rna分離實(shí)驗(yàn)報(bào)告

rna分離實(shí)驗(yàn)報(bào)告RNA分離實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)介紹RNA（核糖核酸）是生物體內(nèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)等過(guò)程中必須的基因信息分子。因此，RNA的分離和純化對(duì)于研究基因表達(dá)、新藥研發(fā)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)基礎(chǔ)的RNA分離實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生能夠掌握RNA分離的基本原理、過(guò)程、技術(shù)，以及注意事項(xiàng)和實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。二、實(shí)驗(yàn)材料1.TRIzol試劑（Invitrogen）2.E.coliDH5α菌落3.LB培養(yǎng)基4.DEPC水5.75%、95%和100%乙醇6.RNaseinhibitor（Takara）7.DNaseI（Ambion）8.GlycoBlueTM9.RNA聚腺苷酸酶（NEB）三、實(shí)驗(yàn)原理RNA的分離方式多樣，常見的方式有酚/氯仿、硅膠柱、磷酸鉻柏等。本實(shí)驗(yàn)選用TRIzol法，其原理是利用TRIzol試劑可同時(shí)溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核和胞質(zhì)，RNA在酒精中沉淀，通過(guò)洗滌和濃縮使RNA可純化出來(lái)。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.培養(yǎng)大腸桿菌DH5α并收獲菌株a)預(yù)熱需要的LB培養(yǎng)基，制備含有50μg/ml的氨芐青霉素（Amp）LB培養(yǎng)基。b)在AmpLB培養(yǎng)基中篩選含有目的DNA的合適菌落，通過(guò)PCR驗(yàn)證。c)用50μlAmpLB培養(yǎng)基接種含有目的DNA的合適菌落，侵潤(rùn)過(guò)夜。2.細(xì)胞收獲并裂解分離RNA的前提是裂解細(xì)胞并釋放RNA分子，使用TRIzol方法時(shí)需要添加RNaseinhibitor以保證RNA不受到酶的影響。a)將菌落上樣入含有AmpLB培養(yǎng)基的瓶子中，用恒溫振蕩培養(yǎng)到OD600值為0.6?0.8的增殖期。b)將細(xì)胞均勻分布到不同的1.5MICROcentrifuge管中，如一組需要10個(gè)細(xì)胞，那么就需10個(gè)管，每個(gè)管加入500μlTRIzol試劑。c)均勻加入500μlTRIzol試劑，在冰上離心5min收集上清液，此時(shí)細(xì)胞已被完全溶解。d)將路洛舒聯(lián)合試劑加入上清液中，再次冰上離心。此時(shí)路洛舒聯(lián)合試劑形成一層白色膠體，將樣品轉(zhuǎn)移至新的1.5MICROcentrifuge管中，并在-20℃保存。3.RNA沉淀和清洗RNA在70%酒精上升降沉淀，不同濃度的酒精沉淀物不同。70%酒精沉淀物易純化，但含有脂質(zhì)和色素物質(zhì)。除去色素的方法是添加GlycoBlueTM，它的作用是吸收雜質(zhì)光譜波長(zhǎng)上的光線而能減小這些雜質(zhì)的影響。a)用DNaseI降解DNA，加入10μlDNaseI緩沖液和2μlDNaseI，37℃反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢后，加入10μlDNaseI止血液，靜置5min。b)加入1ulRNA聚腺苷酸酶去除RNA的5’端和3’端的磷酸基團(tuán)，消除RNA分子伸展?fàn)顟B(tài)，在37℃下反應(yīng)1h。c)將樣品從-20℃取出，在室溫下緩慢溶解，加入200μl冰冷的70%乙醇，與GlycoBlueTM混合，反復(fù)翻轉(zhuǎn)混合，沉淀時(shí)間大約10min，此時(shí)RNA沉淀在底部。d)在4℃下離心10min，取下上清液，加入500μl冰冷的75%乙醇，在4℃下洗滌RNA沉淀，傾倒廢棄上清，避免干燥。一共洗滌3次。注意事項(xiàng)：四度下操作，避免RNA斷裂使得實(shí)驗(yàn)失敗。e)將RNA沉淀干燥，在免疫雜交中加入DEPC水加以儲(chǔ)存。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在RNA分離實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中需要去除多余的DNA，dnase1的作用就是消除DNA，反向轉(zhuǎn)錄時(shí)需要夠至7301nt的OligodT。dnase1的RNaseactivity可以根據(jù)分光光度計(jì)的吸收曲線測(cè)定。光譜曲線表明dnase1對(duì)RNA沒有明顯影響，但對(duì)DNA有很好的去除效果（圖1）。圖1.分光光度計(jì)吸收曲線用RNA聚腺苷酸酶結(jié)束反饋的結(jié)果表明：RNA純化程度較高，樣品能夠在瓊脂糖凝膠電泳中清晰地顯示（圖2）。圖2.DNA上樣的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果除去色素的效果可以明顯地從樣本純化之前和之后的吸收曲線變化來(lái)觀察（圖3）。圖3.GlycoBlue對(duì)于樣本的凈化效果\\六、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.保持操作環(huán)境清潔，且防止RNA接觸到空氣。2.在試劑分裝、保存過(guò)程中，要用有RNaseactivity的工具，使用去污器擦拭臺(tái)面。3.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用防RNase手套、面罩、一次性口罩等防護(hù)用品。4.檢查梯度濃度酒精是否準(zhǔn)確。5.瓊脂糖凝膠電泳運(yùn)行時(shí)要嚴(yán)格控制電場(chǎng)，避免RNA的斷裂。七、實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)我們成功地利