JJF(浙) 1124-2016 基因擴(kuò)增儀（聚合酶鏈反應(yīng)分析儀）校準(zhǔn)規(guī)范

基因擴(kuò)增儀(聚合酶鏈反應(yīng)分析儀)浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布CalibrationSpecificationofPolymeraseChainReactionAn 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 5 5 5 5 5 5 1標(biāo)準(zhǔn)：SN/T2102.1—2008/ISO22174：2005《食源性病原體PCR檢測技術(shù)規(guī)范第1部技術(shù)規(guī)范第2部分：PCR性能試驗要求》；JJF1030-2010《恒溫槽校準(zhǔn)規(guī)范》；2基因擴(kuò)增儀（聚合酶鏈反應(yīng)分析儀）校準(zhǔn)規(guī)范本規(guī)范適用于模塊加熱的定性基因擴(kuò)增儀（也稱聚合酶鏈反應(yīng)分析儀Polymerase熒光實時定量PCR儀，若可作為普通PCR儀使用的，則可參照本規(guī)范SN/T2102.1—2008/ISO22174:200SN/T2102.2—2008/ISO20836:2005食源性病原體PCR檢測技術(shù)規(guī)范第2部分：3同一循環(huán)中，恒溫計時開始10s內(nèi)到計時結(jié)束之間，某一規(guī)定時刻點溫控裝置工作常為95℃降至30℃,根據(jù)設(shè)定溫度程序段的不同，也可為90℃降至50℃)PCR儀是一種DNA聚合酶在指定的溫度場條件下使特定基因片段發(fā)生快速擴(kuò)增的儀器，其基本原理為：加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA本中的核酸呈指數(shù)級擴(kuò)增。因此，PCR儀45.1.1PCR儀上應(yīng)有以下標(biāo)志和符號：產(chǎn)品名稱、±0.5℃用的程序來確定，并不一定與給出的±0.5℃±0.5℃±0.5℃±0.6℃±0.8℃±3℃56.1.2環(huán)境濕度10～75）%RH。6.1.3大氣壓力86～106）kPa。要求溫度傳感器能與PCR儀孔板接觸良好，且溫度采樣頻率不低于2Hz。溫度測量標(biāo)準(zhǔn)7.2.1.1校準(zhǔn)前需將PCR儀開機(jī)調(diào)整7.2.1.2將PCR儀及溫度校準(zhǔn)裝置各部件連接完好，在溫度傳感器表面上涂抹適量導(dǎo)熱油，48孔和96孔的PCR儀按圖1所示將溫度傳感器置于PCR儀加熱模塊中熱模塊接觸良好。具有頂蓋加熱功能的PCR儀應(yīng)在頂蓋下方中心放置薄膜狀溫度傳感器，用于校準(zhǔn)頂蓋溫度。48孔的PCR儀配有12只溫度傳感器，96孔的PCR儀6溫度檢測系統(tǒng)設(shè)定為相同溫控程序，表2為控制程序標(biāo)準(zhǔn)示例。后文的校準(zhǔn)項目均在96常為95℃~105℃)7130°C295°C330°C490°C550°C670°C760°C830°C間，取某一規(guī)定時刻點（如第30s時刻點）每個溫度標(biāo)準(zhǔn)器測得的溫度值中的最大值，間，取某一規(guī)定時刻點（如第30s時刻點）每個溫度標(biāo)準(zhǔn)器測得的溫度值中的最小值，間，取某一規(guī)定時刻點（如第30s時刻點）所有溫度標(biāo)準(zhǔn)器測得的溫度值的平均值，為15T T8 T TcoverTcsTcoverT 9JJF(浙)1124—2016圖3(a)95℃和(b)30℃溫度超調(diào)量示意圖7.2.8平均超調(diào)溫度PCR儀工作區(qū)域內(nèi)升溫或降溫至規(guī)定溫度時，15個溫度標(biāo)準(zhǔn)器測得的溫度超調(diào)量的平均值。7.2.9溫度均勻度溫度均勻度計算公式見式(4):7.2.10升溫速率PCR儀從30℃升溫至95℃的升溫速率計算公式(5):t:從第n點溫度升高到第m點溫度的時間，s。PCR儀從95℃降溫至30℃的降溫速率計算公式td(TxTy)/t（6）Tx：第x點（95℃)的溫度值，℃;Ty：第y點（30℃)的溫度值，℃。經(jīng)校準(zhǔn)的PCR儀出具校準(zhǔn)證書，校準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)在）；g)進(jìn)行校準(zhǔn)的日期，如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時，應(yīng)說明被校對象PCR儀的復(fù)校時間間隔的長短是由儀器是使用情況、使用者、儀器本身質(zhì)量等諸因素所決定的，因此，送校單位可根據(jù)實際使用情況自主決定復(fù)校時間。建議復(fù)校時間有效日期：狀態(tài)：使用前口正?？谑褂煤罂谡？?量值溯源單位：校準(zhǔn)地點：1、溫度校準(zhǔn)點布點圖2、校準(zhǔn)時的控制程序：設(shè)定溫度點設(shè)定溫度持續(xù)時間123456789設(shè)定點(℃)最高溫度(℃)最低溫度(℃)平均溫度(℃)溫度偏差(℃)最大超調(diào)溫度(℃)平均超調(diào)溫度(℃)溫度均勻度(℃)熱蓋溫度偏差(℃)升溫速率(℃/s)降溫速率(℃/s)設(shè)定溫度點(℃)設(shè)定溫度持續(xù)時間(s)123456789結(jié)束三、校準(zhǔn)結(jié)果及不確定度設(shè)定溫度(℃)最高溫度(℃)最低溫度(℃)平均溫度(℃)溫度偏差(℃)最大超調(diào)溫度(℃)平均超調(diào)溫度(℃)溫度均勻度(℃)熱蓋溫度偏差(℃)平均升溫速率(℃/s)平均降溫速率(℃/s)擴(kuò)展不確定度U(℃)(k=2)(以下空白)Tc——15個溫度傳感器測量值的平均值；t修——標(biāo)準(zhǔn)器修正值T uc2c1u12c2u22c3u32(C.2)C.4.1.1PCR儀分辨力引入的不確定度u1PCR儀分辨力0.1℃時，u1=0.05℃/3=0.029℃(C.3)C.4.2輸入量Tc的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2的評定C.4.2.1標(biāo)準(zhǔn)溫度傳感器測量平均值的重復(fù)性引入的不確定度u21表C1溫度傳感器10個循環(huán)的95℃點30s時測量值測量次數(shù)傳感器測量值123456789sp j1(xj j1101spsp0.017℃取15個傳感器的測量平均值作為實驗結(jié)果，故：u0.017℃C.4.2.2標(biāo)準(zhǔn)溫度傳感器短期穩(wěn)定性引入的不確定度u22在短時間內(nèi)（3分鐘）標(biāo)準(zhǔn)溫度傳感器變化估計為±0.01℃,按均勻分布處理，則 u220.01/3=0.0058℃ C.4.2.3u21和u22相互獨立，故u2u1u2=0.0108℃C.4.3.1標(biāo)準(zhǔn)溫度傳感器校準(zhǔn)不確定度u3u3U/k=0.13℃/2=0.