四講非編碼數(shù)據(jù)分析

第四講非編碼RNA數(shù)據(jù)分析PartI非編碼RNA的概念PartIImiRNA概念、數(shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)庫應(yīng)用PartIII案例：miRNA-mRNA雙重表達(dá)譜的聯(lián)合分析PartIV案例：SNP-miRNA聯(lián)合分析PartVlncRNA概念及數(shù)據(jù)庫介紹PartI非編碼RNA的概念人類基因組絕大部分都被轉(zhuǎn)錄成RNA，細(xì)胞內(nèi)非編碼RNA的數(shù)量是編碼RNA的上百倍。這促使許多科學(xué)家認(rèn)為生物體復(fù)雜性被隱藏在它們所輸出的非編碼RNA內(nèi)，而非編碼序列內(nèi)。隨著ncRNA在復(fù)雜疾病中的研究深入，研究者發(fā)現(xiàn)其在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著巨大的作用，其功能異常能夠?qū)е赂鞣N人類復(fù)雜疾病的發(fā)生。這將使ncRNA可能成為疾病診斷、預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)記（biomarker），并為更進(jìn)一步理解復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)理提供了新的手段。PartIImiRNA概念、數(shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)庫應(yīng)用一、miRNA概述miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性非編碼RNA，長度在19~24nt(核苷酸數(shù)），通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-InducedSilencingComplex,RISC）和其靶基因3‘非翻譯區(qū)（3’untranslatedregion,3‘UTR）結(jié)合，導(dǎo)致其靶mRNA的降解或阻礙其靶mRNA的翻譯。研究表明miRNA在諸如生長發(fā)育等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。隨著miRNA在復(fù)雜疾病中的深人研究，研究者發(fā)現(xiàn)其在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著巨大的作用，其功能異常能夠?qū)е赂鞣N人類復(fù)雜疾?。ɡ绨┌Y、心血管疾病等）的發(fā)生。這將使miRNA成為疾病診斷、預(yù)后的新的biomarker，并為進(jìn)一步揭示復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的方向。（一）miRNA定義miRNA的生物合成過程miRNA前體miRNA初產(chǎn)物miRNAgene轉(zhuǎn)錄剪切剪切

成熟的miRNA（二）miRNA的生物合成（三）miRNA的命名規(guī)則hsa-miR-181a-2*hsa人，mus小鼠，rat大鼠let，lin,mir，miR,181：編號，按注冊順序a：與已注冊的miRNA序列高度同源2:由不同染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄加工而成的具有相同成熟體序列的miRNA,則在后面加上阿拉伯?dāng)?shù)字以區(qū)分*：如果一個(gè)前體的2個(gè)臂分別產(chǎn)生miRNA,則根據(jù)克隆實(shí)驗(yàn),在表達(dá)水平較低的miRNA后加“*”

hsa-miR-188-5p（或hsa-miR-188-3p）5p：表示從5‘端的臂加工而來；3p：表示從3‘端的臂加工而來（四）miRNA的作用機(jī)制

通過和靶基因3′UTR（3′非翻譯區(qū)）結(jié)合導(dǎo)致RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,簡稱RISC）降解其靶mRNA或阻礙其靶的翻譯。miRNA通過部分互補(bǔ)序列與靶mRNA結(jié)合。一個(gè)miRNA可與不同靶mRNA結(jié)合，同一家族miRNA可作用相同靶mRNA。二、基于序列的miRNA靶基因預(yù)測方法miRNA靶基因預(yù)測遵循的基本原則miRandaTargetScan

基本步驟在3′UTR上探尋和miRNA“種子區(qū)”完全互補(bǔ)的序列；計(jì)算miRNA和這些序列結(jié)合產(chǎn)生的自由能下降值，對靶點(diǎn)進(jìn)行篩選；對靶點(diǎn)進(jìn)行物種間序列比對，利用物種保守性進(jìn)一步篩選。

整合已有知識預(yù)測miRNA靶基因在當(dāng)前的miRNA靶基因預(yù)測研究中，研究人員逐漸意識到單一依靠序列信息或表達(dá)信息已不能繼續(xù)提高miRNA靶基因預(yù)測效能。整合功能信息、蛋白質(zhì)互作信息、表達(dá)信息、序列信息以及當(dāng)前實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miRNA靶基因等已有資源預(yù)測miRNA靶基因十分必要。1）miRBase數(shù)據(jù)庫miRBase（）數(shù)據(jù)庫是一個(gè)集miRNA序列、注釋信息以及預(yù)測的靶基因數(shù)據(jù)為一體的數(shù)據(jù)庫，是目前存儲miRNA信息最主要的公共數(shù)據(jù)庫之一，可允許用戶使用關(guān)鍵詞或序列在線搜索已知的miRNA和靶基因信息。三、miRNA數(shù)據(jù)庫資源

該數(shù)據(jù)庫提供了新發(fā)現(xiàn)的miRNA命名服務(wù)；應(yīng)用深度測序注釋miRNA;已發(fā)布的成熟miRNA序列;miRNA靶基因等；同時(shí)提供對應(yīng)的預(yù)測的發(fā)卡結(jié)構(gòu)、注釋信息以及與其他數(shù)據(jù)庫的鏈接等。

TarBase是一個(gè)目前使用廣泛的存儲實(shí)驗(yàn)檢測的miRNA與靶基因間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，涵蓋多種實(shí)驗(yàn)方法檢測的超過65000個(gè)miRNA與靶基因關(guān)系對。2）TarBase數(shù)據(jù)庫TarBase數(shù)據(jù)庫界面介紹

miRNAMAPTargets（）該數(shù)據(jù)庫搜集了多個(gè)物種的經(jīng)過試驗(yàn)證明的microRNA和miRNA靶基因，其中包括人類的、小鼠的、大鼠的以及其他多細(xì)胞動(dòng)物的基因組。3）miRNAMap數(shù)據(jù)庫（）例如搜索一個(gè)miRNA，名稱為hsa-mir-145，如圖所示，點(diǎn)擊“Search”按鈕。

搜索結(jié)果如圖所示。點(diǎn)擊has-mir-145，查看詳情。hsa-miR-145的發(fā)卡結(jié)構(gòu)查看更多的靶基因信息點(diǎn)擊download進(jìn)行下載。點(diǎn)擊靶向基因，可獲得該基因的相關(guān)信息。miRNA表達(dá)譜四、microRNA芯片數(shù)據(jù)分析制作芯片差異表達(dá)miRNA數(shù)據(jù)分析miRNA表達(dá)譜預(yù)處理miRNA表達(dá)譜M個(gè)miRNAN1個(gè)疾病樣本、N2個(gè)正常樣本

miRNA的數(shù)據(jù)格式利用表達(dá)譜尋找復(fù)雜疾病相關(guān)miRNA

差異表達(dá)miRNA分析（Fold_change,t-test,SAM,Cluster,Subtype……）miRNA功能預(yù)測miRNA表達(dá)譜的基因組范圍研究指出原發(fā)癌中存在miRNA的表達(dá)變化特異的miRNA表達(dá)譜與特定類型的癌癥有關(guān)，提示其有用于診斷的潛能miRNA作用靶基因是重要的癌通路組成部分，參與了癌基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控五、microRNA與癌癥PartIII案例：miRNA-mRNA兩種表達(dá)譜的聯(lián)合分析miRNA-mRNA靶向關(guān)系皮爾森相關(guān)系數(shù)通過GEO網(wǎng)站，獲取前列腺癌的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)平臺為GSE8126，數(shù)據(jù)中包括了60個(gè)前列腺癌組織樣本和15個(gè)正常前列腺組織樣本。通過對數(shù)據(jù)的預(yù)處理（中心化，對數(shù)變換和標(biāo)準(zhǔn)化），獲得了326個(gè)miRNA的表達(dá)值。定義差異表達(dá)miRNA為：P<0.05以及FDR<0.01。同時(shí)計(jì)算Fold_change，如果Fold_change>1.5，則認(rèn)為該miRNA的表達(dá)是上調(diào)的，而當(dāng)Fold_change<1/1.5時(shí)，則認(rèn)為該miRNA的表達(dá)是下調(diào)的。miRNA表達(dá)譜的數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了117個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中有15個(gè)差異表達(dá)的miRNA是下調(diào)的有20個(gè)差異表達(dá)的miRNA是上調(diào)的。將上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行層次聚類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚類的效果非常好，下調(diào)的miRNA聚在一起，上調(diào)miRNA聚在一起，腫瘤組織樣本和正常樣本分別聚在了一起。GEO網(wǎng)站獲取前列腺癌的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)平臺為GSE6956，數(shù)據(jù)中包括了60個(gè)前列腺癌組織樣本和15個(gè)正常前列腺組織樣本。通過對數(shù)據(jù)的預(yù)處理（中心化、對數(shù)變換和標(biāo)準(zhǔn)化），獲得了13,787個(gè)mRNA（基因）的表達(dá)值。采用和miRNA表達(dá)譜相同的處理方法，差異表達(dá)mRNA（基因）的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05以及FDR<0.01。如果Fold_change>1.5，則認(rèn)為該基因的表達(dá)是上調(diào)的，如果Fold_change<1/1.5，則認(rèn)為該基因的表達(dá)是下調(diào)的。按照同樣的篩選標(biāo)準(zhǔn)，mRNA表達(dá)譜的數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了9,054個(gè)差異表達(dá)的mRNA（基因）。其中有35個(gè)差異表達(dá)的mRNA（基因）是下調(diào)的，有36個(gè)差異表達(dá)的mRNA（基因）是上調(diào)的。聚類結(jié)果如圖所示。應(yīng)用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫下載miRNA和靶基因的靶向關(guān)系（最好用3-4個(gè)數(shù)據(jù)庫），對mRNA和miRNA的表達(dá)值做相關(guān)性分析，并計(jì)算相應(yīng)的Pearson相關(guān)系數(shù)，分析其調(diào)控關(guān)系。例如，我們選擇一個(gè)下調(diào)的miRNA，hsa-miR-137，從其對應(yīng)的靶向基因中找出上調(diào)的靶向基因：HOXC4、NPIPL3和WSB1。分別計(jì)算出了miR-137和HOXC4的Pearson相關(guān)系數(shù)為r=-0.5566（p=2.15E-07）；miR-137和NPIPL3的Pearson的相關(guān)系數(shù)為r=-0.7366（p=4.98E-04）；miR-137和WSB1的Pearson相關(guān)系數(shù)為r=-0.7959（p=1.44E-17）。miR-137和HOXC4的反向調(diào)控miR-137和NPIPL3的反向調(diào)控miR-137和WSB1的反向調(diào)控對miRNA和mRNA的靶向失調(diào)關(guān)系作一個(gè)列聯(lián)表，可獲得如下表：miRNA靶向基因的表達(dá)miRNA表達(dá)miRNA上調(diào)miRNA下調(diào)靶向基因上調(diào)80靶向基因下調(diào)1315計(jì)算得Fisher:P=0.011miRNA與其靶向基因的調(diào)控模式該結(jié)果說明miRNA的表達(dá)與其靶基因的表達(dá)有關(guān)系。應(yīng)用R軟件psych軟件包批量作miRNA-mRNA的相關(guān)分析數(shù)據(jù)格式56個(gè)樣本，10個(gè)miRNA和100個(gè)mRNA(基因）將數(shù)據(jù)命名為mirmcor.csv，并存于d盤中。library(psych)read.table("d:\\mirmcor.csv",header=TRUE,sep=",")->acts<-corr.test(a[1:10],a[11:110])write.csv(cts$r,file="d://corr.csv")write.csv(cts$p,file="d://corp.csv")程序如下：用excel表打開corr.csv數(shù)據(jù)文件：相關(guān)系數(shù)矩陣p值矩陣用excel表打開corp.csv數(shù)據(jù)文件：PartIVSNP-miRNA聯(lián)合分析案例Saunders,M.A.等對人類474個(gè)miRNAs的SNPs進(jìn)行系統(tǒng)的分析發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)在miRNA序列內(nèi)的密度低于其周圍的側(cè)翼序列。

一、SNP與microRNA的關(guān)系1）影響miRNA的表達(dá)Duan等人在研究miR-125時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因位點(diǎn)存在SNP，含有miR-125a-G/U兩種等位，其中miR-125a-U能夠顯著影響DGCR8與pri-miRNA-125a的結(jié)合與剪接，使成熟的miR-125a生成減少，使miR-125a對靶基因Lin-128的翻譯抑制作用減弱。2）產(chǎn)生新的miRNA在miR-146a前體的莖環(huán)上存在的SNP（rs2910164）不僅會影響miR-146a的表達(dá)，而且會導(dǎo)致miR-146a*C和miR-146a*G兩種miRNA的產(chǎn)生。3）與3′UTR區(qū)域結(jié)合對mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控位于成熟miRNA序列的多態(tài)會影響對靶基因的調(diào)控，消除、弱化、增強(qiáng)或者產(chǎn)生新的結(jié)合靶點(diǎn)。位于靶點(diǎn)附近的多態(tài)位點(diǎn)可能會改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)從而影響miRNA與靶基因的結(jié)合。

SNP-miRNA案例分析將冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的全基因組關(guān)聯(lián)分析提取出的風(fēng)險(xiǎn)SNP,通過SNPnexus工具（）尋找該SNP所在的miRNA前體或鄰近上下游1000bp區(qū)域。目前，對于人類，已發(fā)現(xiàn)了1048個(gè)miRNA前體和30,442,771個(gè)SNP，但是有SNP存在的miRNA僅有440個(gè)（其中，有178個(gè)SNP位于miRNA的成熟序列，50個(gè)SNP位于miRNA的種子序列。有177個(gè)miRNA含有的SNP多于1個(gè)）。將提取的風(fēng)險(xiǎn)SNP映射到基因上，并將這些基因作為靶基因，由Targetscan映射出受其調(diào)控的miRNA。同時(shí)將通過miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析獲得的差異表達(dá)的miRNA和通過SNP和Targetscan映射獲得的miRNA對應(yīng)起來，識別出與冠狀動(dòng)脈疾病相關(guān)的miRNA。（1）全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析通過全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析，提取出1509個(gè)風(fēng)險(xiǎn)SNP（p<0.01）與冠狀動(dòng)脈疾病相關(guān)。通過搜索SNPnexus網(wǎng)絡(luò)工具，僅搜索到一個(gè)SNP：rs6505162（p=0.032）是位于miRNA上，該miRNA為miR-423（2）搜索位于miRNA上的SNP（3）差異表達(dá)的miRNA按照p<0.01和FDR<0.1的標(biāo)準(zhǔn)，識別出164個(gè)差異表達(dá)的miRNA；下表列出了排在前10位的差異表達(dá)的miRNA。Top10differentiallyexpressedmiRNAsmicroRNAFold-changetpFDRhsa-miR-12471.03-6.690.0000010.0006hsa-miR-526b1.03-6.560.0000010.0006hsa-miR-12430.976.140.0000040.0007hsa-miR-299-3p0.976.010.0000050.0007hsa-miR-12361.04-5.960.0000050.0007hsa-miR-551b*1.04-5.960.0000050.0007hsa-miR-6140.985.870.0000070.0007hsa-miR-548g1.04-5.830.0000070.0007hsa-miR-12781.04-5.810.0000080.0007hsa-let-7f-2*1.06-5.750.0000090.0008按照p<0.01的標(biāo)準(zhǔn)，我們將提取的風(fēng)險(xiǎn)SNP映射到基因上，獲得風(fēng)險(xiǎn)基因。將風(fēng)險(xiǎn)基因映射到miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫Targetscan中，獲得了調(diào)控這些靶基因的miRNA。miRNATargetgeneGenefunctionhsa-let-7aCDK6Cyclin-dependentkinase6hsa-let-7aNF2cDNAFLJ61733,highlysimilartoMerlinhsa-let-7dBDNFBrain-derivedneurotrophicfactorhsa-miR-125bVDRUncharacterizedproteinhsa-miR-126CRKAdaptermoleculecrkhsa-miR-143FNDC3BFibronectintypeIIIdomain-containingprotein3Bhsa-miR-146aKITMast/stemcellgrowthfactorreceptorKithsa-miR-17-5pPTPROProteintyrosinephosphatase,receptortype,O,isoformCRA_dhsa-miR-197ACVR1Activinreceptortype-1hsa-miR-21WFS1Wolframinhsa-miR-222SOD2Superoxidedismutasehsa-miR-223LMO2Rhombotin-2hsa-miR-29bCOL4A2Collagenalpha-2(IV)chainhsa-miR-34aGRM7Metabotropicglutamatereceptor7將上表中的miRNA與164個(gè)差異表達(dá)的miRNA相對應(yīng)，發(fā)現(xiàn)僅有miR-146a是重疊的miRNA。事實(shí)上，已有研究證實(shí)在miR-146a前體中的個(gè)別SNP可以降低成熟miRNA的表達(dá)，從而影響疾病的形成。microRNA與其靶向基因（4）通過Targetscan獲得調(diào)控風(fēng)險(xiǎn)基因(SNP)的miRNA案例：SNP-miRNA結(jié)合分析miRNA-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)及模塊識別了5個(gè)平均S分?jǐn)?shù)較高且顯著的miRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)模塊與MISIM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較MISIM(基于功能相似度的miRNA互作關(guān)系）

PartVlncRNA概念及數(shù)據(jù)庫介紹

lncRNA又稱為長鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)，是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。

研究表明,lncRNA在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，成為遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。一、lncRNA的概念正義(Sense)lncRNA

反義(Antisense)lncRNA雙向(Bidirectional)lncRNA基因內(nèi)(Intronic)lncRNA基因間(Intergenic)lncRNA二、lncRNA的類型根據(jù)它們相對于蛋白編碼基因的位置，分為以下類型三、lncRNA與腫瘤2012年斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究人員進(jìn)行首個(gè)大型的癌癥lncRNA表達(dá)譜分析。對64個(gè)腫瘤樣品高通量RNA-seq測序，在各種腫瘤類型之間找出差異表達(dá)的1065個(gè)lncRNA，并認(rèn)為lncRNA可以成為生物標(biāo)志物。目前已有大量研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，某些特定的lncRNA的表達(dá)水平會發(fā)生改變，這種表達(dá)水平的變化可以作為癌癥診斷的標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)。lncRNA表達(dá)譜分類人類癌癥近些年，高通量技術(shù)（如GWAS，全基因組關(guān)聯(lián)分析）已經(jīng)確定大量和疾病相關(guān)的SNP。因此，如果該SNP是位于一個(gè)lncRNA上的話，很可能是該SNP影響了該lncRNA的功能，從而和疾病有關(guān)。lncRNA多態(tài)與腫瘤乳頭狀甲狀腺癌（papillarythyroidcarcinoma，PTC）相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)SNP（rs944289）位于一個(gè)lncRNA（PTCSC3）的上游3.2kb處，這個(gè)風(fēng)險(xiǎn)SNP可以影響該lncRNA的表達(dá)，并闡明了這個(gè)SNP通過影響lncRNA功能導(dǎo)致乳頭狀甲狀腺癌發(fā)生的致病機(jī)制。案例四、lncRNA的數(shù)據(jù)分析lncRNA和其臨近的蛋白編碼基因、miRNA等功能分子也具有功能相關(guān)性，并且lncRNA數(shù)據(jù)格式也為表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)，因此數(shù)據(jù)分析可參照基因表達(dá)數(shù)據(jù)，miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的分析流程。表型數(shù)據(jù)

互作網(wǎng)絡(luò)表達(dá)數(shù)據(jù)

SNP整合