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DB34DB34/T2905—2017辣椒疫霉菌檢測(cè)鑒定方法MethodfordetectionandidentificationofPhytophthoracapsici2017-06-30發(fā)布2017-07-30實(shí)施安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。1征及其所引致病害的癥狀參見附錄A。將上述某一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基與去離子水按1:9比例稀釋,在121℃下高壓蒸汽滅菌20將某一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃~60℃時(shí),按每升培養(yǎng)基需青霉素50mg、五氯硝基苯50mg、2將新鮮病組織表面用自來水沖洗干凈,稍涼干,從病健交接部位將病組織塊,沿培養(yǎng)皿周緣直接置于選擇性培養(yǎng)基平板上,在培養(yǎng)箱中25℃~28℃條件下培養(yǎng)2d~3d,待觀察培養(yǎng)4d左右的菌落形態(tài),并沿菌落邊緣挑取少量菌絲,置于顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài):如選取與取樣作物相同品種的健康植株或組織5株(個(gè)),先在接種部位用接種針扎幾個(gè)小孔,再切取經(jīng)純培養(yǎng)的分離物菌絲塊回接到創(chuàng)傷部位,也可用濃度為5×103個(gè)/mL的游動(dòng)孢子懸浮液接種,接種后均需用浸水棉球保濕2d~3d,在25℃~28℃的條件下培養(yǎng)5d左右,觀測(cè)是否發(fā)病、病害3以5’-GTCTTGTACCCTATCATGGCG-3’和5’-CGCCACAGCAGGAAAAGCATT-3’為特異性引物,每25μL經(jīng)形態(tài)學(xué)觀測(cè),與對(duì)照菌株和附錄A描述的形態(tài)相似的分離物可初步確診為辣椒疫霉;經(jīng)PCR擴(kuò)增,能擴(kuò)增出與對(duì)照菌株相同的560bp單一明亮條帶4菌絲形態(tài)簡(jiǎn)單,無隔、多核、多分枝,粗3μm~10μm。孢囊梗不規(guī)則分枝或傘形分枝,細(xì)長(zhǎng),),≥5μm,但也有部分孢子囊乳突較薄;孢子囊基部圓形或漸尖;孢μm,平均長(zhǎng)度>20μm;孢子囊成熟后直接萌發(fā)或釋放游動(dòng)孢子,球形或不規(guī)則形異宗配合,配對(duì)培養(yǎng)易產(chǎn)生大量球形藏卵器,直徑20μm為棍棒狀,少數(shù)為圓錐形。雄器球形或圓筒形,圍生,無色,(10μm~20μm)×(9μm~14μm)。其鑒別特征為:乳突明顯,脫落孢子囊具長(zhǎng)51.將菌絲進(jìn)行低溫冷凍干燥處理(﹥24h保存在-20℃

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