生物化學(xué)-第二章-蛋白質(zhì)化學(xué)-蛋白質(zhì)化學(xué)

第六節(jié)：蛋白質(zhì)的性質(zhì)10/17/20241一、蛋白質(zhì)性質(zhì)：

膠體性質(zhì)(p299)

兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)

(p291)

蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性、沉淀和凝固

(p233,300)

蛋白質(zhì)的紫外吸收

蛋白質(zhì)的分子量

(p291)

蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)

二、蛋白質(zhì)含量測(cè)定法(p315)10/17/20242蛋白質(zhì)分子量大，它在水溶液中所形成的顆粒直徑約為1－100nm。膠體溶液具有布朗運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象、不能透過(guò)半透膜以及具有吸附能力等。

利用蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜的性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，這是提純蛋白質(zhì)的一種常用方法。(一)膠體性質(zhì)10/17/20243在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體的因素極性不電離基團(tuán)：形成水化層極性電離基團(tuán)：形成雙電子層原因10/17/20244

(二)兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)PrCOO-NH3+pH=pI凈電荷=0Isoelectricpoint(pI)定義：

在某一pH值溶液中，Pr酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的解離程度相當(dāng),Pr分子所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為零,在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值稱(chēng)為該蛋白質(zhì)的pI。pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOO-NH2OH-H+pH<pI凈電荷為正PrCOOHNH3+OH-H+10/17/20245

蛋白質(zhì)和氨基酸一樣，是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)分子中，可解離基團(tuán)除了肽鏈末端的α-氨基和α-羧基外，主要的還是肽鏈上氨基酸殘基的一些側(cè)鏈基團(tuán)，如：

ε－NH2、γ－COOH、β-COOH、咪唑基、胍基、－OH等。10/17/2024610/17/20247

pH=pI時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不移動(dòng)

pH＞pI時(shí)，凈電荷為負(fù)，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)

pH＜pI時(shí)，凈電荷為正，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)

在pI時(shí)，蛋白質(zhì)失去了膠體的穩(wěn)定條件，即沒(méi)有相同電荷相互排斥的作用。所以不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀.

10/17/20248（三）蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性、沉淀和凝固2.復(fù)性1.變性3.沉淀和凝固定義變性因素變性實(shí)質(zhì)變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)

變性的分類(lèi)定義沉淀類(lèi)型10/17/20249吳憲教授1931年：“天然Pr分子借助次級(jí)鍵連接而成一種緊密，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)，變性作用使次級(jí)鍵破壞從而使結(jié)構(gòu)松散”。1.蛋白質(zhì)的變性(denaturation)(1)定義：在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)（不包括肽鍵）被破壞，從而引起若干理化性質(zhì)改變和生物學(xué)功能喪失的現(xiàn)象。10/17/202410變性因素物理因素高溫、高壓紫外線(xiàn)、X射線(xiàn)、電離輻射和超聲波等化學(xué)因素有機(jī)酸、生物堿有機(jī)溶劑、重金屬鹽高濃度尿素、鹽酸胍等10/17/202411變性實(shí)質(zhì)：破壞了空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響（分子組成、MW不變）。10/17/202412變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)①生物學(xué)活性喪失②理化性質(zhì)改變③易被蛋白酶水解

空間結(jié)構(gòu)改變旋光性、光吸收改變等溶解度↓，沉降率↑粘度↑擴(kuò)散速度↓10/17/202413變性分類(lèi)可逆變性:

Pr變性后如將變性劑除去，該P(yáng)r分子的天然構(gòu)象和生物學(xué)活性還能恢復(fù)，這一過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性（renaturation）不可逆變性：若變性條件強(qiáng)烈，作用時(shí)間長(zhǎng)，構(gòu)像變化大，理化性質(zhì)難以恢復(fù)。舉例：醫(yī)療；生物制品保存；生活等。應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……10/17/202414HOCH2CH2SH

ONH2-C-NH2=

NH2+

NH2-C-NH2=UreaGuanidineHClMercaptoethanolCl-SDSSO4-

-(CH2)11CH3常見(jiàn)的蛋白質(zhì)變性劑JuangRH(2004)BCbasics10/17/202415極性頭部非極性尾巴SDS是一種表面活性劑sodiumdodecylsulfateStryer(1995)Biochemistry(4e)p.27510/17/202416SDS在蛋白質(zhì)表面均勻鋪上一層負(fù)電荷SDSboiling變性蛋白質(zhì)成一線(xiàn)狀分子自然狀態(tài)蛋白質(zhì)並且均勻帶上一層負(fù)電荷JuangRH(2004)BCbasics10/17/20241710/17/202418核糖核酸酶變性與復(fù)性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis變性復(fù)性10/17/202419去除變性因素后，變性蛋白恢復(fù)原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)，恢復(fù)生物活性的現(xiàn)象。本質(zhì)—一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)2.復(fù)性（renaturation）10/17/202420變性蛋白質(zhì)為什么能復(fù)性？

在一定的環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)能夠決定二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。變性蛋白質(zhì)的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)雖然遭到破壞，但是一級(jí)結(jié)構(gòu)仍然保持不變，因此除去變性劑后，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，蛋白質(zhì)能卷曲折疊成為能量最低的構(gòu)象，一般天然蛋白質(zhì)正是具有這種能量最低的構(gòu)象。10/17/202421加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱(chēng)為凝固（coagulation）。因此，凝固的蛋白質(zhì)一定發(fā)生變性。

What’scoagulationofprotein?10/17/202422

凝固：變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團(tuán)的暴露而易于沉淀(但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì))，加熱等因素使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀?？偨Y(jié)：Pr變性、沉淀與凝固之間的關(guān)系變性Pr不一定沉淀沉淀Pr不一定變性變性Pr不一定凝固凝固的Pr一定變性3.沉淀與凝固沉淀：蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱(chēng)沉淀。10/17/202423

沉淀類(lèi)型

①

PI法

②鹽析法

③

有機(jī)溶劑沉淀法④重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)⑤生物堿、有機(jī)酸試劑沉淀蛋白質(zhì)⑥加熱變性沉淀法⑦抗體對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀：10/17/202424機(jī)理：奪取蛋白質(zhì)顆粒上的水化膜，降低溶液的介電常數(shù)10/17/202425++++++++--------++++++++--------蛋白質(zhì)膠體顆粒的等電點(diǎn)沉淀

帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)酸酸堿堿脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒（沉淀）帶正電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）堿酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）10/17/202426不可逆沉淀

在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱(chēng)為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀10/17/202427可逆沉淀在溫和條件下，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱(chēng)為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。10/17/202428定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:破壞Pr兩個(gè)穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。半飽和硫酸銨沉淀球Pr

飽和硫酸銨沉淀清Pr優(yōu)點(diǎn)：Pr不變性，常用。鹽析法（Saltingout)(p305)叫分段鹽析法10/17/202429蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多H2O，鹽濃度高時(shí)，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合，沉淀。鹽析（（NH4）2SO4）10/17/202430分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶10/17/202431

大部分蛋白質(zhì)均含有帶共軛雙鍵的Tyr、Phe和Trp。這三種AA在280nm

附近有特征性吸收峰。在此波長(zhǎng)范圍，蛋白質(zhì)的A280與其濃度成正比。利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。此外，蛋白質(zhì)的肽鍵在215nm、225nm亦有紫外吸收，可以用于蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定(四）蛋白質(zhì)的紫外吸收10/17/202432（五）蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量蛋白質(zhì)相對(duì)分子量在10000~1000000d之間。測(cè)定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過(guò)濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。10/17/202433測(cè)定蛋白質(zhì)分子相對(duì)質(zhì)量的方法1.根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量2.滲透壓法：

3.沉降法：超速離心4.凝膠過(guò)濾法：5.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：10/17/2024341.根據(jù)分子組成測(cè)定最小分子量

測(cè)定某一微量元素或某一氨基酸的含量如鐵原子或色氨酸，并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只有一個(gè)鐵原子或一個(gè)色氨酸，即最低相對(duì)分子質(zhì)量=鐵的原子量/鐵的百分含量牛血清白蛋白含Trp0.58%

最低M=35200d，實(shí)際為69000d，含2個(gè)Trp×100=16700=最小M＝Fe分子量

Fe(%)55.80.335(實(shí)為16900馬心)如肌紅蛋白含0.335%的鐵10/17/2024352.據(jù)pr的滲透壓測(cè)蛋白質(zhì)分子量

10/17/202436用一半透膜將pr溶液與純水隔開(kāi)，當(dāng)滲透壓達(dá)平衡時(shí)，測(cè)定其滲透壓，計(jì)算分子量：C：濃度（克/升）R：氣體常數(shù)（0.082升/大氣壓/克分子/K開(kāi)氏溫度）T：絕對(duì)溫度（開(kāi)氏溫度）

：以大氣壓表示的滲透壓ccTRMrp0lim?=10/17/202437

優(yōu)點(diǎn)：滲透壓法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確(10000-100000d)、且不受蛋白質(zhì)分子的形狀和水化程度影響不足：但受pH的影響，不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否均一

.10/17/202438

3、葡聚糖凝膠過(guò)濾法分析蛋白質(zhì)分子量p297

10/17/202439

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知Mr和斯托克半徑）和待測(cè)蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球體），分子形狀為線(xiàn)型或與凝膠發(fā)生吸附的蛋白質(zhì)不可用此法測(cè)定。10/17/2024404.SDS—PAGE（十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳）10/17/202441

加入SDS和少量巰基乙醇，則電泳遷移率主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量，而與電荷和分子形狀無(wú)關(guān)。★影響遷移率的主要因素凝膠的分子篩效應(yīng)對(duì)長(zhǎng)短不同的棒形分子會(huì)產(chǎn)生不同的阻力〔主要因素〕凝膠的濃度和交聯(lián)度同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動(dòng)快，遷移率大。相對(duì)分子質(zhì)量大者，遷移率小★優(yōu)點(diǎn)：快速，樣品用量少，可同時(shí)測(cè)幾個(gè)樣品

缺點(diǎn)：誤差大，約為±10％（誤差主要來(lái)源于遷移距離的測(cè)量誤差）★此方法只能測(cè)得亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量10/17/202442（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤(pán)電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。+—-+10/17/202443等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－10/17/202444沉降系數(shù)（s）：?jiǎn)挝唬╟m）離心場(chǎng)里的沉降速度。

s

=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s）

x=蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）超離心法是最準(zhǔn)確可靠的確定蛋白質(zhì)分子量方法。（Svedberg于1940年設(shè)計(jì)）：蛋白質(zhì)顆粒在25~50×104g離心力作用下從溶液中沉降下來(lái)。3.超離心法10/17/202445蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關(guān)系M=——————RTsD（1－Vρ）R——?dú)怏w常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對(duì)溫度D——擴(kuò)散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機(jī)轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計(jì)）V——蛋白質(zhì)的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系數(shù)10/17/202446

反應(yīng)試劑顏色反應(yīng)基團(tuán)有此反應(yīng)的Pr及AA雙縮脲反應(yīng)

NaOH,稀CuSO4

紫或粉

2個(gè)以上肽鍵所有蛋白質(zhì)Millon反應(yīng)

Millon,硝酸，亞硝酸

紅色酚基Tyr黃色反應(yīng)

HNO3及NH3

黃、橘黃

苯基Phe,Tyr乙醛酸反應(yīng)乙醛酸H2SO4

紫紅吲哚Trp坂口反應(yīng)

次氯酸鈉,萘酚紅色

胍基

ArgFolin酚試劑反應(yīng)

CuSO4磷鎢酸-鉬酸

藍(lán)色

酚基Tyr茚三酮反應(yīng)

茚三酮

紫藍(lán)色

游離氨、羧基Pro和羥Pro呈黃色（六）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)10/17/202447二、Pr含量測(cè)定法

1.微量凱氏定氮法：2.雙縮脲法：3.福林-酚(Lowry)法

改良的Lowry法4.考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法)5.紫外吸收法6.BCA法7.膠體金法10/17/202448

蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與銅離子形成紫紅色絡(luò)合物，可在540nm比色測(cè)定，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及氨基酸組成無(wú)關(guān)。

快速，但不很準(zhǔn)確該法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度范圍是

1～10mg/ml(g/L)雙縮脲法10/17/202449Lowry法

此法是對(duì)雙縮脲法的發(fā)展，首先在堿性溶液中形成銅與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，然后這種復(fù)合物及Tyr和Trp殘基還原磷鉬酸及磷鎢酸試劑(福林-酚試劑)，產(chǎn)生深藍(lán)色。

測(cè)定蛋白質(zhì)的含量范圍：

500nm0.05～0.5mg/ml750nm0.03～0.3mg/ml10/17/202450改良Lowry法：

在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，將其與雙縮脲法結(jié)合起來(lái)，形成兩種顏色的混合物，在650nm具有特定的吸收。靈敏度較高25

g-250g/ml.

曾經(jīng)的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法10/17/202451

考馬斯亮藍(lán)G250是一種帶有負(fù)電荷的染料，在酸性條件下可與蛋白質(zhì)上的正電荷結(jié)合，形成藍(lán)色化物，在595nm具有特定吸收

本法反應(yīng)快，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重復(fù)性好，消耗樣品少，但不同蛋白質(zhì)之間的差異較大，