DB13-T 1767-2013 蘋果品種 DNA 指紋鑒定

65.020.20B

05DB13

指紋鑒定河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局

DB13/T

1767—2013前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T

1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北省林業(yè)廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)。魏姍姍、甄紅偉、王瑞霞。IDB13/T

1767—2013蘋果品種

指紋鑒定1

范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蘋果品種DNA指紋鑒定的方法及判定標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘋果品種鑒定及河北省蘋果品種DNA2

原理不同蘋果品種由于遺傳組成不同，基因組DNA中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)有差異，這種差異可經(jīng)過PCR擴(kuò)增、電泳分離、顯色程序繪制的DNA指紋圖譜加以區(qū)分，從而對(duì)不同品種進(jìn)行鑒定。從蘋果幼苗、擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（或通過DNA分析儀、測(cè)序儀進(jìn)行分離），并通過染色顯示DNA指紋譜帶類型。3

儀器設(shè)備及試劑蘋果品種DNA指紋鑒定所需儀器設(shè)備及試劑名單見附錄A。4

溶液配制蘋果品種DNA指紋鑒定相關(guān)溶液配制方法見附錄B。5

鑒定方法5.1 樣品準(zhǔn)備5.1.1 取樣量每份送檢樣品至少檢測(cè)3個(gè)個(gè)體，每個(gè)個(gè)體至少1g，對(duì)一致性差的樣品應(yīng)至少檢測(cè)5個(gè)個(gè)體。5.1.2 品種比較方式a)

成對(duì)品種的比較送檢樣品提供兩份，一份為待檢品種，一份為對(duì)照品種。將待檢品種與對(duì)照品種直接進(jìn)行成對(duì)比較。雜交后代需提供母本與父本的樣品。b)

品種與

DNA

指紋庫(kù)入庫(kù)品種的比較

DNA

似或相同的品種作為待檢品種的近似品種，然后將待檢品種與近似品種直接進(jìn)行成對(duì)比較。5.2 DNA

提取1反應(yīng)組分原濃度終濃度反應(yīng)體積

μLddHO13.3510×1×2MgCl25mmol/L2.5mmol/L2dNTP2.5mmol/L0.15mmol/L1.2

酶5U/μL1U0.2引物20μmol/L0.25μmol/L0.25DNA30~50ng/μL1.5~2.5

ng/μL1DB13/T

1767—20135.2.1 宜采用改良的

CTAB

法。取

干凈葉片置入

500μLDNA

并加

1mL

洗滌液及

5min，于

4℃，12000

g

離心

8min

后，洗滌一次，棄上清，再加

700μL

65℃水浴

后于室溫冷卻4

于室溫

12000

g

離心

離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻后室溫靜置

5min，室溫

12000g

離心

2

淀

30

g

離心

10min，將所得沉淀風(fēng)干后溶于

水中，置

5.2.2 其它保證

質(zhì)量的方法也可采用，應(yīng)用前需要通過微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行

DNA

質(zhì)量與濃度檢測(cè)。5.3 PCR

擴(kuò)增5.3.1 SSR

擴(kuò)增基本核心引物名單見附錄C。5.3.2 反應(yīng)體系反應(yīng)液體積為20μμ表1 PCR

反應(yīng)體系5.3.3 反應(yīng)程序5.3.3 反應(yīng)程序存。5.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳5.4.1 清洗玻璃板用自來水沾洗滌靈將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗兩遍，95%乙醇擦洗兩遍，干燥。在長(zhǎng)板上涂上0.5

相污染。5.4.2 組裝電泳板待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，并用水平儀調(diào)平。2DB13/T

1767—20135.4.3 灌膠在100

mL

4

μL，迅速混勻后灌膠。待膠流動(dòng)到下部，在上部輕輕插入梳子，使其聚合至少lh以上。灌膠過程中防止出現(xiàn)氣泡。5.4.4 預(yù)電泳在正極槽中加入1×TBE緩沖液600

mL，在負(fù)極槽(上槽)加入預(yù)熱至65℃的I×TBE緩沖液600

mL，拔出梳子。90W恒功率預(yù)電泳10

5.4.5 變性在20μL

μL6×

95℃變性5min，4℃冷卻10

min以上。5.4.6 電泳μ泳至上部的指示帶(二甲苯青)到達(dá)膠板的中部(約40

緊貼在長(zhǎng)板上。5.5 銀染5.5.1 銀染流程圖固定液中輕輕晃動(dòng)固定液中輕輕晃動(dòng)

3

雙蒸水快速漂洗

1

次，不超過

10

s銀染

10~15

雙蒸水快速漂洗

1

次，不超過

10

s顯影液中輕輕晃動(dòng)至帶紋出現(xiàn)雙蒸水快速漂洗

1

次，不超過

30

s定影

固定液中定影

5

雙蒸水漂洗

1

6

結(jié)果及判定3DB13/T

1767—20136.1 數(shù)據(jù)表示譜帶記錄方式:每個(gè)核心引物的所有譜帶按擴(kuò)增片段從大到小的順序編號(hào)，用二位代碼描述(依次為01、02

..….)，并確定代表每條譜帶的一套標(biāo)準(zhǔn)品種。每個(gè)待測(cè)品種在每個(gè)引物位點(diǎn)上的譜帶號(hào)用四位代碼描述，參照標(biāo)準(zhǔn)品種確定待測(cè)品種的譜帶號(hào)。示例1：在一個(gè)核心引物上僅有一條譜帶

02，品種在該引物位點(diǎn)的譜帶代碼為

示例2：在一個(gè)核心引物上有兩條譜帶

02

和03，品種在該引物位點(diǎn)的譜帶代碼為

6.2 檢測(cè)及判定標(biāo)準(zhǔn)6.2.1 先用

17

對(duì)基本核心引物檢測(cè)，獲得待測(cè)品種在

個(gè)引物位點(diǎn)的

指紋譜帶數(shù)據(jù)，利用

17個(gè)位點(diǎn)的

指紋譜帶數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間比較。親緣關(guān)系較近難以區(qū)分時(shí)可附加

17

a)

品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同品種；b)

品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為相近品種；c)

品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為相同或極近似品種。6.2.2 對(duì)

b

和

c

17

34

個(gè)位點(diǎn)的

指紋譜帶數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間比較：a)

品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同品種；b)

品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為相近品種；c)

品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為相同或極近似品種。6.3 鑒定報(bào)告鑒定報(bào)告書格式見附錄D。4DB13/T

1767—2013AA附 錄 A（規(guī)范性附錄）儀器設(shè)備及試劑A.1 儀器設(shè)備A.1.1 PCR核酸擴(kuò)增儀:規(guī)格為96孔;A.1.2 序列分析電泳槽;A.1.3 高壓電泳儀:規(guī)格為3000

V

,

mA,

W

;A.1.4 水平搖床;A.1.5 膠片觀察燈;A.1.6 電子天平;A.1.7 微量加樣器;A.1.8 磁力攪拌器;A.1.9 高速離心機(jī)A.1.10 微量紫外分光光度計(jì)A.1.11 高壓滅菌鍋;A.1.12 pH酸度計(jì)。A.2 試劑所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水。A.2.1 乙二胺四乙酸二鈉;A.2.2 Tris堿;A.2.3 鹽酸;A.2.4 氫氧化鈉;A.2.5 10

×

Buffe:緩沖液;A.2.6 四種脫氧核苷酸:4

×

dNTP;A.2.7 Taq

DNA聚合酶;A.2.8 SSR引物;A.2.9礦物油;5DB13/T

1767—2013A.2.10 去離子甲酞胺;A.2.11 澳酚藍(lán);A.2.12 二甲苯青FF;A.2.13 甲叉雙丙烯酰胺;A.2.14 丙烯酰胺;A.2.15 硼酸;A.2.16 脲素;A.2.17 親和硅烷:97

%;A.2.18 剝離硅烷:2%二甲基二氯硅烷;A.2.19 無水乙醇;A.2.20 四甲基乙二胺(TEMED)

;A.2.21 過硫酸銨;A.2.22 冰醋酸;A.2.23 硝酸銀;A.2.24 甲醛溶液:37

%。6DB13/T

1767—2013BB附 錄 B（規(guī)范性附錄）溶液配制B.1 DNA提取溶液的配制B.1.1 0.5mol/L

EDTA溶液186.lg NaO

溶于

800

水中，用固體

NaOH

調(diào)

至

8.0，定容至

，高壓滅菌。B.1.2 1

mol/L

堿溶于適量水中，加

HCI

調(diào)

至

8.0

500

，高壓滅菌。B.1.3 洗滌液100

8.

0;

50

1M

NaC;l

巰基乙醇;

B.1.4CTAB

提取緩沖液100

（），20

，，2%

（）的

β-巰基乙醇()B.1.5 酚/氯仿/異戊醇25：24：1。B.1.6TE緩沖液1

，0.5

1

，加

HCI

調(diào)

至

8.0，定容至

。B.1.7TE緩沖液2

，0.5mol/L1

，0.5

HCI

100

，定容至

500

。B.1.8 5

mol/L

NaCI溶液146g

固體

NaCI

溶于水中，加水定容至

500

。B.2 PCR擴(kuò)增溶液的配制B.2.1 dNTP用超純水分別配制

A、G、C、T

終濃度

100

的儲(chǔ)存液。各取

混合，用超純

定容至終濃度

each

的工作液。也可直接購(gòu)買濃度

的工作液。B.2.2 SSR引物用超純水分別配制前引物和后引物終濃度均

的儲(chǔ)存液，等體積混合成

的工作7DB13/T

1767—2013液。注:干粉配制前應(yīng)首先快速離心。B.2.36×加樣緩沖液去離子甲酞胺

49

，0.5

的

溶液(pH8.0)1

，澳酚蘭

0.125g，二甲苯青

0.125g。B.3 變性聚丙烯酞胺凝膠電泳溶液的配制B.3.1 40%PAGE膠丙烯酞胺

190g

和甲叉雙丙烯酚胺

定容至

。B.3.2 4.5%PAGE膠尿素

450g，10

×

緩沖液

，

膠

，定容至

。B.3.3 Bind緩沖液49.75

無水乙醇和

250μL

冰醋酸，加水定容至

50

。B.3.4親和硅烷工作液在

緩沖液中加入

5μL

原液，混勻。B.3.5剝離硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。B.3.6 25%過硫酸銨溶液0.25g

過硫酸銨溶于

1

超純水中。B.3.7 10×TBE緩沖液

堿

108g，硼酸

55g，0.5mol/L

溶液

37

，定容至

。B.3.81×TBE緩沖液10×TBE

緩沖液

，加水定容至

。B.4 銀染溶液的配制B.4.1固定液100

冰醋酸，加水定容至

。B.4.2 染色液2g

硝酸銀，加水定容至

1000

。B.4.3 顯影液1000mL蒸餾水中加入30

g氧氧化鈉和5

mL甲醛。8標(biāo)記位點(diǎn)染色推薦正向引物序列（）反向引物序列（）CH03g121ICH02b102ICH03g073I4ICH03a095ICH03d126ICH02a047ICH01c068ICH01f03b9ICH02a0810ICH02d08ICH01F0212ICTGGTTTGTTTTCCTCCAGCCH05c0413ICH03d0814ICH02c0915ICH05a0416ICH01h0117IHi02c071CH02c02a2MS14h033CH04e024CH05f065CH03d076CH04e057CH01f098CH01h029CH02B03b10CH04g07CH04d0212CH03a0813CH03g041415CH04f1016CH05g0317注：I型標(biāo)記含首先采用的17對(duì)引物，II型標(biāo)記含候補(bǔ)采用的17對(duì)引物。DB13/T

1767—2013CC附 錄 C（規(guī)范性附錄）基本核心引物名單9DB13/T

1767—2013DD附