蛋白質(zhì)分子量測定方法研究進展

蛋白質(zhì)分子量測定方法研究進展SDS凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳技術就是實驗室進行蛋白質(zhì)研究中最常用得技術,兼有電泳與分子篩得雙重作用。SDS就是一種陰離子去污劑,可使蛋白質(zhì)變性,與其蛋白質(zhì)結合成帶負電荷得蛋白質(zhì)-SDS復合體,消除電泳過程中蛋白質(zhì)所帶電荷對電泳結果得影響,從而保證蛋白質(zhì)電泳僅受分子質(zhì)量大小得影響。在一定得電場作用下,該復合體沿著以聚丙烯酰胺凝膠形成得分子篩向電場得正極移動,從而將蛋白質(zhì)根據(jù)她們得分子量大小而分開。蛋白質(zhì)-SDS復合體:形狀一定、電荷密度一定SDS凝膠電泳上樣:防止樣品溢出、正負極、電壓SDS凝膠電泳當?shù)鞍踪|(zhì)分子量在10-200kDa時,樣品得遷移率與分子量得對數(shù)呈對數(shù)關系,符合如下方程式:

lgMW=-b﹒Rf+K其中,MW為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量,Rf為相對遷移率,b為斜率,K為截距,當條件一定時,b與K為常數(shù)。因此通過已知分子量得蛋白與未知分子量蛋白得比較,就能得出未知蛋白得分子量。影響分子量測定得因素很多,包括蛋白質(zhì)與SDS得結合量得不同,凝膠濃度與交聯(lián)劑濃度等,如圖所示。研究者測定了當交聯(lián)劑濃度不變,改變凝膠濃度,下圖分別對應于凝膠濃度為5%,10%,15%。SDS凝膠電泳優(yōu)點:操作簡單,容易掌握,成本低,分辨率高,重復效果好。缺點:對于電荷異?；蛘邩嬒螽惓５玫鞍住в休^大輔基得蛋白及一些結構蛋白測定得分子質(zhì)量不太可靠,而且電泳結束后還需要染色,染色,脫色比較耗時。SDS凝膠電泳凝膠滲透層析法定義:又叫體積排阻層析、分子篩層析,當生物大分子通過裝有凝膠顆粒得層析柱時,根據(jù)它們分子大小不同而進行得分離技術。固定相:惰性凝膠顆粒,顆粒內(nèi)部立體網(wǎng)狀結構,形成許多孔穴原理:凝膠滲透層析法常用凝膠:交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠(Sepharose)凝膠滲透層析法洗脫體積Ve與分子量得關系可用下式表示:Ve=K1—K2logMW(K1、K2為常數(shù),MW為分子量)從公式可以瞧出,目標樣品得流出體積與分子量對數(shù)成線性關系。在實際操作過程中,選取標準品與樣品同時通過凝膠柱,通過已知標準品得流出體積與分子量可以計算出曲線中得K1、K2值,再根據(jù)已知得曲線方程與樣品流出體積計算樣品得分子量。凝膠滲透層析法優(yōu)點:操作簡單,設備簡單,樣品用量少,周期簡單,條件溫與,一般不引起生物活性得改變。缺點:應用具有一定得局限性,在pH6—8得范圍內(nèi),線性關系比較好,但在極端pH時,一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過5%時,測得分子量比真實得要大,鐵蛋白則與此相反,測得得分子量比真實得要小。質(zhì)譜法

1906年,Thomson發(fā)明了質(zhì)譜技術,最初只就是用于無機化學中得同位素分析,直至20世紀40年代末才發(fā)展成為有機質(zhì)譜。近年來,生物質(zhì)譜技術取得了突飛猛進得發(fā)展,其中以分別由美國科學家John、B、Fenn與日本科學家田中耕一發(fā)明得電噴霧離子化質(zhì)譜技術(ESI-MS)及基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(MALDI-MS)得貢獻最為突出?？蓽蚀_測定分子量大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點

1、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(ESI-MS)原理:電噴霧離子化質(zhì)譜技術(ESI-MS)就是在毛細管得出口處施加一高電壓,所產(chǎn)生得高電場使從毛細管流出得液體霧化成細小得帶電液滴,隨著溶劑蒸發(fā),液滴表面得電荷密度逐漸增大,最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷得離子,致使分析物以單電荷或多電荷離子得形式進入氣相得質(zhì)譜技術。ESI-MS測定蛋白質(zhì)大分子就是根據(jù)一簇多電荷得質(zhì)譜峰群,通過解卷積得方式計算得到蛋白質(zhì)得分子量,由于ESI-MS可以產(chǎn)生多電荷峰,因此使得測試得分子質(zhì)量范圍大大擴大。

1、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(ESI-MS)電噴霧就是一種離子化方法,可以用作質(zhì)譜儀得離子源

1、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(ESI-MS)多電荷使得樣品譜圖復雜荷質(zhì)比:

1、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(ESI-MS)優(yōu)點:(1)對樣品得消耗少,不會造成樣品得大量浪費;(2)對樣品分子質(zhì)量測試靈敏度、分辨力與準確度都相當高;(3)能夠方便地與多種分離技術聯(lián)用,如毛細管電泳、高效液相色譜等,就是解決非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性、極性強得復雜組分化合物得定性定量得高靈敏度檢測方法。缺點:對樣品純度要求高,且會形成多電荷得質(zhì)譜峰群,難以分辨,使得結果分析較為困難。

2、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(MALDI-MS)原理:基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(MALDI-MS)就是將待測物懸浮或溶解在一個基體中,基體與待測物形成混晶,當基體吸收激光得能量后,均勻傳遞給待測物,使待測物瞬間氣化并離子化。將它與經(jīng)典得脈沖化工作方式得飛行時間質(zhì)譜儀(TOF)直接聯(lián)用,即我們常聽到得基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。TOF得原理就是離子在電場作用下加速飛過飛行管道,根據(jù)到達檢測器得飛行時間不同而被檢測即測定離子得質(zhì)荷比(M/Z)與離子得飛行時間成正比,檢測離子。

2、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(MALDI-MS)優(yōu)點:(1)同ESI-MS一樣對樣品得消耗很少;(2)MALDI-MS得最高分辨率不斷提高,甚至超過ESI-MS;

(3)有利于對復雜混合物得分析,且能忍受較高濃度得鹽、緩沖劑與其她難揮發(fā)成分,降低了對樣品預處理得要求;(4)MALDI-TOF質(zhì)譜對生物大分子分子量得測定范圍就是所有測試技術中最廣。缺點:在與高效液相色譜、毛細管電泳等分離設備得聯(lián)用時,目前只能采取離線得方式,致使分析結果得重復性較差,與MALDI-MS本身高精密度得特性不匹配。其她方法除了以上幾種目前實驗室常用得測定方法,還有一些現(xiàn)在在實驗室一般不太使用得方法,包括粘度法,滲透壓法,輻射失活法,超速離心沉降法,光散射法等。

1、粘度法

粘度法就是指通過測定樣品溶液得粘度,從而計算樣品得得分子量得方法。一定溫度條件下,高聚物稀溶液得粘度與其分子量之間呈正相關性,隨著分子量得增大,聚合物溶液得粘度增大。通過測定高聚物稀溶液粘度隨濃度得變化,即可計算出其平均分子量(粘均分子量)。如果高聚物分子得分子量愈大,則它與溶劑間得接觸表面也愈大,摩擦就大,表現(xiàn)出得特性粘度也大。特性粘度[η]與相對分子量M之間遵循Mark-Houwink經(jīng)驗方程:[η]=