建重組DNA。下列分析不正確的是()A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質粒，可得到2條DNA片段B．不能用AluⅠ酶切割質粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會破壞目的基因C．構建重組DNA時，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時切割質粒和外源DNAD．導入了重組DNA的細菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而不能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長答案C解析限制酶HindⅢ和PstⅠ在質粒上各有一個識別切割位點，用HindⅢ和PstⅠ切割質粒，可得到2條DNA片段，A正確；AluⅠ的切割位點位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA會破壞目的基因，B正確；不宜選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時切割質粒和外源DNA，因為質粒中的兩個標記基因均會被破壞，且DNA會反向連接至載體上，C錯誤；構建重組DNA時，選擇限制酶HindⅢ和PstⅠ同時切割質粒和外源DNA，會破壞質粒中的氯霉素抗性基因，保留四環(huán)素抗性基因，所以導入了重組DNA的細菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而不能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長，D正確。題組一目的基因的篩選與獲取1．(2023·陜西西安高二調研)基因工程操作“四步曲”的正確順序是()①目的基因的篩選與獲?、趯⒛康幕驅胧荏w細胞③基因表達載體的構建④目的基因的檢測與鑒定A．①②③④ B．④①③②C．①③②④ D．③①②④答案C2．下列關于PCR技術的敘述，正確的是()A．PCR技術建立在對擴增的目的基因序列完全已知的基礎上B．該技術需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶C．該技術需要一對特異性的引物，要求一對引物的序列是互補的D．該技術應用DNA半保留復制原理，也需要模板、原料、能量、酶等條件答案D解析PCR技術擴增的目的基因序列不一定完全是已知的，A錯誤；該技術是通過高溫來使DNA解旋的，不需要解旋酶，B錯誤；該技術需要的一對引物，分別能與模板DNA的兩條鏈進行堿基互補配對，其序列不是互補的，C錯誤。3．用PCR擴增下面的DNA片段：5′GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG3′3′CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC5′供選擇的引物有：①5′GACCTGTGGAAGC3′②5′CATACGGGATTG3′③5′GTATGCCCTAAC3′④5′CAATCCCGTATG3′共四種，應選擇()A．①②B．②③C．③④D．①④答案D解析用PCR擴增DNA片段的過程中，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3′端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5′端至3′端延伸的，故引物的堿基序列應與每條模板鏈5′端的一段核苷酸鏈的堿基序列相同，即應以模板鏈5′端的一段脫氧核苷酸單鏈片段作為引物；由題干信息分析可知，5′端的堿基序列是5′GACCTGTGGAAGC和5′CAATCCCGTATG，故對應的引物為①④，D正確。4．(2023·河北邢臺高二月考)用PCR技術特異性地拷貝“X基因”，經四輪循環(huán)后產物中有五種不同的DNA分子。下列有關敘述錯誤的是()A．第一輪循環(huán)得到2個DNA分子，即①②各一個B．第二輪循環(huán)得到4個DNA分子，即①②③④各一個C．第三輪循環(huán)得到8個DNA分子，其中有2個是等長的，也就是有2個⑤D．第四輪循環(huán)得到16個DNA分子，其中有4個⑤答案D解析第四輪循環(huán)得到的16個DNA分子中，兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段有24－2×4＝8(個)，即有8個⑤，D錯誤。題組二基因表達載體的構建5．基因工程的核心是構建基因表達載體，下列不屬于載體作用的是()A．載體能防止目的基因被受體細胞限制酶“切割”B．載體能協(xié)助目的基因在受體細胞中復制C．載體含有啟動子和終止子協(xié)助目的基因表達D．載體具有標記基因，便于篩選含目的基因的受體細胞答案A解析載體不能防止目的基因被受體細胞限制酶“切割”，A錯誤；載體在受體細胞中能夠穩(wěn)定存在，并且自我復制，使目的基因數量擴大，B正確；啟動子是RNA聚合酶的識別和結合的位點，能啟動轉錄過程；終止子控制著轉錄的結束，所以載體含有的啟動子和終止子可協(xié)助目的基因的表達，C正確；載體具有標記基因，標記基因便于篩選含有目的基因的受體細胞，D正確。6．下列關于基因表達載體的說法，不正確的是()A．基因表達載體的構建是基因工程的核心步驟B．基因表達載體包含啟動子、目的基因、終止子、標記基因等C．終止子位于目的基因的下游，能夠終止翻譯過程D．不同的目的基因所需的啟動子不一定相同答案C解析基因表達載體包括啟動子、終止子、目的基因、標記基因等，其中啟動子位于目的基因的上游，是啟動轉錄的一段DNA片段，終止子位于目的基因的下游，能夠終止轉錄過程，B正確，C錯誤；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其啟動子也不盡相同，D正確。7．(2023·銀川高二階段考)科學家利用質粒(如圖)成功構建了蛛絲蛋白基因的重組質粒，并在家蠶絲腺細胞中獲得大量蛛絲蛋白。下列有關說法錯誤的是()A．為防止目的基因自身環(huán)化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ來切割目的基因B．構建基因表達載體時選用蠶絲蛋白基因的啟動子利于基因在家蠶絲腺細胞中表達C．啟動子是DNA聚合酶的識別和結合部位，可以驅動遺傳信息的轉錄D．基因表達載體中的標記基因可以用來鑒別與選擇含有蛛絲蛋白基因的受體細胞答案C解析啟動子是RNA聚合酶的識別和結合部位，C錯誤。8．(2023·江蘇南通高二期中)如圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列有關敘述正確的是()注：AmpR為氨芐青霉素抗性基因，TetR為四環(huán)素抗性基因。A．可選擇的限制酶組合是酶E和酶GB．所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因C．用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基就能篩選出含重組質粒的受體菌D．同時用三種限制酶處理圖中質粒，電泳后可得到3個條帶答案B解析酶E會破壞兩種標記基因，為避免切割后DNA片段的自身環(huán)化，又保留質粒上的標記基因，切割時應選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A錯誤；重組質粒上的四環(huán)素抗性基因被破壞，而重組質粒上的氨芐青霉素抗性基因能表達，用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的有導入重組質粒的受體菌和導入普通質粒的受體菌，C錯誤；據圖可知，因酶E有兩個作用位點，同時用三種限制酶處理圖中質粒，能將質粒切割成4個DNA片段，電泳后可得到4個條帶，D錯誤。9．RT－PCR是以提取的RNA為模板，經逆轉錄獲得與之互補的DNA(cDNA)序列，再以cDNA序列為模板進行目的片段的擴增，具體過程如圖所示。下列有關RT－PCR的敘述，正確的是()A．過程1需要使用耐高溫的DNA聚合酶B．過程2中的引物B可與mRNA互補配對C．游離的脫氧核苷酸只能加到引物的5′端D．RT－PCR可用于對RNA病毒的檢測與鑒定答案D解析過程1是由mRNA形成單鏈DNA的過程，為逆轉錄，該過程需要逆轉錄酶，A錯誤；過程2中的引物B可與cDNA互補配對，而mRNA與cDNA堿基互補配對，則引物B和mRNA除堿基T和U的區(qū)別外，其余序列相同，不能互補配對，B錯誤；游離的脫氧核苷酸只能加到引物的3′端，C錯誤；利用RT－PCR技術對某些微量RNA病毒進行檢測，并可提高檢測的靈敏度(因為增加了待測RNA逆轉錄產生的DNA的數量，因此便于檢測)，D正確。10．研究人員用如圖1中質粒和圖2中含目的基因的片段構建重組質粒(圖中標注了相A．構建重組質粒的過程應選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶B．使用DNA連接酶將酶切后的質粒和目的基因片段進行重組C．能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的一定是含有重組質粒的大腸桿菌D．利用PCR鑒定含目的基因的大腸桿菌時應選用引物甲和引物丙答案C解析選擇的限制酶應在目的基因兩端存在識別位點，但BamHⅠ可能使質粒中的兩種標記基因都被破壞，因此只能選BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割，A正確；酶切后的質粒和目的基因片段要用DNA連接酶連接，構建重組載體，B正確；能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的也可能是只含有質粒的大腸桿菌，C錯誤；PCR技術要求兩種引物分別和目的基因的11．(2023·哈爾濱高二期末)下列有關PCR的敘述，錯誤的是()A．PCR的原理是DNA半保留復制，解旋和復制不是同時進行的B．PCR的過程主要包括變性→延伸→復性，溫度逐漸降低C．PCR技術擴增時，一個DNA分子經過n輪復制共需引物2n－1對D．常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物答案B解析PCR的原理是DNA半保留復制，PCR技術是在較高溫度條件下打開雙鏈后進行擴增的，是先解旋后復制，A正確；PCR的過程主要包括高溫變性→低溫復性→中溫延伸，可見該過程中溫度不是逐漸降低，B錯誤。12．聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術。下列關于PCR引物的敘述，不正確的是()A．為保證模板鏈與引物結合的效率，兩種引物之間盡量避免存在互補序列B．為了便于將擴增的DNA片段與載體連接，可在引物的3′端加上限制酶識別序列C．在兩種引物上設計加入不同的限制酶識別序列，主要目的是使目的基因定向插入載體并可避免目的基因自身環(huán)化D．復性所需的溫度、時長和延伸所需的溫度、時長均與引物有關答案B解析引物自身不應存在互補序列，否則會出現引物與自身配對、引物跟引物配對情況，降低PCR的效率，A正確；引物引導子鏈合成的方向是5′端→3′端，因此為了便于擴增的DNA片段與載體連接，需要在引物的5′端加上限制酶識別序列，B錯誤；為了便于擴增的DNA片段與載體連接，常在兩條引物上設計加入不同的限制酶識別序列，主要目的是使目的基因能定向插入表達載體，避免目的基因自身環(huán)化，C正確；復性所需的溫度、時長和延伸所需的溫度、時長均與引物有關，如引物中G與C含量高，需要設定更高的復性和延伸溫度，D正確。13．基因工程中可以通過PCR技術擴增目的基因?；卮鹣铝袉栴}：(1)生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是______________。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是____________________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的_________。(2)目前在PCR反應中不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_______________________。(3)含有限制酶的細胞中通常還具有相應的甲基化酶，這兩種酶對DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以對DNA序列進行修飾，使限制酶不能對這一序列進行識別和切割。含有某種限制酶的細胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破壞細胞自身的DNA，其原因可能有：①___________________________________________________________________________________；②_________________________