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文檔簡介
65.020.20B
05DB13
指紋鑒定河北省質(zhì)量技術監(jiān)督局
DB13/T
1767—2013前言本標準按照GB/T
1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由河北省林業(yè)廳提出。本標準起草單位:河北農(nóng)業(yè)大學。魏姍姍、甄紅偉、王瑞霞。IDB13/T
1767—2013蘋果品種
指紋鑒定1
范圍本標準規(guī)定了蘋果品種DNA指紋鑒定的方法及判定標準。本標準適用于蘋果品種鑒定及河北省蘋果品種DNA2
原理不同蘋果品種由于遺傳組成不同,基因組DNA中簡單重復序列的重復次數(shù)有差異,這種差異可經(jīng)過PCR擴增、電泳分離、顯色程序繪制的DNA指紋圖譜加以區(qū)分,從而對不同品種進行鑒定。從蘋果幼苗、擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(或通過DNA分析儀、測序儀進行分離),并通過染色顯示DNA指紋譜帶類型。3
儀器設備及試劑蘋果品種DNA指紋鑒定所需儀器設備及試劑名單見附錄A。4
溶液配制蘋果品種DNA指紋鑒定相關溶液配制方法見附錄B。5
鑒定方法5.1 樣品準備5.1.1 取樣量每份送檢樣品至少檢測3個個體,每個個體至少1g,對一致性差的樣品應至少檢測5個個體。5.1.2 品種比較方式a)
成對品種的比較送檢樣品提供兩份,一份為待檢品種,一份為對照品種。將待檢品種與對照品種直接進行成對比較。雜交后代需提供母本與父本的樣品。b)
品種與
DNA
指紋庫入庫品種的比較
DNA
似或相同的品種作為待檢品種的近似品種,然后將待檢品種與近似品種直接進行成對比較。5.2 DNA
提取1反應組分原濃度終濃度反應體積
μLddHO13.3510×1×2MgCl25mmol/L2.5mmol/L2dNTP2.5mmol/L0.15mmol/L1.2
酶5U/μL1U0.2引物20μmol/L0.25μmol/L0.25DNA30~50ng/μL1.5~2.5
ng/μL1DB13/T
1767—20135.2.1 宜采用改良的
CTAB
法。取
干凈葉片置入
500μLDNA
并加
1mL
洗滌液及
5min,于
4℃,12000
g
離心
8min
后,洗滌一次,棄上清,再加
700μL
65℃水浴
后于室溫冷卻4
于室溫
12000
g
離心
離心管中,加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1),充分混勻后室溫靜置
5min,室溫
12000g
離心
2
淀
30
g
離心
10min,將所得沉淀風干后溶于
水中,置
5.2.2 其它保證
質(zhì)量的方法也可采用,應用前需要通過微量紫外分光光度計進行
DNA
質(zhì)量與濃度檢測。5.3 PCR
擴增5.3.1 SSR
擴增基本核心引物名單見附錄C。5.3.2 反應體系反應液體積為20μμ表1 PCR
反應體系5.3.3 反應程序5.3.3 反應程序存。5.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳5.4.1 清洗玻璃板用自來水沾洗滌靈將玻璃板反復擦洗干凈,雙蒸水擦洗兩遍,95%乙醇擦洗兩遍,干燥。在長板上涂上0.5
相污染。5.4.2 組裝電泳板待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板,并用水平儀調(diào)平。2DB13/T
1767—20135.4.3 灌膠在100
mL
4
μL,迅速混勻后灌膠。待膠流動到下部,在上部輕輕插入梳子,使其聚合至少lh以上。灌膠過程中防止出現(xiàn)氣泡。5.4.4 預電泳在正極槽中加入1×TBE緩沖液600
mL,在負極槽(上槽)加入預熱至65℃的I×TBE緩沖液600
mL,拔出梳子。90W恒功率預電泳10
5.4.5 變性在20μL
μL6×
95℃變性5min,4℃冷卻10
min以上。5.4.6 電泳μ泳至上部的指示帶(二甲苯青)到達膠板的中部(約40
緊貼在長板上。5.5 銀染5.5.1 銀染流程圖固定液中輕輕晃動固定液中輕輕晃動
3
雙蒸水快速漂洗
1
次,不超過
10
s銀染
10~15
雙蒸水快速漂洗
1
次,不超過
10
s顯影液中輕輕晃動至帶紋出現(xiàn)雙蒸水快速漂洗
1
次,不超過
30
s定影
固定液中定影
5
雙蒸水漂洗
1
6
結(jié)果及判定3DB13/T
1767—20136.1 數(shù)據(jù)表示譜帶記錄方式:每個核心引物的所有譜帶按擴增片段從大到小的順序編號,用二位代碼描述(依次為01、02
..….),并確定代表每條譜帶的一套標準品種。每個待測品種在每個引物位點上的譜帶號用四位代碼描述,參照標準品種確定待測品種的譜帶號。示例1:在一個核心引物上僅有一條譜帶
02,品種在該引物位點的譜帶代碼為
示例2:在一個核心引物上有兩條譜帶
02
和03,品種在該引物位點的譜帶代碼為
6.2 檢測及判定標準6.2.1 先用
17
對基本核心引物檢測,獲得待測品種在
個引物位點的
指紋譜帶數(shù)據(jù),利用
17個位點的
指紋譜帶數(shù)據(jù)進行品種間比較。親緣關系較近難以區(qū)分時可附加
17
a)
品種間差異位點數(shù)≥2,判定為不同品種;b)
品種間差異位點數(shù)=1,判定為相近品種;c)
品種間差異位點數(shù)=0,判定為相同或極近似品種。6.2.2 對
b
和
c
17
34
個位點的
指紋譜帶數(shù)據(jù)進行品種間比較:a)
品種間差異位點數(shù)≥2,判定為不同品種;b)
品種間差異位點數(shù)=1,判定為相近品種;c)
品種間差異位點數(shù)=0,判定為相同或極近似品種。6.3 鑒定報告鑒定報告書格式見附錄D。4DB13/T
1767—2013AA附 錄 A(規(guī)范性附錄)儀器設備及試劑A.1 儀器設備A.1.1 PCR核酸擴增儀:規(guī)格為96孔;A.1.2 序列分析電泳槽;A.1.3 高壓電泳儀:規(guī)格為3000
V
,
mA,
W
;A.1.4 水平搖床;A.1.5 膠片觀察燈;A.1.6 電子天平;A.1.7 微量加樣器;A.1.8 磁力攪拌器;A.1.9 高速離心機A.1.10 微量紫外分光光度計A.1.11 高壓滅菌鍋;A.1.12 pH酸度計。A.2 試劑所用試劑均為分析純,所用水均為去離子水。A.2.1 乙二胺四乙酸二鈉;A.2.2 Tris堿;A.2.3 鹽酸;A.2.4 氫氧化鈉;A.2.5 10
×
Buffe:緩沖液;A.2.6 四種脫氧核苷酸:4
×
dNTP;A.2.7 Taq
DNA聚合酶;A.2.8 SSR引物;A.2.9礦物油;5DB13/T
1767—2013A.2.10 去離子甲酞胺;A.2.11 澳酚藍;A.2.12 二甲苯青FF;A.2.13 甲叉雙丙烯酰胺;A.2.14 丙烯酰胺;A.2.15 硼酸;A.2.16 脲素;A.2.17 親和硅烷:97
%;A.2.18 剝離硅烷:2%二甲基二氯硅烷;A.2.19 無水乙醇;A.2.20 四甲基乙二胺(TEMED)
;A.2.21 過硫酸銨;A.2.22 冰醋酸;A.2.23 硝酸銀;A.2.24 甲醛溶液:37
%。6DB13/T
1767—2013BB附 錄 B(規(guī)范性附錄)溶液配制B.1 DNA提取溶液的配制B.1.1 0.5mol/L
EDTA溶液186.lg NaO
溶于
800
水中,用固體
NaOH
調(diào)
至
8.0,定容至
,高壓滅菌。B.1.2 1
mol/L
堿溶于適量水中,加
HCI
調(diào)
至
8.0
500
,高壓滅菌。B.1.3 洗滌液100
8.
0;
50
1M
NaC;l
巰基乙醇;
B.1.4CTAB
提取緩沖液100
(),20
,,2%
()的
β-巰基乙醇()B.1.5 酚/氯仿/異戊醇25:24:1。B.1.6TE緩沖液1
,0.5
1
,加
HCI
調(diào)
至
8.0,定容至
。B.1.7TE緩沖液2
,0.5mol/L1
,0.5
HCI
100
,定容至
500
。B.1.8 5
mol/L
NaCI溶液146g
固體
NaCI
溶于水中,加水定容至
500
。B.2 PCR擴增溶液的配制B.2.1 dNTP用超純水分別配制
A、G、C、T
終濃度
100
的儲存液。各取
混合,用超純
定容至終濃度
each
的工作液。也可直接購買濃度
的工作液。B.2.2 SSR引物用超純水分別配制前引物和后引物終濃度均
的儲存液,等體積混合成
的工作7DB13/T
1767—2013液。注:干粉配制前應首先快速離心。B.2.36×加樣緩沖液去離子甲酞胺
49
,0.5
的
溶液(pH8.0)1
,澳酚蘭
0.125g,二甲苯青
0.125g。B.3 變性聚丙烯酞胺凝膠電泳溶液的配制B.3.1 40%PAGE膠丙烯酞胺
190g
和甲叉雙丙烯酚胺
定容至
。B.3.2 4.5%PAGE膠尿素
450g,10
×
緩沖液
,
膠
,定容至
。B.3.3 Bind緩沖液49.75
無水乙醇和
250μL
冰醋酸,加水定容至
50
。B.3.4親和硅烷工作液在
緩沖液中加入
5μL
原液,混勻。B.3.5剝離硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。B.3.6 25%過硫酸銨溶液0.25g
過硫酸銨溶于
1
超純水中。B.3.7 10×TBE緩沖液
堿
108g,硼酸
55g,0.5mol/L
溶液
37
,定容至
。B.3.81×TBE緩沖液10×TBE
緩沖液
,加水定容至
。B.4 銀染溶液的配制B.4.1固定液100
冰醋酸,加水定容至
。B.4.2 染色液2g
硝酸銀,加水定容至
1000
。B.4.3 顯影液1000mL蒸餾水中加入30
g氧氧化鈉和5
mL甲醛。8標記位點染色推薦正向引物序列()反向引物序列()CH03g121ICH02b102ICH03g073I4ICH03a095ICH03d126ICH02a047ICH01c068ICH01f03b9ICH02a0810ICH02d08ICH01F0212ICTGGTTTGTTTTCCTCCAGCCH05c0413ICH03d0814ICH02c0915ICH05a0416ICH01h0117IHi02c071CH02c02a2MS14h033CH04e024CH05f065CH03d076CH04e057CH01f098CH01h029CH02B03b10CH04g07CH04d0212CH03a0813CH03g041415CH04f1016CH05g0317注:I型標記含首先采用的17對引物,II型標記含候補采用的17對引物。DB13/T
1767—2013CC附 錄 C(規(guī)范性附錄)基本核心引物名單9DB13/T
1767—2013DD附
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