蛋白質(zhì)分子量測(cè)定方法研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)分子量測(cè)定方法研究進(jìn)展SDS凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)就是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蛋白質(zhì)研究中最常用得技術(shù),兼有電泳與分子篩得雙重作用。SDS就是一種陰離子去污劑,可使蛋白質(zhì)變性,與其蛋白質(zhì)結(jié)合成帶負(fù)電荷得蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體,消除電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)所帶電荷對(duì)電泳結(jié)果得影響,從而保證蛋白質(zhì)電泳僅受分子質(zhì)量大小得影響。在一定得電場(chǎng)作用下,該復(fù)合體沿著以聚丙烯酰胺凝膠形成得分子篩向電場(chǎng)得正極移動(dòng),從而將蛋白質(zhì)根據(jù)她們得分子量大小而分開(kāi)。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體:形狀一定、電荷密度一定SDS凝膠電泳上樣:防止樣品溢出、正負(fù)極、電壓SDS凝膠電泳當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在10-200kDa時(shí),樣品得遷移率與分子量得對(duì)數(shù)呈對(duì)數(shù)關(guān)系,符合如下方程式:

lgMW=-b﹒Rf+K其中,MW為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量,Rf為相對(duì)遷移率,b為斜率,K為截距,當(dāng)條件一定時(shí),b與K為常數(shù)。因此通過(guò)已知分子量得蛋白與未知分子量蛋白得比較,就能得出未知蛋白得分子量。影響分子量測(cè)定得因素很多,包括蛋白質(zhì)與SDS得結(jié)合量得不同,凝膠濃度與交聯(lián)劑濃度等,如圖所示。研究者測(cè)定了當(dāng)交聯(lián)劑濃度不變,改變凝膠濃度,下圖分別對(duì)應(yīng)于凝膠濃度為5%,10%,15%。SDS凝膠電泳優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單,容易掌握,成本低,分辨率高,重復(fù)效果好。缺點(diǎn):對(duì)于電荷異常或者構(gòu)象異常得蛋白、帶有較大輔基得蛋白及一些結(jié)構(gòu)蛋白測(cè)定得分子質(zhì)量不太可靠,而且電泳結(jié)束后還需要染色,染色,脫色比較耗時(shí)。SDS凝膠電泳凝膠滲透層析法定義:又叫體積排阻層析、分子篩層析,當(dāng)生物大分子通過(guò)裝有凝膠顆粒得層析柱時(shí),根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行得分離技術(shù)。固定相:惰性凝膠顆粒,顆粒內(nèi)部立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),形成許多孔穴原理:凝膠滲透層析法常用凝膠:交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠(Sepharose)凝膠滲透層析法洗脫體積Ve與分子量得關(guān)系可用下式表示:Ve=K1—K2logMW(K1、K2為常數(shù),MW為分子量)從公式可以瞧出,目標(biāo)樣品得流出體積與分子量對(duì)數(shù)成線(xiàn)性關(guān)系。在實(shí)際操作過(guò)程中,選取標(biāo)準(zhǔn)品與樣品同時(shí)通過(guò)凝膠柱,通過(guò)已知標(biāo)準(zhǔn)品得流出體積與分子量可以計(jì)算出曲線(xiàn)中得K1、K2值,再根據(jù)已知得曲線(xiàn)方程與樣品流出體積計(jì)算樣品得分子量。凝膠滲透層析法優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單,設(shè)備簡(jiǎn)單,樣品用量少,周期簡(jiǎn)單,條件溫與,一般不引起生物活性得改變。缺點(diǎn):應(yīng)用具有一定得局限性,在pH6—8得范圍內(nèi),線(xiàn)性關(guān)系比較好,但在極端pH時(shí),一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過(guò)5%時(shí),測(cè)得分子量比真實(shí)得要大,鐵蛋白則與此相反,測(cè)得得分子量比真實(shí)得要小。質(zhì)譜法

1906年,Thomson發(fā)明了質(zhì)譜技術(shù),最初只就是用于無(wú)機(jī)化學(xué)中得同位素分析,直至20世紀(jì)40年代末才發(fā)展成為有機(jī)質(zhì)譜。近年來(lái),生物質(zhì)譜技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)得發(fā)展,其中以分別由美國(guó)科學(xué)家John、B、Fenn與日本科學(xué)家田中耕一發(fā)明得電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)及基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-MS)得貢獻(xiàn)最為突出。可準(zhǔn)確測(cè)定分子量大家有疑問(wèn)的，可以詢(xún)問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)

1、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)原理:電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)就是在毛細(xì)管得出口處施加一高電壓,所產(chǎn)生得高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出得液體霧化成細(xì)小得帶電液滴,隨著溶劑蒸發(fā),液滴表面得電荷密度逐漸增大,最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷得離子,致使分析物以單電荷或多電荷離子得形式進(jìn)入氣相得質(zhì)譜技術(shù)。ESI-MS測(cè)定蛋白質(zhì)大分子就是根據(jù)一簇多電荷得質(zhì)譜峰群,通過(guò)解卷積得方式計(jì)算得到蛋白質(zhì)得分子量,由于ESI-MS可以產(chǎn)生多電荷峰,因此使得測(cè)試得分子質(zhì)量范圍大大擴(kuò)大。

1、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)電噴霧就是一種離子化方法,可以用作質(zhì)譜儀得離子源

1、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)多電荷使得樣品譜圖復(fù)雜荷質(zhì)比:

1、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)優(yōu)點(diǎn):(1)對(duì)樣品得消耗少,不會(huì)造成樣品得大量浪費(fèi);(2)對(duì)樣品分子質(zhì)量測(cè)試靈敏度、分辨力與準(zhǔn)確度都相當(dāng)高;(3)能夠方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)用,如毛細(xì)管電泳、高效液相色譜等,就是解決非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性、極性強(qiáng)得復(fù)雜組分化合物得定性定量得高靈敏度檢測(cè)方法。缺點(diǎn):對(duì)樣品純度要求高,且會(huì)形成多電荷得質(zhì)譜峰群,難以分辨,使得結(jié)果分析較為困難。

2、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-MS)原理:基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-MS)就是將待測(cè)物懸浮或溶解在一個(gè)基體中,基體與待測(cè)物形成混晶,當(dāng)基體吸收激光得能量后,均勻傳遞給待測(cè)物,使待測(cè)物瞬間氣化并離子化。將它與經(jīng)典得脈沖化工作方式得飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF)直接聯(lián)用,即我們常聽(tīng)到得基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。TOF得原理就是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道,根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器得飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子得質(zhì)荷比(M/Z)與離子得飛行時(shí)間成正比,檢測(cè)離子。

2、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-MS)優(yōu)點(diǎn):(1)同ESI-MS一樣對(duì)樣品得消耗很少;(2)MALDI-MS得最高分辨率不斷提高,甚至超過(guò)ESI-MS;

(3)有利于對(duì)復(fù)雜混合物得分析,且能忍受較高濃度得鹽、緩沖劑與其她難揮發(fā)成分,降低了對(duì)樣品預(yù)處理得要求;(4)MALDI-TOF質(zhì)譜對(duì)生物大分子分子量得測(cè)定范圍就是所有測(cè)試技術(shù)中最廣。缺點(diǎn):在與高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離設(shè)備得聯(lián)用時(shí),目前只能采取離線(xiàn)得方式,致使分析結(jié)果得重復(fù)性較差,與MALDI-MS本身高精密度得特性不匹配。其她方法除了以上幾種目前實(shí)驗(yàn)室常用得測(cè)定方法,還有一些現(xiàn)在在實(shí)驗(yàn)室一般不太使用得方法,包括粘度法,滲透壓法,輻射失活法,超速離心沉降法,光散射法等。

1、粘度法

粘度法就是指通過(guò)測(cè)定樣品溶液得粘度,從而計(jì)算樣品得得分子量得方法。一定溫度條件下,高聚物稀溶液得粘度與其分子量之間呈正相關(guān)性,隨著分子量得增大,聚合物溶液得粘度增大。通過(guò)測(cè)定高聚物稀溶液粘度隨濃度得變化,即可計(jì)算出其平均分子量(粘均分子量)。如果高聚物分子得分子量愈大,則它與溶劑間得接觸表面也愈大,摩擦就大,表現(xiàn)出得特性粘度也大。特性粘度[η]與相對(duì)分子量M之間遵循Mark-Houwink經(jīng)驗(yàn)方程:[η]=