神經(jīng)生物學(xué)第二章-神經(jīng)生物學(xué)研究的方法

課程成績?cè)u(píng)定平時(shí)出勤20%平時(shí)作業(yè)20%：翻譯一篇1500-2000字較新的有關(guān)神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的英文小專論文或段落，自己查找覺得有意思的素材，10月28日交電子版（發(fā)至liuyanq2@126.com)和紙質(zhì)版，附上英文原文。期末考試(筆試)60%第二章神經(jīng)生物學(xué)研究的方法和手段一、形態(tài)學(xué)方法二、生理學(xué)方法三、電生理學(xué)方法四、生物化學(xué)方法五、分子生物學(xué)方法六、腦成像（Brainimaging）技術(shù)一、形態(tài)學(xué)方法

束（通）路追蹤法熒光組織化學(xué)法原位雜交法受體定位法神經(jīng)系功能活動(dòng)形態(tài)定位法

1、束（通）路追蹤法：研究神經(jīng)元之間的聯(lián)系

軸漿運(yùn)輸法—利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象的追蹤法。

追蹤劑：辣根過氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)熒光染料：核黃(nuclearyellow)

固藍(lán)(fastblue)

熒光金(fluorogold)植物凝集素如麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)細(xì)菌毒素如霍亂毒素病毒如活的神經(jīng)病毒

(胞疹病毒和彈狀病毒）

變性法：利用神經(jīng)元包體受損或神經(jīng)軸突離斷后遠(yuǎn)側(cè)軸突的變性，或軸突切斷后細(xì)胞的反應(yīng)，來研究纖維的聯(lián)系。

*物理性方法：刀的切割、電凝、電離破壞、超聲破壞等。

*化學(xué)性破壞：興奮性氨基酸（海人酸和鵝高蕈氨酸）

單胺類神經(jīng)毒（６－羥多巴胺、６－羥多巴、雙羥色胺）神經(jīng)元質(zhì)膜熒光染料法：用羰花青（carbocynine）熒光染料，可以染出神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜，并可以在活體或固定的標(biāo)本上追蹤纖維聯(lián)系。

２、免疫組織化學(xué)法

用特異性抗體顯示神經(jīng)組織化學(xué)成分的方法。

基本過程有：固定、制片、反應(yīng)等三步。l

免疫組織化學(xué)反應(yīng)：有直接法和間接法l雙重免疫組織化學(xué)染色：主要是為了研究兩種物質(zhì)在同一細(xì)胞或突起內(nèi)的共存現(xiàn)象，或兩種不同化學(xué)物質(zhì)的相互關(guān)系。免疫組化的類型:直接法和間接法

３、原位雜交法

在形態(tài)學(xué)研究中，主要用于顯示細(xì)胞內(nèi)功能蛋白或多肽的mRNA。

４、受體定位法：研究受體在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的定位

配體法：主要在組織切片上進(jìn)行，利用標(biāo)記的配體和受體結(jié)合以示蹤其部位

免疫組織化學(xué)法：用針對(duì)受體的抗體

原位雜交法

:受體的mRNA５、神經(jīng)系功能活動(dòng)形態(tài)定位法

脫氧葡萄糖法：原理是：神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)其能量主要依賴葡萄糖提供。在腦內(nèi)存在脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2DG，用于抗病毒的藥物)時(shí)，神經(jīng)元可不加區(qū)別地將2DG與葡萄糖一起攝入細(xì)胞內(nèi)，兩者都是己糖激酶的底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖異構(gòu)酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為果糖-6-PO4，不能繼續(xù)在糖酵解循環(huán)中代謝。

如在2DG上標(biāo)以同位素。神經(jīng)元內(nèi)同位素的堆積程度反映了神經(jīng)元的活動(dòng)程度。

c-fos(Fos)法：

c-fos是一種原癌基因，屬于即刻－早期基因(immediate-earlygene)。很多刺激條件可通過第二信使引起神經(jīng)元c-fos的表達(dá)增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻譯成的Fos蛋白，立即轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與另一即刻早基因c-jun

所產(chǎn)生的蛋白Jun構(gòu)成二聚體（第三信使），調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，引起一系列的細(xì)胞反應(yīng)。

細(xì)胞色素氧化酶法：

神經(jīng)元線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶是提供神經(jīng)元能量的重要酶，細(xì)胞色素氧化酶的水平與神經(jīng)元能量需求密切相關(guān)，一般反映慢性刺激的結(jié)果。

二、生理學(xué)方法

損毀法

刺激法周身給藥法腦室注射法腦組織培養(yǎng)亞細(xì)胞分析神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測定

神經(jīng)遞質(zhì)的功能測定

行為學(xué)方法

1、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測定（在體invivo和離體invitro)推挽灌流法：

在體研究中樞核團(tuán)遞質(zhì)釋放的有用方法。通過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經(jīng)遞質(zhì)的變化。

腦透析術(shù)(braindialysis)：在特定的腦區(qū)內(nèi)，植入透析探頭，用生理溶液灌流時(shí)，細(xì)胞外液中的神經(jīng)遞質(zhì)可順濃度遞度從透析管擴(kuò)散至灌流液中，收集和測定灌流液中神經(jīng)遞質(zhì)的含量，就能監(jiān)測該遞質(zhì)的變化過程。

腦透析術(shù)的裝置包括:

探頭導(dǎo)管微量灌流泵樣品收集器定量分析儀

抗體微探針法：是在玻璃微電極上涂上一層神經(jīng)肽抗體，用于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)定位神經(jīng)肽的釋放。硼硅玻璃與r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反應(yīng)后在玻璃表面形成一層帶有游離氨基的硅氧烷(siloxane)多聚體微粒。該玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)處理，使戊二醛與蛋白質(zhì)A以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)，蛋白質(zhì)A再與神經(jīng)肽抗體結(jié)合，制成抗體微探針腦片灌流法和突觸體灌流法2、神經(jīng)遞質(zhì)的功能測定

微電泳：能將微量的神經(jīng)遞質(zhì)導(dǎo)入神經(jīng)元附近，觀察其作用?？贵w微量注射：特異性的抗體注射在某些部位，可中和神經(jīng)末梢釋放出而進(jìn)入突觸間隙的神經(jīng)肽，防止其與受體結(jié)合。因此，抗體微量注射所引起的功能變化可解釋為消除該神經(jīng)肽的生理效應(yīng)的結(jié)果。生物檢測（Bioassay）:經(jīng)典的方法.如用水蛭背最長肌測定ACh

的作用，靈敏度達(dá)10-10g.3、行為學(xué)方法

l

經(jīng)典條件反射：代表刺激與強(qiáng)化的關(guān)系。l操作式條件反射：是通過動(dòng)物自身的某個(gè)特定操作動(dòng)作而獲得食物或回避有害刺激的反應(yīng)活動(dòng)。

三、電生理學(xué)方法

1、電生理常用儀器

生物電放大器

電子刺激器

顯示、貯存和分析電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果的儀器：如示波器照相機(jī)和計(jì)算機(jī)。2、電生理學(xué)的常用方法

細(xì)胞外記錄(Extracellularrecording)：把引導(dǎo)電極安放在神經(jīng)組織的表面或附近引導(dǎo)神經(jīng)組織的電活動(dòng)。胞內(nèi)記錄(Intracellularrecording)：研究神經(jīng)元基本生物物理特性的有力手段。EPSP，IPSP，AP(動(dòng)作電位)腦內(nèi)電刺激：是研究中樞功能定位的方法之一。

順行沖動(dòng)記錄法(Orthodromicimpulserecording)：就是電刺激某一突觸前的細(xì)胞體、樹突或軸突，在此突觸后神經(jīng)元細(xì)胞體上記錄此刺激引起的電活動(dòng)變化。逆行沖動(dòng)記錄法(Antidromicimpulserecording)：逆行沖動(dòng)記錄法即電刺激神經(jīng)元的軸突主干或末梢，在同一神經(jīng)元胞體記錄反相傳導(dǎo)的動(dòng)作電位。

電壓鉗技術(shù)(VoltageClamp)：通過插入細(xì)胞內(nèi)的一根微電極向細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)充電流，補(bǔ)充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，這樣即使膜通透性發(fā)生改變時(shí)，也能控制膜電位數(shù)值的不變。

經(jīng)過離子通道的離子流與經(jīng)微電極施加的電流方向相反，數(shù)量相等。

SG:信號(hào)發(fā)生器，AFB:反饋放大器，V:監(jiān)測膜電位膜(斑)片鉗技術(shù)（PatchClamp）：可以從分子水平研究細(xì)胞膜離子通道的功能。用玻璃微電極與只含１～３個(gè)離子通道，面積為幾個(gè)平方微米的細(xì)胞膜通過負(fù)壓吸引封接起來，由于電極尖端與細(xì)胞膜的高阻封接，此片膜內(nèi)開放所產(chǎn)生的電流流進(jìn)玻璃吸管，用一極敏感的電流監(jiān)視器（斑片鉗放大器）測量此電流強(qiáng)度，就代表單一離子通道電流。

腦電波測定:

用雙極或單極引導(dǎo)法，將引導(dǎo)電極放在腦活動(dòng)區(qū)顱骨表面之上，可以記錄出能變換方向的微弱電流。通過強(qiáng)力放大記錄出來的電位稱腦電圖（ＥＥＧ）。

誘發(fā)電位:

中樞神經(jīng)的任何部位對(duì)于故意刺激感受器官、感受神經(jīng)、感覺通路上的任何一點(diǎn)，或與感覺器官有關(guān)的任何結(jié)構(gòu)上的一點(diǎn)，所產(chǎn)生的電變化，叫做誘發(fā)電位（evokedpotential)。

四、生物化學(xué)方法

1、用離心法分離制備突觸小體及突出小體膜突觸小體:是指腦組織在等滲溶液中勻漿時(shí)，神經(jīng)末梢的細(xì)胞膜從軸突上自發(fā)斷裂、封閉而形成的神經(jīng)末梢單位。它包括突觸前膜、突觸后膜及致密斑和包圍在突觸前膜的突觸小泡(vesicle內(nèi)含神經(jīng)遞質(zhì))，線粒體及胞漿蛋白質(zhì)。

由于突觸小體是神經(jīng)介質(zhì)及受體的主要聚集部位，突觸小體的制備便成了神經(jīng)介質(zhì)及受體的基本制備手段。

2、層析法:

特點(diǎn)：分離生物活性物質(zhì)時(shí)不使其失活，可大量制備?；驹恚罕环蛛x物質(zhì)與支持物相互作用的緊密程度不同，流洗時(shí)被洗脫的難易程度不同。

離子交換層析

分子篩層析或凝膠過濾

疏水性層析法

親和層析法

羥磷灰石層析法

高效液相層析

3、放射免疫(radioimmunoassay，RIA)測定神經(jīng)介質(zhì)：利用抗體(Ab)特異地識(shí)別其抗原（Ag）的原理，將抗原標(biāo)記放射性同位素（*Ag），用來測定與*Ag抗原性相同的物質(zhì)

*Ag+Ab*Ag.Ab+Ag↓↑Ag.Ab?

當(dāng)*Ag固定時(shí)，Ag含量越高，所得到的*Ag.Ab就越少。所用儀器：r-計(jì)數(shù)器，液體閃爍計(jì)數(shù)儀4、放射受體測定受體法

利用標(biāo)記能作用于不同靶組織內(nèi)各種受體的遞質(zhì)和激素，從而達(dá)到直接測定配體與其受體形成絡(luò)合物的過程和理化特性。5、免疫印跡法（immunoblotting

或westernblotting）鑒定生物分子將電泳凝膠分離出來的電泳帶移到特殊的濾膜上，再利用標(biāo)記抗體與濾膜上某一蛋白質(zhì)或肽的特異結(jié)合，使其顯色。優(yōu)點(diǎn)：一是將傳統(tǒng)的電泳凝膠染色法的敏感度提高了100~1000倍，二是與RIA相似，能從多種蛋白質(zhì)中選擇鑒定出一種特異的蛋白質(zhì)，其敏感性可達(dá)1ng，同時(shí)能知道這一蛋白質(zhì)的分子量，這又是RIA無法達(dá)到的。五、分子生物學(xué)方法

１、神經(jīng)生物學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)方法基因的分子克隆克隆后的基因在人工體外表達(dá)系統(tǒng)或細(xì)胞中的表達(dá)克隆后的基因作為探針研究基因表達(dá)的組織特異性和發(fā)育階段特異性研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的結(jié)構(gòu)特征有助于理解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

2、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：在神經(jīng)生物學(xué)研究中有廣泛的用途，如可應(yīng)用它發(fā)現(xiàn)和分析新基因，測定mRNA

３、反向遺傳學(xué)利用制造體內(nèi)基因突變的方法研究基因及其產(chǎn)物的功能：通過制造定向突變改變生物表型的方法與傳統(tǒng)遺傳學(xué)所采用的通過生物表型確定其基因型的方法相反，故稱反向遺傳學(xué)。

４、遺傳連鎖分析法分離遺傳病基因：人類基因組由23條染色體組成，基因組內(nèi)大約包含5~10萬個(gè)基因，其中40%在腦內(nèi)表達(dá)。約有1000多種遺傳病具有明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，占已知遺傳病總數(shù)的三分之一。

六、腦成像（Brainimaging）技術(shù)

利用各種方法和技術(shù)來攝取人及動(dòng)物顱骨和顱內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的影像，從而了解其是否異常的技術(shù)?？梢苑从?

顱骨的密質(zhì)差異、顱腔以及其他鄰近結(jié)構(gòu)在無損傷的情況下觀察大腦的結(jié)構(gòu)和功能；對(duì)大腦損傷或病變部位進(jìn)行精確的定位。

1、顱骨X射線照相術(shù)：以基本的X射線設(shè)備和X射線照像技術(shù)即可獲得顱骨的X射線照片。２、同位素腦掃描(Isotopebrainsc