TGXAS-十足目虹彩病毒1檢測 熒光定量PCR法編制說明

團體標(biāo)準(zhǔn)《十足目虹彩病毒1檢測熒光定量PCR法》（征求意見稿）編制說明一、任務(wù)來源和起草單位根據(jù)《廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會關(guān)于下達2021年第三十八批團體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)〔2021〕99號）文件精神，由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院提出申報的團體標(biāo)準(zhǔn)《十足目虹彩病毒1檢測熒光定量PCR法》（項目編號2021-3801）已獲立項。該團體標(biāo)準(zhǔn)由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院提出、由廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣站和廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院共同起草。二、標(biāo)準(zhǔn)制定的目的和意義2019年3月，國際病毒分類委員會（ICTV）根據(jù)虹彩病毒工作組已報道的研究結(jié)果，在虹彩病毒科中添加額外的一個屬，將其命名為十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)；蝦血細(xì)胞虹彩病毒（shrimpiridescentvirus，SHIV）和紅螯螯蝦虹彩病毒（Cheraxquadricarinatusiridovirus，CQIV）被確認(rèn)為同一個種的兩個病毒株，該病毒種被正式命名為十足目虹彩病毒1(Decapodiridescentvirus1，DIV1)，即DIV1是十足目虹彩病毒屬發(fā)現(xiàn)的第一個種。DIV1是近年新發(fā)現(xiàn)并鑒定的一種新型虹彩病毒，可感染凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、紅螯螯蝦、中國對蝦等多種經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類并可引起大規(guī)模死亡，也可感染浮游生物、河蝦、鯽、螺螄以及河蟹等常見水生生物成為傳染源傳播病毒。DIV1具多種易感宿主的特性使其更易于傳播流行，已引起我國多個地區(qū)的養(yǎng)殖蝦類暴發(fā)疫病大批死亡。鑒于DIV1引起的蝦虹彩病毒?。―IV1D）的嚴(yán)重危害性，我國從2017年起已將DIV1D納入《國家水生動物疫病監(jiān)測計劃》，近幾年監(jiān)測結(jié)果顯示，我國沿海多省市的監(jiān)測樣品檢出陽性，檢出品種包括凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、中國對蝦、紅螯螯蝦和克氏原螯蝦等我國主要養(yǎng)殖蝦品種，表明DIV1已成為中國蝦類養(yǎng)殖業(yè)面臨的新威脅。因此，建立一種快速且準(zhǔn)確的DIV1定量檢測方法，應(yīng)用于蝦苗檢疫、親蝦篩選及成蝦養(yǎng)殖疫情監(jiān)測，為DIV1更敏感、高效檢測提供技術(shù)參考標(biāo)準(zhǔn)。目前國際動物衛(wèi)生組織(OIE)和國內(nèi)均沒有TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測十足目虹彩病毒的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物，利用儀器通過熒光強度的檢測對PCR擴增產(chǎn)物進行定量，其檢測和分析過程在密閉的單管里由機器自動完成，可克服目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在DIV1D監(jiān)測計劃中推薦采用的套式PCR法操作繁瑣、檢測時間長、不可定量等缺點，并以其速度快、靈敏度高、特異性強、自動化程度高、能定量檢測病原體感染的強弱等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于病原體檢測，被認(rèn)為是實驗室檢測病原體最理想的方法；而TaqMan-MGB探針則是熒光定量PCR使用的一種熒光探針，其3′端的淬滅基團為不發(fā)光的MGB(MinorGrooveBinder)結(jié)合物，可實現(xiàn)高Tm值的探針長度縮短易于與模板退火而利于提高方法的靈敏度，且探針3′端不發(fā)光的淬滅基團與5′端報告基團在空間的位置更接近，使熒光本底降低、實驗結(jié)果分辨率更高，因此TaqMan-MGB探針憑借其技術(shù)優(yōu)勢在人及動植物各種病原體的定量檢測中得到了廣泛應(yīng)用。TaqMan-MGB探針熒光定量PCR不僅能發(fā)揮熒光定量PCR的優(yōu)勢而克服套式PCR的缺點，其探針的MGB基團相對于TaqMan探針還有利于提高方法的靈敏度，非常適用于對靈敏度要求高的病原體定量檢測。鑒于此，非常有必要將熒光定量PCR納入DIV1的檢測標(biāo)準(zhǔn)中，對有效防控DIV1引起的病毒病具有重要意義。三、標(biāo)準(zhǔn)的編制過程1、成立編制工作小組。團體標(biāo)準(zhǔn)《十足目虹彩病毒1檢測熒光定量PCR法》項目任務(wù)下達后，廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院會同廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣站成立了此標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，制訂了編制總體工作方案及進度安排，確定了標(biāo)準(zhǔn)中主要內(nèi)容草案，明確了任務(wù)分工及工作技術(shù)路線。2、資料收集、方法建立。確定編制工作小組后即展開調(diào)查研究，收集資料，包括國內(nèi)、區(qū)內(nèi)已頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、國內(nèi)公開發(fā)表的相關(guān)技術(shù)性資料。查閱是否有相關(guān)的熒光定量PCR方法應(yīng)用于蝦十足目虹彩病毒1的檢測，經(jīng)綜合分析研判，編制人員根據(jù)分工，采購試劑、設(shè)計引物探針、結(jié)合項目組開展的相關(guān)科研和檢測工作基礎(chǔ)，廣泛從蝦場收集十足目虹彩病毒1病原，初步建立十足目虹彩病毒1熒光定量PCR方法。3、優(yōu)化方法，形成征求意見稿。標(biāo)準(zhǔn)起草小組成員在前期研究工作以及初步建立的方法上，將試劑濃度、各反應(yīng)條件進行優(yōu)化、改進，篩選最佳反應(yīng)程序，建立標(biāo)準(zhǔn)的熒光定量PCR方法，制定熒光定量PCR檢測技術(shù)的操作規(guī)程，標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)法律、法規(guī)要求，參考國內(nèi)相關(guān)文獻資料以及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)資料進行編寫起草標(biāo)準(zhǔn)文稿。經(jīng)兩家起草單位工作人員討論修改，最終完成《十足目虹彩病毒1檢測熒光定量PCR法》團體標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿。四、標(biāo)準(zhǔn)編制原則1、實用性原則本文件是在充分查閱和收集相關(guān)資料文獻，在國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)尚未有熒光定量PCR法檢測十足目虹彩病毒1的情況下制定的，熒光定量PCR方法在病原檢測中應(yīng)用廣泛成熟。本標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)過反復(fù)試驗研究，對于樣品的檢測，特異性、敏感性、操作簡便性優(yōu)于普通的PCR方法，廣西是對蝦養(yǎng)殖大區(qū)，其他養(yǎng)殖的蝦還有羅氏沼蝦、克氏原鰲蝦、澳洲小龍蝦，這些品種均對虹彩病毒易感。因此，制定十足目虹彩病毒1的熒光定量PCR的檢測標(biāo)準(zhǔn)非常必要和實用，是廣西蝦養(yǎng)殖業(yè)疫病防控和可持續(xù)發(fā)展的需要。2、協(xié)調(diào)性原則本文件在編寫過程中注意了與蝦虹彩病毒檢測相關(guān)法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。3、規(guī)范性原則本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本文件的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。4、前瞻性原則本文件在兼顧熒光定量PCR檢測十足目虹彩病毒1的同時，還考慮到了病毒可能變異及檢測方法發(fā)展的趨勢和需要，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個別特色性、前瞻性和先進性條款，作為該病原檢測技術(shù)發(fā)展的指導(dǎo)。五、標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容及依據(jù)團體標(biāo)準(zhǔn)《十足目虹彩病毒1檢測熒光定量PCR法》主要章節(jié)內(nèi)容包括：試劑與材料、儀器設(shè)備、操作方法及結(jié)果判定；主要依據(jù)來源為長期從事的病原分子生物學(xué)技術(shù)檢驗及參照的相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。1.試劑與材料試劑和材料是此檢測方法的必備品，根據(jù)所使用的試劑和材料詳細(xì)列出使用到的試劑、主要儀器設(shè)備和耗材。1.1一般要求所用試劑如無特殊說明均為分析純試劑；試驗用水應(yīng)符合GB/T6682-2008一級水的要求。此條款針對試劑純度級別、試驗用水要求。1.2引物與TaqMan-MGB探針上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1、TaqMan-MGB探針DIV1-qP1根據(jù)寡核苷酸序列人工合成，擴增167bp的目的片段。使用濃度均為10μmol/L。使用前按本標(biāo)準(zhǔn)要求先用滅菌DEPC水稀釋，稀釋后分裝成小量置于-20℃引物序列是PCR檢測的核心，其使用濃度決定擴增效率，此條款給出引物序列及使用配制濃度、保存方法。1.3DNA抽提試劑商品化DNA抽提試劑盒、異丙醇等多種DNA提取的相關(guān)試劑。此條款在于說明DNA提取所用到的關(guān)鍵試劑，能達到同等效果的試劑或試劑盒均可選擇。1.4儀器設(shè)備定量PCR儀、組織勻漿機、冰箱、高壓滅菌鍋、離心機等儀器設(shè)備。此條款列出所必備的儀器設(shè)備，可用不同品牌，但須滿足試驗需要。1.5耗材微量移液器槍頭、離心管、0.2mLPCR管、塑料或乳膠手套等。此條款列出所必備的耗材，均為一次性使用，避免交叉污染，可用不同品牌耗材，但須滿足試驗需要。2.操作方法具體規(guī)定了采樣、樣品前處理、對照樣品的處理、DNA提取、熒光定量PCR加樣體系。2.1采樣樣品采集按SC/T7103-2008（水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范）的規(guī)定執(zhí)行。采樣數(shù)量和方法關(guān)乎檢測結(jié)果的可靠性，此條款確定采樣按照國標(biāo)規(guī)定，減少漏檢和假陰性可能。2.2樣品前處理蝦樣按不同規(guī)格取不同組織。其中，受精卵、幼體、仔蝦采集整條蝦作為樣品，3cm以下幼蝦采集除蝦眼外整條蝦作為樣品，3cm以上蝦采集鰓、肝胰腺作為樣品。采集的樣品用組織勻漿機勻漿，立即進行DNA提取操作或–80℃超低溫冰箱保存。此條款考慮到樣品的處理方式影響最終檢測結(jié)果，比如蝦眼含有PCR抑制物，需去除；成蝦的鰓和肝胰腺組織中病毒含量最高，選擇含毒量高的組織檢測，降低漏檢風(fēng)險，該條款根據(jù)其他標(biāo)準(zhǔn)中蝦樣品處理方法及文獻報道確定。2.3對照樣品的處理陽性對照樣品和陰性對照樣品的采集和取樣參照檢測樣品同時進行，將采集的蝦組織樣品勻漿后小量（30mg）分裝于1.5mL離心管后置于–80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。每次檢測前各取出1管陽性對照和陰性對照樣品，與待檢樣品進行后續(xù)操作。此條款規(guī)定必須設(shè)置陽性、陰性對照同時進行熒光定量PCR檢測，以評價試驗有效性，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試驗設(shè)置對照。2.4DNA的提取取30mg樣品，按照商品化動物組織基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取總DNA，最后加60μL洗脫緩沖液溶解DNA，置于–20℃保存?zhèn)溆谩４藯l款確定取樣量及DNA抽提方法，推薦采用試劑盒提取DNA，長期實驗研究結(jié)果表明，試劑盒提取DNA操作更簡便、DNA損失更少、純度更高。2.5熒光定量PCR方法建立（此章節(jié)為補充此方法各指標(biāo)的支撐數(shù)據(jù)圖、表）2.5.1引物與TaqMan-MGB探針的設(shè)計與合成虹彩病毒的主衣殼蛋白(majorcapsidprotein，MCP)基因中含有許多高度保守的結(jié)構(gòu)域，以DIV1的MCP基因為檢測靶基因。采用PrimerExpress3.0軟件按熒光定量PCR引物和MGB探針的設(shè)計原則，在MCP基因(KY681039)區(qū)域設(shè)計多組特異的擴增引物和TaqMan-MGB探針，其中探針的5′端標(biāo)記熒光染料FAM、3′端標(biāo)記MGB基團。2.5.2病原核酸的提取及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備取50mg陽性病料組織，按照動物組織基因組DNA快速提取試劑盒說明書，提取蝦核酸DNA，加50μL洗脫緩沖液(EB)溶解DNA，置于–20℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽淞酥亟M質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（pMD18-T-MCPDIV1)；提取重組質(zhì)粒DNA，用核酸蛋白分析儀測定其濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)；將重組質(zhì)粒DNA以10倍梯度稀釋至1.0×101～1.0×109拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品，–20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增DIV1的MCP基因，獲得與預(yù)期目的片段大小一致的擴增條帶(圖1)。目的片段回收純化后克隆入pMD18-T載體，重組質(zhì)粒pMD18-T-MCPDIV1經(jīng)PCR、測序鑒定，所得目的片段序列與GenBank上公布的MCP基因部分序列同源性為100%，說明目的基因片段正確連接入pMD18-T載體。取陽性克隆菌液提取質(zhì)粒，測定濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，pMD18-T-MCPDIV1濃度為4.62×109拷貝/μL，可滿足標(biāo)準(zhǔn)品的要求。圖1DIV1-MCP基因的PCR擴增及pMD18-T-MCPDIV1的PCR鑒定結(jié)果M:DL1000DNAMarker;1-2:DIV1-MCP基因;3-5:pMD18-T-MCPDIV1;NC:陰性對照2.5.3熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以3個梯度(1.0×109、1.0×105、1.0×101拷貝/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，按試劑說明書在56～64℃范圍內(nèi)，以1℃的梯度進行熒光定量PCR擴增，以獲得較低閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值和較高的相對熒光強度增加值(ΔRn)時的退火溫度為最佳。以3個梯度(1.0×109、1.0×105、1.0×101拷貝/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，采用引物不同終濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μmol/L)與探針不同終濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L)組合進行熒光定量PCR，以獲得較低的Ct值和較高的ΔRn時的引物和探針濃度組合為最佳。經(jīng)比較不同退火溫度及不同引物和探針濃度組合的擴增效果，最終確定反應(yīng)體系為：ProbeqPCRMix(2×)10μL，ROXReferenceDyeⅡ0.2μL，上下游引物DIV1--qF1/qR1(10μmol/L)均為0.4μL，探針DIV1-qP1(5μmol/L)為1.2μL，模板2μL，用滅菌ddH2O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，58℃退火并延伸45s，擴增40個循環(huán)；在58℃結(jié)束時收集熒光信號。2.5.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性試驗以10個梯度(1.0×109～1.0×100拷貝/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，用優(yōu)化后的熒光定量PCR方法進行檢測；利用數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，建立起始模板拷貝數(shù)(X)的對數(shù)與Ct值(Y)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程，并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品DNA的擴增結(jié)果來判斷該方法的定量范圍和敏感性。結(jié)果顯示(圖2)，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×109～1.0×104拷貝/μL)的擴增曲線呈明顯的“S”型，低濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×103～1.0×101拷貝/μL)的擴增曲線因未達擴增平臺期呈半“S”型，各梯度標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線重復(fù)性好、熒光強度增量明顯、間距均勻；標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0×109～1.0×101拷貝/μL時，分析建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系好(圖3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.249*LOG(X)+38.98，Eff.(擴增效率)和RSq(相關(guān)系數(shù)方值)分別為103.1%和1.000。結(jié)果表明，建立的熒光定量PCR方法對標(biāo)準(zhǔn)品的擴增效率高，起始模板濃度范圍為2.0×109～2.0×101拷貝/反應(yīng)時，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確地反映目的產(chǎn)物的擴增，可用于定量分析。經(jīng)數(shù)據(jù)分析軟件分析，標(biāo)準(zhǔn)品DNA為20拷貝/反應(yīng)時，3個重復(fù)的Ct值分別為34.91、35.04、35.04，仍有明顯的擴增曲線(圖2)，且重復(fù)性好；標(biāo)準(zhǔn)品DNA為2拷貝/反應(yīng)時，3個重復(fù)的Ct值分別為37.47、38.85、38.98，重復(fù)性差。因此，該方法的靈敏度約為20個拷貝/反應(yīng)。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)用該方法時建議以Ct值35為界限，若檢測樣品的Ct值小于或等于35，且有擴增曲線，則判為DIV1陽性；Ct值大于35，且有擴增曲線，則重復(fù)1次，如結(jié)果一致，判為DIV1陽性；Ct值大于35，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴增曲線，判為DIV1陰性。圖2標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×109~1.0×100拷貝/μL)熒光定量PCR擴增曲線圖3熒光定量PCR檢測DIV1的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.5.5特異性試驗分別以DIV1、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的核酸DNA為模板，用優(yōu)化后的熒光定量PCR方法進行檢測，評價方法的特異性。結(jié)果(圖4)，只有DIV1出現(xiàn)擴增曲線，Ct值分別為15.78、15.82、15.84、，判為陽性；而其他病原均未出現(xiàn)擴增曲線，判為陰性。說明本研究建立的熒光定量PCR對DIV1的檢測具有很好的特異性。圖4熒光定量PCR的特異性檢測2.5.6重復(fù)性試驗選取3個梯度(1.0×107、1.0×106、1.0×105拷貝/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，在間隔第7天和第14天分別進行重復(fù)試驗，每個梯度做3個平行，記錄各次試驗的Ct值，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析得到組內(nèi)及組間的變異系數(shù)，檢測標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性及方法的重現(xiàn)性。變異系數(shù)(CV)=標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/平均數(shù)(X)。1.0×107、1.0×106、1.0×105拷貝/μL3組標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性試驗結(jié)果見表2，組內(nèi)的實驗變異系數(shù)為0.27%～0.54%，組間實驗變異系數(shù)為0.61%～0.95%，表明該方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好，結(jié)果穩(wěn)定可靠；同時說明本研究制備的重組質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，可作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽性對照使用。表2DIV1熒光定量PCR重復(fù)試驗結(jié)果Table2Resultsofrepeatabilitytestofthereal-timePCRforDIV1標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)組內(nèi)試驗組間試驗第1天第7天第14天Ct±SDCV(﹪)Ct±SDCV(﹪)Ct±SDCV(﹪)Ct±SDCV(﹪)1×10715.67±0.060.3615.88±0.070.4515.96±0.060.3815.84±0.150.951×10618.82±0.050.2718.96±0.070.3719.05±0.090.4918.94±0.120.611×10522.12±0.090.4122.31±0.080.3422.39±0.120.5422.27±0.140.622.5.7熒光定量PCR法與套式PCR法的敏感性比較提取DIV1陽性病料組織的陽性DNA以10倍梯度稀釋(100～10-6)，取2μL各梯度DNA為模板同時進行熒光定量PCR法和套式PCR法檢測(農(nóng)業(yè)部DIV1D監(jiān)測計劃推薦方法)，比較它們的敏感性。采用熒光定量PCR法和套式PCR法分別對10倍梯度稀釋的DIV1陽性DNA(100～10-5)進行檢測，結(jié)果(圖5、6)顯示，熒光定量PCR法和套式PCR法均可檢測到10-4稀釋度的陽性DNA，即熒光定量PCR法的敏感度可達到套式PCR法的敏感度。圖5熒光定量PCR法對臨床樣品的敏感性圖6套式PCR法的對臨床樣品的敏感性Fig.5Sensitivityofthereal-timePCRforDIV1fromclinicalsamplesFig.6SensitivityofthenestedPCRforDIV1fromclinicalsamplesM:DL1000DNAMarker;1-6:套式PCR法第一輪PCR產(chǎn)物;7-12:套式PCR法第二輪PCR產(chǎn)物;NC:陰性對照4.結(jié)果判定4.1定性檢測陽性對照Ct值小于35且出現(xiàn)S型擴增曲線，陰性對照和空白對照Ct值不顯示且未出現(xiàn)擴增曲線，實驗有效；若檢測樣品的Ct值小于或等于35，且有擴增曲線，則判為DIV1DNA陽性；Ct值大于35，且有擴增曲線，則重復(fù)1次，如結(jié)果一致，判為DIV1DNA陽性；Ct值大于35，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴增曲線，判為DIV1DNA陰性。此條款只針對于結(jié)果判定為陽性或陰性、無需定量病毒含量的樣品。4.2定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)小于或等于-0.970，陽性對照Ct值小于35且出現(xiàn)S型擴增曲線，陰性對照和空白對照Ct值不顯示且未出現(xiàn)擴增曲線，實驗有效；檢測樣本中1×103拷貝/mg≤DIV1DNA≤1×108拷貝/mg，測定結(jié)果有效，可直接報告陽性及相應(yīng)的拷貝量；檢測樣本中DIV1DNA＞1×108拷貝/mg，即可直接報告為＞1×108拷貝/mg，也可用滅菌DEPC水10倍梯度做相應(yīng)稀釋，使其拷貝量落在1×105～1×107拷貝/mg范圍內(nèi)再重新測定，測定結(jié)果應(yīng)以稀釋倍數(shù)進行校正；檢測樣本DIV1DNA的拷貝量為1×101～1×103拷貝/mg時，建議對該樣本進行雙份重試，如雙份樣本重試結(jié)果仍在1×101～1×103拷貝/mg，則按實際值計算；如雙份或一份重試結(jié)果＜1×101拷貝/mg，則判為DIV1DNA陰性；Ct值不顯示時或DIV1DNA的拷貝量＜1×101拷貝/mg，該樣本判為DIV1D