TSATA 071-2024 水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的測(cè)定熒光檢測(cè)法

ICS13.060.01Determinationoftotalcoliform,EscherichiacoliandfecalcoliforminwaterIT/SATA071—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4方法原理 5試劑與材料 6儀器和設(shè)備 27樣品 27.1樣品的采集 27.2樣品的保存 27.3試樣的制備 27.4空白試樣的制備 28分析步驟 38.1試樣測(cè)定 38.2空白試驗(yàn) 38.3陽(yáng)性和陰性對(duì)照試驗(yàn) 39結(jié)果計(jì)算與表示 39.1定量分析 39.2結(jié)果表示 310質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 310.1空白試驗(yàn) 310.2平行樣的測(cè)定 410.3質(zhì)控樣品的測(cè)定 410.4培養(yǎng)基的質(zhì)量檢驗(yàn) 410.5菌株保存 411廢物處理 4T/SATA071—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本標(biāo)準(zhǔn)可能涉及某些有危險(xiǎn)性的材料、操作和設(shè)備，但是并未對(duì)與此有關(guān)的所有安全問(wèn)題都提出建議。因此，使用者在應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)前應(yīng)建立適當(dāng)?shù)陌踩头雷o(hù)措施，并確定相關(guān)規(guī)章限制的適用性。本文件由深圳市分析測(cè)試協(xié)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：廣東粵海水務(wù)檢測(cè)技術(shù)有限公司、廣東粵海水務(wù)股份有限公司。本文件主要起草人：路曉鋒、楊穎、彭俊翔、游文丹、郭瞻宇、王樊、黃俊能、吳凡、黃子其、陸心卉、韋雪檸、陳桂暢、戴歡、吳金鑫、黃慧星、龍慶平、馮國(guó)仁、王慶生、何振乾、文金麗、鄭開(kāi)云、楊創(chuàng)濤、彭鷺、李秀虹、陳誠(chéng)、吳國(guó)秋、曾惠、盧鵬澄、潘明茗、甘林林。1T/SATA071—2024水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的測(cè)定熒光檢測(cè)法本文件提供了測(cè)定水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的熒光檢測(cè)法。本文件適用于地表水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法HJ91.2-2022地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫(kù)采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)3術(shù)語(yǔ)和定義HJ1001-2018界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1總大腸菌群totalcoliforms在37℃培養(yǎng)能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌。[來(lái)源：HJ1001-2018，3.1]3.2大腸埃希氏菌escherichiacoli俗稱大腸桿菌，在37℃培養(yǎng)能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黃色的鄰硝基苯酚，同時(shí)產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷釋放出熒光物質(zhì)的腸桿菌科細(xì)菌。[來(lái)源：HJ1001-2018，3.3]3.3糞大腸菌群fecalcoliforms又稱耐熱大腸菌群（thermotolerantcoliforms）。在44.5℃培養(yǎng)能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌。[來(lái)源：HJ1001-2018，3.2]4方法原理使用試劑盒進(jìn)行總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的檢測(cè)，利用試劑盒中酶底物培養(yǎng)基，一定量的水樣與培養(yǎng)基混合均勻放置于適宜溫度下（總大腸菌群和大腸埃希氏菌37℃±1℃、糞大腸菌群44.5℃±0.5℃)環(huán)境下，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，可利用乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生特定的酶，并水解不同的底物生成熒光物質(zhì),依據(jù)待測(cè)水樣熒光強(qiáng)度變化與水中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群數(shù)成一定關(guān)系的原理，從而得出總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群濃度。5試劑與材料2T/SATA071—2024除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水為符合GB/T6682標(biāo)準(zhǔn)的一級(jí)5.1硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）。5.2乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2?2H2O）。5.3硫代硫酸鈉溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10g/mL。稱取15.7g硫代硫酸鈉（5.1），溶于適量水中，定容至100mL，臨用現(xiàn)配。5.4乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2?2H2O）=0.15g/mL。稱取15.0g乙二胺四乙酸二鈉（5.2溶于適量水中，定容至100mL，此溶液保質(zhì)期為30d。5.5無(wú)菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。5.6試劑盒：包括用于檢測(cè)糞大腸菌群的試劑盒和用于檢測(cè)總大腸菌群、大腸埃希氏菌的試劑盒。6儀器和設(shè)備6.1全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)。6.2采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的100mL、250mL、500mL廣口玻璃瓶。6.3高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。6.4量筒：100mL±1mL。6.5移液管：1mL±0.01mL、10mL±0.1mL。也可采用計(jì)量合格的可調(diào)式移液器。6.6三角瓶：100mL。6.7天平：感量0.01g。注1：在采集不存在或不考慮余氯、金屬離子干擾的樣品時(shí)，可采用市售7樣品7.1樣品的采集采集河流、湖庫(kù)等地表水樣品時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞的采樣瓶插入水中，約距水面10cm-15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒(méi)有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無(wú)菌包裝紙。也可使用滅菌過(guò)的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（5.3），以除去活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用（每125mL容積加入0.1mL的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（5.4以消除干擾（每125mL容積加入0.3mL的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。注：15.7mg硫代硫酸鈉（5.3）可去除樣品中1.5mg活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實(shí)際活性氯量調(diào)整。7.2樣品的保存采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測(cè)，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過(guò)6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開(kāi)展檢測(cè)的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測(cè)。7.3試樣的制備對(duì)于較為潔凈的地表水，可直接取地表水樣品100mL進(jìn)行檢測(cè)，如需對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，可采用10倍逐級(jí)稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。7.4空白試樣的制備以滅菌水代替樣品，直接取100mL水樣進(jìn)行檢測(cè)。3T/SATA071—20248分析步驟8.1試樣測(cè)定根據(jù)樣品污染程度確定接種量。通常接種量為100mL。當(dāng)接種量小于100mL時(shí)，應(yīng)稀釋樣品后接種，接種量為10mL時(shí)，取10mL樣品加入到盛有90mL無(wú)菌水（5.5）的三角瓶（6.6）中混勻制成1:10的稀釋樣品，其它接種量的稀釋樣品依次類推。將接種后的檢測(cè)套筒放置于全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)，糞大腸菌群設(shè)置FCA檢測(cè)模式，培養(yǎng)溫度為44.5℃,在2h～18h后儀器自動(dòng)培養(yǎng)得出結(jié)果；總大腸菌群和大腸埃希氏菌設(shè)置CCA檢測(cè)模式，培養(yǎng)溫度為37℃,在2h～18h后儀器自動(dòng)培養(yǎng)得出結(jié)果。8.2空白試驗(yàn)按照與試樣測(cè)定（8.1）相同的操作步驟進(jìn)行空白試樣（8.2）的測(cè)定。8.3陽(yáng)性和陰性對(duì)照試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300～3000個(gè)/mL的菌懸液，按照試驗(yàn)測(cè)定（8.1）過(guò)程操作，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈陰性反應(yīng)。否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效。也可使用市售的已知濃度的定量菌株進(jìn)行操作。總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的陽(yáng)性、陰性菌株參考表1。表1陽(yáng)性、陰性菌株參考表大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter假單胞菌屬(Pseudomonassp.)大腸埃希氏菌（耐熱型）、克雷伯氏菌屬9結(jié)果計(jì)算與表示9.1定量分析樣品中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的濃度C按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算。式中：C——樣品中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群濃度，MPN/L；MPN——儀器的讀數(shù)值，即每100mL樣品中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群濃度，MPN/100mL；1000——將C單位由MPN/mL轉(zhuǎn)換為MPN/L；f——最大接種量,mL。9.2結(jié)果表示測(cè)定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測(cè)定結(jié)果≥100MPN/L時(shí)，以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示，若結(jié)果為陰性時(shí)，可報(bào)告為＜10MPN/L或未檢出。10質(zhì)量保證和質(zhì)量控制10.1空白試驗(yàn)4T/SATA071—2024每批