神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法及應(yīng)用

神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法及應(yīng)用

組織塊培養(yǎng)→分離細(xì)胞培養(yǎng)→甚至單一型細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)組織得植塊培養(yǎng)法懸滴培養(yǎng)方法單蓋玻方法雙蓋玻方法1925改良雙蓋玻方法培養(yǎng)物:

CNS灰質(zhì)、白質(zhì)、外周神經(jīng)節(jié)或神經(jīng)小段↓↓突起非神經(jīng)元外伸優(yōu)點(diǎn)

所需培養(yǎng)液量少,可反應(yīng)組織代謝中微量生化改變保留了植塊內(nèi)組織特征不足

培養(yǎng)空間小,O2CO2供少培養(yǎng)空間濕度難以控制,水分會(huì)蒸發(fā)密封手續(xù)繁雜,不利更換培養(yǎng)液,難以觀察單個(gè)神經(jīng)元生長(zhǎng)。神經(jīng)元得分離細(xì)胞培養(yǎng)方法1956年,Nakai首創(chuàng)了神經(jīng)組織得分離培養(yǎng)方法材料來(lái)源:胚胎動(dòng)物神經(jīng)組織神經(jīng)元增殖發(fā)生于胚胎期形態(tài)學(xué)分化和化學(xué)分化程度低,體外存活強(qiáng),成熟后則相反,且神經(jīng)元會(huì)受到大得普遍損傷。部位:灰質(zhì)、PNS神經(jīng)節(jié),神經(jīng)元集中,密度大神經(jīng)元得體外培養(yǎng)液

天然合成成分血清血漿胚胎撮液人工培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基化學(xué)限定性培養(yǎng)基常用得:DMEM+添加劑

F12①葡萄糖為神經(jīng)元能量代謝主要來(lái)源33mm②CO2NaHCO3緩沖系統(tǒng)重要HEPESO2耗量更高③K+

神經(jīng)元生理活動(dòng)得重要離子,K+就是神經(jīng)元存活所必需得,K+24、5mM能提高神經(jīng)元存活,促分化④非神經(jīng)元成分得抑制有2-3天神經(jīng)元無(wú)血清限定培養(yǎng)液

人工合成得培養(yǎng)基雖然具備了細(xì)胞生長(zhǎng)得基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽類,但仍無(wú)法滿足不同類型細(xì)胞得特殊需要。大多數(shù)神經(jīng)元在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中即使能夠存活也為期不長(zhǎng),更難以分裂。因此可根據(jù)神經(jīng)元得特性,給基礎(chǔ)培養(yǎng)中再添加某些特殊物質(zhì)。選擇添加劑得基本過(guò)程

限定連續(xù)細(xì)胞系得體外生長(zhǎng)條件。試定該細(xì)胞系來(lái)源得細(xì)胞得培養(yǎng)液條件。11大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流Bottenstein實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)如下添加劑比較好

人轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島素、硒酸鈉、孕酮、腐胺加入到F12與DMEM1:1混液中,可以代替血清添加物,用來(lái)培養(yǎng)大鼠CNS得成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞。刪去其中任何一種添加物都可導(dǎo)致成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況銳減。該實(shí)驗(yàn)室共列出了三種神經(jīng)元限定性培養(yǎng)添加物得配方,代號(hào)分別為N1、N2、N3。N1得配方為胰島素5μg/ml

轉(zhuǎn)鐵蛋白5μg/ml

孕酮20nM

腐胺100Um

硒30nM神經(jīng)體外培養(yǎng)得生長(zhǎng)基質(zhì)

膠元多聚賴氨酸

LN神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)操作程序表

脊髓后根節(jié)大腦皮質(zhì)孕18~20天大鼠胚胎新生1~3天大鼠

在CMF-Hanks液中取出組織除去腦膜

與CMF-Hanks液一起移至離心管

舍棄CMF-Hanks液,再加入5ml0、25%胰蛋白酶和5滴0、2%Dnase液

370C,30min

舍棄胰蛋白酶,加入5ml培養(yǎng)液和10滴Dnase液

用巴斯德吸管吹打20次,再用套有微量加樣器頭得加樣器吹打20次

若有組織殘?jiān)?將上清移至新試管再加3ml培養(yǎng)液反復(fù)吹打

將細(xì)胞懸液收集于離心管,離心1200r/min,8min,舍去上清,向沉淀加培養(yǎng)液,離心1200r/min,8min

加入培養(yǎng)液調(diào)整懸液中得細(xì)胞濃度,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞為1×107

種入涂有poly-D-lysine得蓋片上,每片50μl

放入CO2孵箱中過(guò)夜

次日加3ml培養(yǎng)液

2天后(培養(yǎng)得第三天)換入有DNA合成陰斷劑得培養(yǎng)液神經(jīng)元得分離培養(yǎng)過(guò)程大鼠大腦皮層神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)組織來(lái)源新生大鼠1-2日齡,碘酒,灑精消毒。斷頭,取出大腦,分離腦膜,夾取兩側(cè)大腦皮質(zhì)放入接種培養(yǎng)液中,用D-Hank’s沖洗二遍。剪碎,0、5-1mm3,用D-Hank’s充分洗去殘血加入5-10倍量0、25%胰蛋白酶,移入離心管中放到水370C浴箱中消化20-25分鐘。終止消化離心洗滌2000轉(zhuǎn)/分,5分鐘棄上清。吹打制成細(xì)胞懸液。臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)后接種于事先涂好鼠尾膠得24孔板中。370C5%CO2培養(yǎng)2天后換生長(zhǎng)培養(yǎng)液大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)方法

神經(jīng)元體外生長(zhǎng)特征接種密度與體外存活率

當(dāng)96孔每孔2000-3000個(gè)或7000-10000個(gè)/cm2幾乎無(wú)神經(jīng)元存活

當(dāng)8000-12000個(gè)/96孔或2、8萬(wàn)-4萬(wàn)個(gè)/cm2

存活率最大。3天后不到接種得一半,故研究某一生長(zhǎng)因子前3天加藥最好神經(jīng)元得體外存活時(shí)間

短1-2W

長(zhǎng)4個(gè)月體外分化標(biāo)志破傷風(fēng)毒素

NSENF200,NF160神經(jīng)細(xì)胞得特殊染色鑒定方法

尼氏體染色

焦油紫

甲苯胺藍(lán)硫瑾等組化染色鍍銀染色

NADPH-d特異性神經(jīng)組織化學(xué)法神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)得應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域研究各種因素對(duì)神經(jīng)得影響1、化學(xué)物質(zhì),物理因素,生物因素,環(huán)境中化學(xué)因子,自由基,外傷、高溫等因素,病毒感染。2、藥物,細(xì)胞因子,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞得作用,各種藥物,如中藥,腦活素,神經(jīng)生長(zhǎng)因子,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF),神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、細(xì)胞間相互作用:巨噬細(xì)胞,雪旺細(xì)胞等。4、各種生理病理狀態(tài)下神經(jīng)元狀態(tài)改變實(shí)驗(yàn)方法研究手段及測(cè)量指標(biāo)1、形態(tài)學(xué)觀察:光鏡,相差顯微鏡:細(xì)胞數(shù)目,形態(tài),大體結(jié)構(gòu),突觸電鏡:超微結(jié)構(gòu)。2、激光共聚焦掃描顯微鏡(laserconfocalscanningmicroscope,LCSM):研究細(xì)胞內(nèi)成分變化,離子改變等,三維重建3、膜片鉗技術(shù),細(xì)胞表面通道和離子流動(dòng),電變化。研究手段及測(cè)量指標(biāo)4、聚丙烯酰胺凝膠電泳:細(xì)胞內(nèi)蛋白,核酸變化5、染色:蘇木素-伊紅(HE)染色及尼氏(Nissl)染色,免疫組化染色。6、顯微測(cè)量:胞體平均直徑和胞體橢圓率,突起長(zhǎng)度及胞徑。7、熒光光度分析儀:MTT法測(cè)定細(xì)胞得OD值培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞得觀察和鑒定1、