DB34T 1891-2013 活毒疫苗中禽白血病病毒污染檢測(cè)技術(shù)規(guī)程　

DB34DB34/T1891—2013活毒疫苗中禽白血病病毒污染檢測(cè)技術(shù)規(guī)程DiagnosticTechnologySpecificationonAvianLeukosisVirusContaminationofLiveAttenuatedVaccine安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I雞白血病是由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒（ALV）引起的雞的傳染性腫瘤疾病，重，活毒疫苗的污染是引起傳播的重要因素，檢測(cè)活毒疫苗中ALV的污染對(duì)防控雞白血病具有重要意1NY/T680-2003禽白血病病毒p27抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法50羽份。取100ul稀釋液進(jìn)行ELI4檢測(cè)方法4.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA按NY/T680-2003的要求進(jìn)行，試驗(yàn)成立條件略注：也可選擇市售商品化p27抗原ELTaq酶、dNTP、DNAMarker、瓊脂糖、細(xì)胞裂解液、酚、氯仿、異戊醇、ddH2O、7），2c)加入等體積酚、氯仿、異戊醇（25:24:1),室溫振蕩5min，靜置5min。4℃,12000rpm離分鐘，讓乙醇揮發(fā)干凈。加入20～302211DNA模版2注：根據(jù)禽白血病病毒各亞群pol基因序列相對(duì)保守的特點(diǎn)，在其保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)1對(duì)引物5’-CTAACGAGGCGAGGGAATG-3’，下游5’-TTGGTGGGTTGGGTGGAGA-3’，擴(kuò)增泳液直至淹沒(méi)凝膠。取6μL～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL～2μ3在其中一孔內(nèi)加入與樣品相同體積的DNAMarker,在電壓80V～100V或在電流40mA～50mA電泳電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上打開(kāi)紫外燈觀察。陽(yáng)性對(duì)照在214b條帶，而陰性對(duì)照無(wú)任何條帶則實(shí)驗(yàn)成立。若被檢樣品在214bp處有明顯條帶，可判為陽(yáng)性；否則為陰性，見(jiàn)圖1。bp250圖1禽白血病病毒(ALV)P27抗原PCR陽(yáng)性參考圖M:Marker;1:陰性對(duì)照；2～6:陽(yáng)性條帶。4稱取1MTris溶液160ml用分析純A.6細(xì)胞裂解液的配制A.750×TAE緩沖液（貯存液）配制Tris堿242g，冰醋酸57.0mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL攪拌溶解后，用NaOH調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至1000mL，常溫保持備用。A.81×TE緩沖溶液的配置5ml