DB34∕T 2997-2017 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢驗操作規(guī)程

DB34DB34/T2997—2017豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢驗操作規(guī)程ProtocolofexaminationforActinobacilluspleuropneumoniae安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培NY/T537豬放線桿菌胸膜肺炎診3.4冰箱：2℃~5℃,-20℃。23.21緩沖葡萄糖蛋白胨水：按照GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行。3.22蛋白胨水：按照GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行。3.23硫酸亞鐵瓊脂：按照GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行。3.24硝酸鹽培養(yǎng)基與硝酸鹽還原試劑：按照GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行。3.25氧化酶試劑：按照GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行。3.27無菌PBS溶液：制備方法見附錄A中A.6?！谭蛛x培養(yǎng)血平板培養(yǎng)基等顯微鏡檢查選取可疑菌改良B肉湯培養(yǎng)基不3無菌操作采集動物血，每頭不少于10mL。自然凝固后無菌分離血清，分裝，加蓋密封后4～8℃存于飽和氯化鈉溶液或30％甘油緩沖鹽水溶液5.2.2豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌形態(tài)學特征：革蘭氏陰性小球桿菌或纖細的小桿nm，長度60～450nm。有莢膜和菌毛，不形成芽孢且無鞭毛，有的成雙排列。新鮮5.3.1對沒有受污染的新鮮病料用經(jīng)火焰滅菌并冷卻的接種環(huán)蘸取病料內(nèi)部組ONPG試驗、尿素酶試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗陽性，靛基質(zhì)試驗、甲基紅試驗、V-P試45.5.1豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌對小鼠、大鼠、豚鼠、家兔均有致病力，其湯純培養(yǎng)物做動物試驗用。小鼠腹腔注射組織懸液0.2mL或純培養(yǎng)菌液0.1有纖維素性胸膜肺炎等癥狀，肝部腫大。以死亡小鼠的心血或臟器制成涂片，革++++++------7.1綜合以上培養(yǎng)形態(tài)與染色特性，生化5培養(yǎng)基的配制20min。待培養(yǎng)基冷卻至55℃左右時,以無菌方式添加無菌綿羊血，混勻，傾注無菌平皿，4℃保存?zhèn)浯囵B(yǎng)基冷卻至55℃左右時，每管均添加NAD(10～30μL/mL)以及無菌6將24.0gTSA–YE瓊脂溶于500mL超純水中，充分攪拌，待完全溶解混勻后，121℃高壓滅菌將24.0gTSA–YE瓊脂溶于500mL超純水中，充分攪拌，待完全溶解混勻后，121℃高壓滅菌20min。待培養(yǎng)基冷卻至80℃左右時,以無菌方式添加無菌綿羊血，混勻，傾注無菌平皿，4℃保存?zhèn)?將1.5g十二水合磷酸氫二鈉、0.1g氯化鉀、4.0g氯化鈉、0.1g磷酸二氫鉀溶于500mL8上游引物：5′-GATAAACCTTTT9DB34/T2997—2目的基因大小為342bp。陽性對照擴增出342bp,陰性空白對照孔未見有PCR擴增條帶，表明試驗成立，否則應(yīng)重做。試驗成立，被檢樣品孔如發(fā)現(xiàn)有342bp大小的擴增條帶，則判定陽性(十),豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測結(jié)果電泳圖見圖B.1;被檢樣品孔如未