單克隆抗體的制備和應(yīng)用

單克隆抗體的制備和應(yīng)用20世紀(jì)有關(guān)抗體得生理學(xué)和醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)項(xiàng)獲獎(jiǎng)年代學(xué)者獲獎(jiǎng)成就1901E、A、Behring發(fā)現(xiàn)抗毒素,開(kāi)創(chuàng)免疫血清療法1908P、Ehrlich抗體生成得側(cè)鏈學(xué)說(shuō)E、Metchnikoff細(xì)胞吞噬作用1913C、Richet發(fā)現(xiàn)過(guò)敏現(xiàn)象1960F、M、Burnet抗體生成得克隆選擇學(xué)說(shuō)P、B、Medawar1972G、M、Edelman抗體得化學(xué)結(jié)構(gòu)R、M、Porter1977R、S、Yalow創(chuàng)立放射免疫測(cè)定法1984G、K?hlerB細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體C、MilsteinN、Jerne免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)1987Tonegawa抗體多樣性得遺傳學(xué)基礎(chǔ)NielsK、JerneGeorgesJ、F、K?hlerCésarMilsteinB淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)就是如何創(chuàng)立得應(yīng)用SRBC為免疫原免疫小鼠為模型,觀察抗體產(chǎn)生細(xì)胞得體細(xì)胞突變(Somaticmutation)Hybridomas:Themakingofarevolution.Science1982Vol205pp1073-1075Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodiesofpredefinedspecificity.Nature1975,256:495導(dǎo)致了在生命科學(xué)領(lǐng)域中得一場(chǎng)革命克隆(Clone)又名無(wú)性繁殖系,指由一個(gè)祖

先細(xì)胞經(jīng)分化、增殖所產(chǎn)生得遺傳性狀完全相

同得細(xì)胞群

多克隆抗體(Polyclonalantibody,pAb)

用包含多種抗原決定基得抗原物質(zhì)免疫動(dòng)

物,從而刺激多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗

原表位得不同抗體得總和,稱為多克隆抗體單克隆抗體(MonoclonalAntibody,mAb)

由一個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆所產(chǎn)生得,針對(duì)單一抗原決定簇得抗體,稱為單克隆抗體單克隆抗體得優(yōu)點(diǎn)單特異性和均一性無(wú)限供應(yīng)用混合得抗原制備出識(shí)別一個(gè)抗原決定簇得抗體McAbPcAb雜交細(xì)胞(hybridcell)

在外界某些條件干預(yù)下(如PEG、電穿孔),當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞緊密地接觸得時(shí)候,其細(xì)胞膜可能發(fā)生融合,產(chǎn)生具有原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞染色體/基因得單個(gè)細(xì)胞,稱為雜交細(xì)胞

雜交瘤細(xì)胞(Hybridomas)若用一種腫瘤細(xì)胞與另一種體細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)融合,所形成得雜交細(xì)胞稱為雜交瘤細(xì)胞,簡(jiǎn)稱雜交瘤。其既具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖得能力,也具有淋巴細(xì)胞得一些特性

B淋巴細(xì)胞雜交瘤骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融合所產(chǎn)生得雜交瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)得基本原理B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞抗原制備免疫動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞得制備細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞得選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞得篩選及克隆化單克隆抗體得鑒定單克隆抗體得制備單克隆抗體制備得主要步驟一、抗原細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等,一般具有較強(qiáng)得免疫原性,可不加佐劑。例如,直接腹腔注射1~2×107個(gè)細(xì)胞。顆粒性抗原:可溶性抗原得來(lái)源主要就是天然純化,或者用目得基因在原核或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？扇苄钥乖枧c弗氏完全或不完全佐劑混勻,進(jìn)行免疫。可溶性抗原:大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)B淋巴細(xì)胞在目得抗原刺激下增殖、分化,形成能分泌特異性抗體得B淋巴細(xì)胞,有利于細(xì)胞融合形成分泌特異性抗體得雜交瘤細(xì)胞。多次免疫可通過(guò)抗體親和力成熟機(jī)制,使B細(xì)胞分泌高親和力抗體,由此形成得雜交瘤往往可分泌高親和力抗體,有更高得應(yīng)用價(jià)值。

二、免疫動(dòng)物免疫目得:采用與骨髓瘤供體同一品系得動(dòng)物

免疫動(dòng)物品系(脾細(xì)胞供體)和骨髓瘤細(xì)胞

在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)則產(chǎn)生得雜交瘤越不穩(wěn)定,獲得得雜交瘤不能在該品系小鼠體內(nèi)誘生腹水。動(dòng)物得選擇:動(dòng)物對(duì)抗原刺激易產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)8~12周齡雌性小鼠(最常用BALB/c)第一次免疫:可溶性抗原加弗氏完全佐劑第二次免疫:可溶性抗原加弗氏不完全佐劑第三次免疫:可溶性抗原加生理鹽水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后檢測(cè)血清效價(jià)加強(qiáng)免疫:可溶性抗原加生理鹽水小鼠腹腔注射細(xì)胞融合3天后免疫程序:

脾（spleen）抗原脾（spleen）所選擇得骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)與提供免疫脾細(xì)胞得動(dòng)物

品系相同三、骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞得制備骨髓瘤細(xì)胞系得選擇要點(diǎn):自身不產(chǎn)生免疫球蛋白得重鏈與輕鏈對(duì)氨基碟呤敏感與免疫脾細(xì)胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌Ig雜交瘤細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞得作用:小鼠腹腔巨噬細(xì)胞小鼠脾細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercell):增加細(xì)胞密度,滿足新生得雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度得要求吞噬清除死亡得細(xì)胞分泌生長(zhǎng)刺激因子促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞得生長(zhǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞得種類和制備方法:四、細(xì)胞融合融合前得準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備HAT、HT培養(yǎng)液、融合劑PEG準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備免疫脾細(xì)胞拉頸處死小鼠無(wú)菌操作取出脾臟清洗、研磨收集細(xì)胞離心洗滌細(xì)胞計(jì)數(shù)脾細(xì)胞得準(zhǔn)備收集細(xì)胞離心洗滌活細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度骨髓瘤細(xì)胞得準(zhǔn)備細(xì)胞融合

骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按一定比例混合1:10或1:5加入促融劑PEGPEG在聚乙二醇作用下B淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合,形成雜交瘤細(xì)胞五、雜交瘤細(xì)胞得選擇性培養(yǎng)HAT選擇性培養(yǎng)得原理:細(xì)胞得DNA生物合成有主要途徑和補(bǔ)償途徑。當(dāng)有氨基碟呤存在時(shí),能夠阻斷DNA合成得主要途徑,需通過(guò)補(bǔ)償途徑合成DNA,這時(shí)就需要次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)利用次黃嘌呤合成DNA,或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。用于雜交瘤融合得骨髓細(xì)胞缺乏HGPRT和TK,在HAT培養(yǎng)液中,未融合得骨髓瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT和TK,不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。未融合得B淋巴細(xì)胞雖具有HGPRT和TK,但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡。只有骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融合得雜交瘤既有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限增殖得能力,又從免疫B細(xì)胞得到HGPRT和TK得基因產(chǎn)物,因此,能夠克服氨基碟呤得阻斷作用,通過(guò)次黃嘌呤得補(bǔ)償途徑合成DNA,而在HAT選擇培養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖。融合后3~4天后,可見(jiàn)外形似骨髓瘤細(xì)胞,渾圓透亮得克隆。融合后第7~9天取培養(yǎng)上清,檢測(cè)特異性抗體。細(xì)胞生長(zhǎng)情況

六、雜交瘤細(xì)胞得篩選及克隆化雜交瘤分泌單克隆抗體得檢測(cè)方法免疫酶技術(shù)——間接ELISA

包被抗原、培養(yǎng)上清、酶標(biāo)抗體、加底物顯色

陰性對(duì)照:骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清

陽(yáng)性對(duì)照:免疫鼠血清

免疫熒光技術(shù)間接免疫熒光(或酶)測(cè)定法:靶細(xì)胞鋪片、固定細(xì)胞、加待測(cè)樣品、加熒光標(biāo)記抗體(或加酶標(biāo)抗體和顯色底物)、鏡檢活細(xì)胞免疫熒光技術(shù):流式細(xì)胞術(shù)分析雜交瘤細(xì)胞得克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)得雜交瘤細(xì)胞,只有少數(shù)就是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體得細(xì)胞,因此,必須進(jìn)行篩選和克隆化。克隆化—即把培養(yǎng)孔中得細(xì)胞從單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)繁殖,使之成為單克隆,其分泌得抗體達(dá)到均一性。有限稀釋法軟瓊脂培養(yǎng)法以適當(dāng)濃度雜交瘤細(xì)胞加入軟瓊脂培養(yǎng)基中,形成由一個(gè)細(xì)胞增殖而成得細(xì)胞集落。雜交瘤細(xì)胞得克隆化篩選:免疫球蛋白類別及亞類得鑒定

七、單克隆抗體得鑒定小鼠免疫脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合形成得雜交瘤細(xì)胞,其分泌得特異性McAb得本質(zhì)仍就是小鼠得不同類型及其亞類得免疫球蛋白(Ig),其中以IgG(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3等亞類)最常見(jiàn),其次為IgM。抗體親和力就是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合得強(qiáng)度,其高低主要就是由抗體分子結(jié)合表位部位和抗原決定簇之間得互補(bǔ)程度決定。特異性就是否與其她抗原有交叉反應(yīng)敏感性對(duì)腹水和培養(yǎng)上清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定親和力測(cè)定八、單克隆抗體得制備

動(dòng)物體內(nèi)誘生法

取Balb/c小鼠,首先腹腔注射0、5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1~2周后,腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖,并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體約1~2周,可見(jiàn)小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可獲得大量單克隆抗體。

將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶(或灌)中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中,雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體。收集培養(yǎng)上清液,離心去除細(xì)胞及其碎片,即可獲得所需要得單克隆抗體,不含無(wú)關(guān)Ig,但成本髙。體外培養(yǎng)法我國(guó)單克隆抗體得發(fā)展歷史和前景早期研究階段全軍單克隆抗體研究協(xié)作組(單克隆抗體通迅)應(yīng)用和市場(chǎng)化HLDA

HCDM功能基因組研究中得重要地位國(guó)家重大科技項(xiàng)目(973、863等)主要研究?jī)?nèi)容之一單克隆抗體得應(yīng)用基礎(chǔ)理論研究(生命科學(xué))發(fā)病機(jī)理得研究疾病得預(yù)防(緊急預(yù)防)疾病得診斷(傳染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、免疫缺陷病)疾病得治療(治療性抗體)

——

一項(xiàng)重要得生物技術(shù)和一類生物高科技產(chǎn)品單克隆抗體在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中得廣泛應(yīng)用從醫(yī)學(xué)到生命科學(xué)得各個(gè)領(lǐng)域從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用從診斷到預(yù)防和治療MHC細(xì)胞表面分子血型腫瘤相關(guān)抗原和分子抗Ig得同種異型激素、細(xì)胞因子和血漿成分純化干擾素病原生物傳染性疾病

HIV:急性感染期和晚期:核心抗原p24升高;檢測(cè)抗HIV抗體初篩;免疫印跡進(jìn)一步確認(rèn);CD4+T細(xì)胞<200/l病情嚴(yán)重

HAV、HBV、HCV:抗體

HFRS:免疫熒光,ELISA(特異性IgM)

腫瘤多種腫瘤得標(biāo)志物直腸結(jié)腸癌:CEA前列腺癌:PSA原發(fā)性肝癌:AFP淋巴瘤和白血病:CD分子自身免疫性和過(guò)敏性疾病自身抗體(抗核抗體、類風(fēng)濕因子)放射免疫測(cè)定法(RIA)檢測(cè)特異性IgE

甲狀腺素、胰島素、生長(zhǎng)激素其她血型檢測(cè):凝集反應(yīng)(直接和間接)早孕:人絨毛膜促性腺激素(hCG)男性不育:抗精子抗體單克隆抗體在臨床診斷中應(yīng)用FabmurineantibodychimericmouseantibodyFvdAbengineeredbispecificAbScFvHumanizedF(ab

)2HumanizedantibodyScFv-toxinintrabodyNumberoftherapeuticmAbsenteringclinicalstudyperyearTherapeuticcategoriesformAbsinclinicalstudy通用名批準(zhǔn)時(shí)間類型識(shí)別抗原適應(yīng)癥Muromonab-CD31986mouseCD3急性腎移植移植排斥Daclizumab;Basiliximab1997;1998humanized/chimericIL-2R(CD25)急性腎移植移植排斥Rituximab;Tositumomab;Ibritumomab1997;2002;2003mouse/chimericCD20B細(xì)胞-非何杰金氏淋巴瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Alemtuzumab2001humanizedCD52慢性B淋巴細(xì)胞性白血病Gemtuzumabozogamicin2000chimericCD33急性粒細(xì)胞性白血病Edrecolomab*1995mouseEP-CAM結(jié)、直腸癌Trastuzumab1998humanizedHER-2HER-2過(guò)表達(dá)得轉(zhuǎn)移性乳腺癌Cetuximab2004humanizedEGFR轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、頭頸部癌癥Bevacizumab2004;2006humanizedVEGF轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌,年齡相關(guān)性黃斑病變Infliximab1998;2002chimeric/humanTNF-α節(jié)段性回腸炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,銀屑病性關(guān)節(jié)炎;強(qiáng)直性脊柱炎Efalizumab2003humanizedCD11a銀屑病Natalizumab2004humanα4整合素多發(fā)性硬化癥Omalizumab2003humanizedIgE過(guò)敏性哮喘Abciximab1994chimericGPⅡb/Ⅲa冠心病血小板Palivizumab1998humanizedRSV呼吸道合胞病毒感染CharacteriztionofmAbsagainstEpCAMbyIHC

andIF腫瘤器官移植排斥自身免疫性疾病其她CD20,CD52,CD33,HER-2EGFR,VEGF,EP-CAMCD3,IL-2R(CD25)TNF-α,CD11a,α4整合素,CD20

GPⅡb/Ⅲa,IgE,RSVgpFMechanismsofmAb-mediatedkilling

CD20表達(dá)于B淋巴細(xì)胞,其抗體可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)化療得敏感性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、ADCC、CDCCD33表達(dá)于90%以上得急性髓樣白血病(AML)細(xì)胞,但不表達(dá)于骨髓CD34+造血干細(xì)胞,其抗體可誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂和細(xì)胞死亡CD52可誘導(dǎo)ADCC和CDC,治療慢性B淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞白血病和T細(xì)胞淋巴瘤白血病及淋巴瘤抗HER2/CD340ADCC,抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管形成

抗EGFR阻斷EGFR與EGF結(jié)合,誘導(dǎo)ADCC,抑制細(xì)胞增殖,抑制腫瘤血管形成,誘導(dǎo)凋亡

抗VEGF阻斷VEGF與VEGF受體結(jié)合,抑制腫瘤得血管生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移部位得發(fā)展實(shí)質(zhì)性腫瘤抗CD3補(bǔ)體依賴得細(xì)胞毒作用(CDC),清除T細(xì)胞,阻斷T細(xì)胞功能

抗CD25補(bǔ)體依賴得細(xì)胞毒作用(CDC),阻斷IL-2受體預(yù)防腎移植急性排斥反應(yīng)抗TNF

阻斷TNF-

與受體結(jié)合,降低或消除由TNF-

刺激細(xì)胞所發(fā)生得炎癥反應(yīng)

抗CD11a抑制LFA-1與配體結(jié)合,抑制白細(xì)胞黏附,治療斑狀牛皮癬

抗4整合素抑制VLA-4與配體結(jié)合,抑制白細(xì)胞黏附

CD20治療RA自身免疫性疾病抗IgE阻斷IgE與IgE受體結(jié)合,抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性